俞田田 洪麗華 張穎 陸海茜 范建霞

早期妊娠丟失（early pregnancy loss，EPL）是人類生殖中最常見的并發(fā)癥，定義為妊娠12 周末以前發(fā)生的流產(chǎn)[1]。EPL 的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多方面因素。已知的病因包括胚胎染色體異常、母體生殖道解剖學(xué)異常、內(nèi)分泌紊亂、創(chuàng)傷、感染、遺傳學(xué)、免疫功能障礙和父親遺傳異常（父系異常）。此外，環(huán)境危險(xiǎn)因素如咖啡因、酒精、吸煙也影響EPL 的發(fā)病率[1-2]。

miRNA 是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的約為22 個(gè)核苷酸的非編碼內(nèi)源性RNA 分子，通過直接結(jié)合mRNA靶點(diǎn)的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[3-4]。近年來，越來越多的研究表明miRNA 在妊娠過程中發(fā)揮重要作用，并發(fā)現(xiàn)miRNA 在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的異常表達(dá)[5-6]。隨著基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的miRNA 被鑒定出來，它們不僅參與調(diào)節(jié)胚胎著床期上皮細(xì)胞的增殖和分化，還參與調(diào)節(jié)妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化和胎盤發(fā)育[7-9]，miRNA 可通過調(diào)控相應(yīng)的靶基因影響蛻膜血管生成，并進(jìn)一步影響滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附和侵襲蛻膜的過程[10]。筆者團(tuán)隊(duì)前期采用miRNA 芯片篩選EPL 蛻膜組織中的差異表達(dá)miRNA，發(fā)現(xiàn)3 種與血管重塑相關(guān)的miRNA（miR-125a-5p、miR-29c-3p 和miR-193a-5p）在EPL 患者蛻膜組織中表達(dá)上調(diào)[11]。生物信息學(xué)分析表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）是這3 個(gè)miRNA 的靶基因[12]。本研究旨在定量分析EPL 患者蛻膜組織中miRNA 的表達(dá)水平，確定差異表達(dá)的miRNA，并采用qRT-PCR 和Western blot 法驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA 的相關(guān)靶基因，從而揭示miRNA 與導(dǎo)致流產(chǎn)因素之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2020 年10 至12 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院門診手術(shù)室行早孕人工流產(chǎn)手術(shù)的患者40 例為研究對(duì)象，其中因EPL 行人工流產(chǎn)手術(shù)者20 例（EPL 組），正常早孕要求終止妊娠行人工流產(chǎn)者20 例（對(duì)照組）。EPL 組和對(duì)照組納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同已發(fā)表文獻(xiàn)[13]。收集每例患者廢棄的流產(chǎn)蛻膜組織，浸于PBS 中清洗血跡，一部分（EPL 組和對(duì)照組各4 例）放入凍存管中，-80 ℃冰箱保存待蛋白提取；另一部分（EPL 組和對(duì)照組各16 例）放入含有1 mL RNAiso Plus 的凍存管中，-80 ℃冰箱保存待RNA 提取。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過[批準(zhǔn)文號(hào)：（GKLW）2019-20]，所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 RNAiso Plus（日本TaKaRa 公司，貨號(hào)：9109）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本ToYoBo 公司，貨號(hào)：FSQ-101）；哺乳動(dòng)物細(xì)胞miRNA 熒光報(bào)告質(zhì)粒（pMIR-Report Luciferase，美國(guó)Promega 公司）；pRL-TK Renilla 報(bào)告質(zhì)粒（美國(guó)Promega 公司）；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：60004-1-Ig）；鼠抗人MMP-2 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：66366-1-Ig）；兔抗人VEGFA 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：19003-1-AP）；山羊抗鼠IgG（H+L）二抗（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)：C31430100）；山羊抗免IgG（H+L）二抗（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)：C31460100）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司，型號(hào)：LightCycler480 II）。

1.3 細(xì)胞系 原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 型腺病毒DNA得到的永生化細(xì)胞HEK 293 細(xì)胞系由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所王青青教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.4 蛻膜組織中與血管重塑相關(guān)的差異表達(dá)miRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。根據(jù)RNAiso Plus 試劑盒的說明書準(zhǔn)備RNA 樣品。按步驟提取兩組患者蛻膜組織標(biāo)本中RNA，并使用NanoDrop2000 進(jìn)行濃度和純度測(cè)定, 保存于-80 ℃冰箱待用。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，立即放于冰上冷卻待用。所得cDNA 用作定量PCR 的模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。構(gòu)建10 μL 的PCR 反應(yīng)體系。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為miRNA 相對(duì)表達(dá)水平的內(nèi)參，GAPDH 作為靶基因的相對(duì)表達(dá)水平的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。采用的引物由上海生工生物公司合成，miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物見表1，PCR 引物序列見表2。

