陳華葉 胡俊杰

珠蛋白生成障礙性貧血（以下簡稱地貧）是全球分布范圍最廣、累積人群最多的一種單基因隱性遺傳病，據(jù)報道全球已檢測出地貧缺失和突變類型超過350 種，我國境內(nèi)也檢測出超過90種［1-3］。基因檢測技術(shù)是實現(xiàn)地貧精準檢測的金標準，國內(nèi)常用的地貧基因檢測試劑盒一般僅針對中國人群中常見的23 種地貧基因型進行檢測，而罕見地貧基因攜帶者一般表現(xiàn)正?；蚓哂胁煌潭鹊呢氀劝Y狀，在臨床檢測中較難發(fā)現(xiàn)。本文將介紹目前罕見地貧基因檢測的常用方法，并對相關(guān)罕見型地貧的分析檢測進行經(jīng)驗總結(jié)，以期為地貧高發(fā)地區(qū)的臨床檢測工作提供參考依據(jù)。

1 罕見地貧基因常用檢測技術(shù)

目前報道中常用的幾種檢測技術(shù)包括：基因測序技術(shù)、跨越斷裂點法（gap polymerase chain reaction，Gap-PCR）、多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等。

1.1 基因測序技術(shù)

1.2 Gap-PCR 法

Gap-PCR 法是一種操作簡單且對設備要求低的檢測方法，使用時根據(jù)不同罕見缺失型地貧基因特點，在其缺失片段兩端設計一對特異性引物，若發(fā)生該片段缺失，則兩端引物相互靠近形成有效擴增。經(jīng)PCR 擴增后可形成特定大小的核酸片段，再通過瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳片段大小來判斷對應的基因型。Gap-PCR 法可以對--THAL、HKαα、中國型Gγ+（Aγδβ）0 和SEA-HPFH 在內(nèi)的多種缺失型地貧進行檢測，實驗條件一般的實驗室也可開展，但需要人工進行結(jié)果判讀，因此要求檢測者具有專業(yè)的判斷能力。

1.3 MLPA 技術(shù)

MLPA 技術(shù)是一種多重PCR 分析法，可以檢測罕見缺失型α 和β 地貧基因。該法檢測過程中單次反應可利用多達40 個探針來評估每個DNA序列的相對拷貝數(shù)。每個探針對不同的DNA 序列具有特異性（針對目的基因的外顯子序列），主要由兩個半探針（5′和3′半探針）組成，并包含靶標特異性序列和通用引物序列。反應時兩個半探針能夠識別連續(xù)的靶標特異性序列，并且只有在完全匹配且沒有單個缺口的情況下，雜交后才能將兩個半探針連接并擴增。此外一個或兩個半探針包含填充序列，該填充序列用于在電泳過程中區(qū)分探針自身的長度，分辨擴增產(chǎn)物的大小。MLPA 反應的關(guān)鍵點是PCR 不會擴增靶序列，但會擴增連接的探針，通過對擴增產(chǎn)物的分析，從而得出目的片段異常的結(jié)果［8］。

2 罕見地貧的表現(xiàn)型分析和檢測

2.1 一般罕見缺失型地貧

2.1.1 泰國型α 地貧

泰國型α 地貧（--THAI）是東南亞地區(qū)，也是我國南方地區(qū)發(fā)現(xiàn)較多的α 珠蛋白基因大片段缺失型（缺失的長度約為33.45 kb，涉及兩個α-珠蛋白基因以及ζ2 基因）地貧［9-10］。分子機制上受α-珠蛋白大片段缺失的影響，泰國型α 地貧在臨床上具有和東南亞型α 地貧相似的表現(xiàn)型，易形成中重型α 地貧。若復合-α3.7 或-α4.2 片段缺失，則產(chǎn)生類似HbH 病表型，若復合東南亞缺失型（--SEA），則可導致水腫胎的發(fā)生［11-12］。杜麗等［13］對三個疑似有罕見缺失型地貧或水腫胎生育史的家庭進行家系分析以及產(chǎn)前診斷，成功檢測出三個家庭中泰國缺失型α 地貧攜帶者以及確診其中兩組家庭胎兒基因型為--THAI/αα，表明泰國缺失型α 地中海貧血的準確檢測對于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷具有重要的意義。

疑似--THAI 型主要表現(xiàn)：生育過Bart’S 水腫胎的夫婦，常規(guī)α 地貧基因檢測顯示基因型正常的一方；或生育過類似HbH 病表型的患兒，常規(guī)α 地貧基因檢測顯示一方攜帶-α3.7 或-α4.2 片段缺失，另外一方基因型正常。上述情況首選Gap-PCR 法進行檢測，若結(jié)果均排除泰國型α 地貧，則使用MLPA進一步檢測是否存在其他罕見缺失型α 地貧。