表1 miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物

1.5 3'-UTR 報(bào)告基因檢測(cè) 通過擴(kuò)增人VEGFA 和MMP-2 mRNA 3'-UTR 并將其克隆到pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體上，構(gòu)建野生型人VEGFA和MMP-2 3'-UTR 熒光素酶報(bào)告載體。用熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、pRL-TK Renilla 報(bào)告質(zhì)粒和miRNA 模擬物（終濃度20 nmol/L）共轉(zhuǎn)染HEK 293 細(xì)胞。生長(zhǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，按照美國(guó)Promega 公司生產(chǎn)商的說明書，以海腎熒光素酶作為參照，檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.6 蛻膜組織VEGFA 和MMP-2 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采用Western blot 法。收集新鮮流產(chǎn)蛻膜組織，以RIPA裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1%蛋白酶抑制劑）充分裂解后設(shè)置勻漿程序進(jìn)行勻漿，提取蛻膜組織總蛋白，冰浴30 min裂解混勻，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清液采用BCA 法蛋白定量，SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，之后轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯膜上（使用前先用甲醇活化5 min），室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入VEGFA、MMP-2 及GAPDH 一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記二抗（1∶5 000 稀釋）搖床室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，使用Image J 軟件計(jì)算各個(gè)蛋白條帶的灰度值，內(nèi)參為GAPDH。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者蛻膜組織中血管重塑相關(guān)的3 個(gè)miRNA 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，EPL 組患者蛻膜組織中miR-29c-3p、miR-193a-5p和miR-125a-5p表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組患者蛻膜組織中miRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 熒光素酶報(bào)告基因分析 筆者先前的研究中，miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示VEGFA 是miR-29c-3p 和miR-125a-5p 的靶基因（圖2A），MMP-2 是miR-29c-3p、miR-125a-5p 和miR-193a-5p 的共同靶基因（圖2B）[12]。為了證實(shí)先前的發(fā)現(xiàn)，將目標(biāo)基因（VEGFA 和MMP-2）的3'-UTR 序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體中。將構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒與miRNA 模擬物共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果表明，miR-29c-3p 和miR-125a-5p 模擬物能顯著抑制VEGFA 3'-UTR 報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，但miR-29c-3p 或miR-125a-5p模擬物不影響空質(zhì)粒，見圖3A。同理miR-29c-3p、miR-125a-5p 和miR-193a-5p 模擬物能顯著抑制MMP-2 3'-UTR 報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，但不影響空質(zhì)粒，見圖3B。

圖2 差異表達(dá)miRNA 與預(yù)測(cè)靶基因VEGFA、MMP-2 的3'-UTR 結(jié)合序列（A：差異表達(dá)miR-29c-3p、miR-125a-5p 與預(yù)測(cè)靶基因VEGFA 的3'-UTR 結(jié)合序列；B：差異表達(dá)miR-29c-3p、miR-125a-5p、miR-193a-5p 與預(yù)測(cè)靶基因MMP-2 的3'-UTR 結(jié)合序列）

圖3 差異表達(dá)miRNA 對(duì)預(yù)測(cè)靶基因VEGFA 和MMP-2 的靶向作用

2.3 兩組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平比較 qRT-PCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，EPL 組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖4。Western blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，EPL 組蛻膜組織中VEGFA和MMP-2 蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），見圖5。

圖4 兩組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 mRNA 表達(dá)水平比較

圖5 兩組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 蛋白表達(dá)水平比較（A：兩組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 蛋白表達(dá)的電泳圖；B：兩組患者蛻膜組織中VEGFA 蛋白表達(dá)水平比較；C：兩組患者蛻膜組織中MMP-2 蛋白表達(dá)水平比較）