2.1.2 香港型α 地貧

香港型α 地貧（HKαα）由Wang 等［14］于2005年發(fā)現(xiàn)并鑒定，其發(fā)生機制主要涉及α 珠蛋白等位基因的罕見重排，形成包含-a3.7 又包含αααanti-4.2 的交叉連接。當-a3.7 和αααanti-4.2 片段位于同一條染色體上時即形成HKαα，而位于兩個染色體上時，則形成-a3.7/αααanti-4.2。由于常規(guī)地貧基因檢測中僅檢測--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失，因此HKαα 和-a3.7/αααanti-4.2 可能均被誤診為-a3.7/αα。香港型α 地貧在我國華南地區(qū)檢出較多，有研究報道廣東地區(qū)人群檢測出-α3.7 陽性樣本中HKαα 發(fā)生率達2.27%，福建和廣西等地檢測出HKαα 等位基因發(fā)生率分別為 0.33% 和0.07%［15-17］。一般HKαα 的臨床癥狀表現(xiàn)較輕，但HKαα/--SEA 在臨床檢測上常被誤診為HbH 病，因此需要與-α3.7/αα 進行鑒別診斷，避免導致錯誤的產(chǎn)前診斷結(jié)論和遺傳咨詢建議。

疑似HKαα 型主要表現(xiàn)：常規(guī)地貧基因檢測中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一般顯示“正常帶+3.7 帶”兩條帶，其中3.7 條帶較弱；或顯示“正常帶+3.7帶+SEA 帶”三條帶，可設計特異性引物并采用Gap-PCR 法進行驗證。

2.1.3 中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧

(2) 設置4個處理：0(CK)、100 μmol/ L 褪黑素(MT)、280 μmol/L硝基苯酚(NP)、280 μmol/ L 硝基苯酚 + 100 μmol/L褪黑素(NP + MT)。不同實驗組各處理6株水稻幼苗，分別處理5 d后測定水稻幼苗生理指標。褪黑素濃度基于預實驗確定，處理前用無水乙醇助溶MT或NP(對照組加等量無水乙醇)，然后加蒸餾水配制成實驗所需濃度。

中國人群中最普遍的β 珠蛋白基因簇缺失主要包括中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧（SEA-HPFH）［18］。中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧的β 珠蛋白基因的缺失范圍約為78.9 kb，包括部分Aγ 球蛋白基因，所有δ 和β 球蛋白基因以及在β 球蛋白基因下游很遠的具有調(diào)控功能的DNA 序列［19］。中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧攜帶者一般臨床癥狀較輕，血液學檢查呈小細胞低色素性貧血表型，并伴有A γ、G γ 珠蛋白基因的高表達以及HbF 異常升高等特征。國內(nèi)報道中如韋媛等［20］研究得出廣西地區(qū)中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧攜帶率為0.07%，陳劍虹等［21］報道廣東惠州地區(qū)中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧攜帶率為0.14%。由于中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧雜合子攜帶者與其他類型β 地貧攜帶者結(jié)合時可能會生出中重型地貧患兒，因此有必要對高風險家庭進行產(chǎn)前診斷。

東南亞缺失型HPFH 地貧中β 珠蛋白的缺失長度約為27 kb，范圍包括β 珠蛋白基因簇的β 基因及其3-HS-1 區(qū)域［22］。有研究將SEA-HPFH 地貧和中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧進行比較，結(jié)果顯示兩者MCV、MCH、HbA2 和HbF 的表達水平均存在顯著差異［23］。前者的相關(guān)血液學參數(shù)處于正常范圍或臨界水平，相對于后者表現(xiàn)出更輕的臨床癥狀，但HbF 具有更高的表達水平。此外SEA-HPFH合并其他β 地貧基因時，臨床主要表現(xiàn)為輕度或中度貧血，與中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧有所區(qū)別［24］。盡管如此，血液學的差異仍不足以明確區(qū)分SEA-HPFH 地貧和中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧，需要通過基因檢測進行鑒別。所以對于中國南方地貧高發(fā)地區(qū)人群，若發(fā)現(xiàn)HbF 水平明顯增高的病例，在進行常見地貧基因檢測外，有必要進行SEA-HPFH地貧和中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧基因檢測。

疑似Gγ+（Aγδβ）0 型和SEA-HPFH 型主要表現(xiàn)：血細胞分析為小細胞低色素貧血，血紅蛋白電泳結(jié)果顯示HbF 異常增高，但常規(guī)β 地貧基因檢測結(jié)果顯示為正常型；或生育過β 重型地貧患兒，常規(guī)β 地貧基因檢測顯示基因型正常的一方。首選Gap-PCR 法進行檢測，若檢測結(jié)果均排除中國型Gγ+（Aγδβ）0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧，則使用MLPA 進一步檢測是否存在其他罕見缺失型β 地貧。

2.2 其它罕見型地貧

2.2.1 融合基因型

融合基因型產(chǎn)生于珠蛋白基因重組，即同源序列發(fā)生非交叉互換，致使珠蛋白基因結(jié)構(gòu)序列增加呈多樣性改變。珠蛋白基因結(jié)構(gòu)中ζ2-珠蛋白和ψζ1-珠蛋白基因之間以及α1 珠蛋白和α2 珠蛋白基因之間同源性序列較多，兩個ζ-和兩個α基因之間易發(fā)生同源重組，進而產(chǎn)生融合基因突變［25］。例如Huang 等［26-27］發(fā)現(xiàn)的一例地貧融合基因患者（湖南地區(qū)）經(jīng)鑒定是由α 珠蛋白基因的α2段與Ψα1 段序列發(fā)生融合所致，合并--SEA 缺失時產(chǎn)生類似HbH 病的癥狀，相似病例在海南地區(qū)也有報道。

疑似融合基因型主要表現(xiàn)：攜帶者一般表現(xiàn)為靜止型地貧癥狀，血細胞分析可呈現(xiàn)小細胞低色素性貧血。當合并--SEA 缺失時可能產(chǎn)生類似HbH 病的癥狀（嚴重時需要輸血治療），但常規(guī)地貧基因檢測結(jié)果為標準型地貧，可用Sanger 測序法進行序列分析。

2.2.2 珠蛋白基因突變或缺失型

隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和推廣使用，越來越多的珠蛋白基因突變或缺失被檢測并鑒定，例如楊敏和陳揚等［28-29］采用高通量測序技術(shù)在湖南和海南地區(qū)檢測出多種罕見地貧基因型。與融合基因產(chǎn)生機制不同，珠蛋白基因突變或缺失可發(fā)生在珠蛋白基因組上任何區(qū)域，編碼區(qū)或非編碼區(qū)的基因突變通常會導致不同的致病效果。除遺傳因素影響外，珠蛋白基因還有自發(fā)突變的可能，導致表型正常的父母，其后代因基因突變表現(xiàn)出中重型地貧，因此對罕見地貧家系研究需要更加全面。

疑似珠蛋白基因突變或缺失型主要表現(xiàn)：①排除缺鐵性貧血，血細胞分析為小細胞低色素貧血，血紅蛋白電泳結(jié)果顯示HbA2＜2.5 或HbA2＞3.5，但常規(guī)地貧基因檢測結(jié)果顯示為正常型；②常規(guī)地貧基因檢測結(jié)果為輕型或標準型地貧，但實際具有中間型或重型地貧表型，伴有嚴重貧血或需要輸血治療；③常規(guī)地貧基因檢測顯示父母基因型正?；蛞环秸?，但生育出臨床表型為中間型或重型地貧患兒（排除非親緣因素影響）；④血細胞分析正?；虍惓?，血紅蛋白電泳出現(xiàn)異常條帶，但常規(guī)地貧基因檢測顯示為正?；蜉p型地貧。上述情況使用Sanger 測序進行珠蛋白測序分析以鑒定患者最終基因型。

3 小結(jié)與展望

罕見地貧分析對患者現(xiàn)階段的治療和產(chǎn)前診斷都具有重要意義，在臨床診治和實驗室檢測過程中，為防止罕見地貧的漏診和誤診，務必要結(jié)合具體臨床表型及生育史進行綜合分析。收集患者相應的臨床表型資料如常規(guī)地貧基因檢測、血細胞分析、血紅蛋白電泳、血清鐵檢測、鐵蛋白檢測時，若發(fā)現(xiàn)基因型和臨床表型不相符等情況，應高度懷疑其攜帶罕見地貧基因，并根據(jù)其表型特點選擇合適的檢測方法以提高罕見地貧基因的檢出效率。在未來工作中，地貧高發(fā)地區(qū)根據(jù)本地實際情況，可增加地貧基因突變檢測類型，有條件的可以為受檢者一次性提供α 和β 地貧基因的高通量測序檢測。同時盡可能建立以高通量測序技術(shù)為主導的地貧檢測模式，這對充分發(fā)掘地貧遺傳資源并促進全面地貧防控具有重要作用。