3 討論

EPL 是人類生殖過程中最常見的并發(fā)癥，給育齡期女性造成巨大壓力和身心創(chuàng)傷，導(dǎo)致其抑郁、焦慮和自尊心下降等。盡管疾病相關(guān)基因組分析已經(jīng)證實(shí)了在妊娠失敗患者中有大量差異基因的表達(dá)，但自然流產(chǎn)的機(jī)制仍不清楚。蛻膜作為母胎界面“胚胎孕育”的“土壤”，對(duì)胚胎著床、妊娠建立與維持起著極為重要的作用。母體來源的蛻膜細(xì)胞與胚胎來源的滋養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞因子交流對(duì)話、協(xié)調(diào)互作完成母胎界面重塑進(jìn)程，并且蛻膜細(xì)胞的生理活動(dòng)以這種方式在滋養(yǎng)細(xì)胞的調(diào)控下有序地發(fā)育、成熟或凋亡。越來越多的證據(jù)表明，蛻膜血管生成和子宮螺旋動(dòng)脈重塑對(duì)成功妊娠至關(guān)重要，早期血管生成過程中蛻膜血管發(fā)育受損以及子宮肌層螺旋動(dòng)脈重塑異常導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[14-15]。

VEGF 是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管通透性的增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖以及血管再生[16]。在嚙齒類動(dòng)物中，VEGFA 是參與胎兒和胎盤血管生成、胚胎著床和發(fā)育以及蛻膜化的關(guān)鍵因子[17]。有研究表明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中縫隙連接蛋白和VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯低于正常早孕妊娠婦女，表明兩者表達(dá)的降低可能通過影響胎盤和胚胎的血管生成而促進(jìn)流產(chǎn)的發(fā)生[18]。并且近期研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號(hào)通路及其下游基因如D 型細(xì)胞周期蛋白和VEGF 的降低導(dǎo)致絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖不足，并伴隨胎盤和蛻膜的血管生成缺陷，導(dǎo)致早期不明原因的妊娠丟失[19]。MMP-2 是MMP 家族的一員。母胎界面MMP 活性的調(diào)節(jié)似乎對(duì)成功著床和胎盤形成至關(guān)重要[20]。多項(xiàng)研究表明，滋養(yǎng)層侵入需要MMP-2 和MMP-9 的合成和活化[21-22]。特別是MMP-2 與滋養(yǎng)層侵入細(xì)胞外基質(zhì)的重塑過程有關(guān)[23]。在整個(gè)妊娠期間，MMP-2 在蛻膜組織中穩(wěn)定表達(dá)，在子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎侵襲和血管生成中起重要作用[24-25]。近期有研究表明在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中，miR-125a-5p 的表達(dá)上調(diào)可能抑制其靶基因MMP-2的正常表達(dá)，從而導(dǎo)致胚胎黏附和植入能力下降、胚胎侵入子宮蛻膜能力受損，導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[26]。

本研究進(jìn)行了qRT-PCR，證實(shí)與血管重塑相關(guān)的miR-29c-3p、miR-193a-5p 和miR-125a-5p 在EPL 患者蛻膜組織中表達(dá)上調(diào)。差異表達(dá)miR-29c-3p、miR-193a-5p 和miR-125a-5p 靶向VEGFA 和MMP-2。qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，EPL 組患者蛻膜組織中VEGFA 和MMP-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，提示上調(diào)的miRNA 可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑下調(diào)VEGFA 和MMP-2 的表達(dá)，使兩個(gè)在血管生成和胎盤形成過程中的重要蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜蛻膜化不良、胚胎淺著床、胎盤血管形成受阻，最終導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。此外，熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)了miRNA 表達(dá)水平（miR-29c-3p、miR-125a-5p 和miR-193a-5p）與其靶基因（VEGFA 和MMP-2）之間的負(fù)相關(guān)性。這些差異表達(dá)的miRNA 與其靶基因密切相關(guān)，通過下調(diào)靶基因VEGFA 和MMP-2 參與調(diào)控早孕蛻膜組織的功能，在EPL 的發(fā)生中起著重要作用。

綜上所述，在早期妊娠蛻膜組織中，與血管重塑相關(guān)的3 個(gè)差異表達(dá)miRNA（miR-29c-3p、miR-125a-5p、miR-193a-5p）可能通過下調(diào)靶基因VEGFA 和MMP-2參與EPL 的發(fā)生、發(fā)展。本研究主要探討miRNA 與早期妊娠維持及自然流產(chǎn)的潛在關(guān)系，而這3 種miRNA參與EPL的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。