陳林勇 ， 劉建民 ， 崔宇翔 ， 任恒星 ， 趙 晗 ， 趙 娜 ， 宋燕莉 ， 關(guān)嘉棟 ， 牛江露 ，李國富 ， 王保玉 ， 何 環(huán)

(1.河南理工大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院, 河南 焦作 454000；2.煤與煤層氣共采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 晉城 048000；3.易安藍(lán)焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司, 山西 晉城 048000；4.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院, 江蘇 徐州 221116；5.中國礦業(yè)大學(xué) 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇徐州 221116)

自20 世紀(jì)80 年代COHEN 等[1]發(fā)現(xiàn)微生物可將褐煤降解為黑色液滴以來，微生物溶煤作為煤的清潔高效利用的技術(shù)手段之一引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，基于微生物溶煤的地下煤炭原位生物開采技術(shù)被認(rèn)為是煤炭化學(xué)開采關(guān)鍵技術(shù)之一[2]。經(jīng)過近40 a的發(fā)展，已經(jīng)有上百種與煤降解相關(guān)的微生物被分離出來，研究涵蓋了褐煤[3]、亞煙煤[4]、硬煤[5]、風(fēng)化煤[6]等各種煤，降解的機(jī)理可概括為堿性物質(zhì)[7]、生物氧化酶[8-9]、螯合劑[10]、表面活性劑[11]、酯酶[12]作用。煤的生物降解液可被酸沉淀，沉淀的主要成分為腐植酸(HA)[4,13]。腐植酸的產(chǎn)率通常有3 種計(jì)算方法：第1種是通過實(shí)驗(yàn)前后煤的質(zhì)量差來計(jì)算[14-15]，當(dāng)煤因顆粒較小或被菌絲包裹等原因不易收集時(shí)該方法引起的誤差較大；第2 種方式是通過降解液的酸沉淀產(chǎn)物即腐植酸的質(zhì)量來衡量[16]；第3 種途徑是以降解液在450 nm 處的吸光度來表征[17]，相對于前2 種方法，測量吸光度僅需少量發(fā)酵液，因此更適用于實(shí)驗(yàn)過程的監(jiān)測，用于反映實(shí)驗(yàn)所處的階段。

微生物與煤的作用方式可分為單一菌降解、真菌細(xì)菌聯(lián)合培養(yǎng)和菌群發(fā)酵[18]。然而對于真菌細(xì)菌聯(lián)合培養(yǎng)對煤的降解作用尚無定論。盧麗麗[12]的研究表明混合菌種對煤的降解率大于單一菌種對煤的降解率，王龍貴等[19]、張明旭等[20-21]的研究具有類似的結(jié)論。李非楊[16]的研究則顯示相對單一菌種來說，混合菌對預(yù)處理風(fēng)化煤的液化并未達(dá)到很好的效果。MAKA 等[22]報(bào)道了一種真菌細(xì)菌組合對煤的降解作用，但未做混菌與純菌的對比。

武俐等[23]發(fā)現(xiàn)As、Ba、Co、Ni 和Pb 等微量元素在煤生物氣化過程中從煤中轉(zhuǎn)移到了降解液，導(dǎo)致降解液微量元素的質(zhì)量濃度升高。接種嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobaillus ferroxridans)的煤矸石，其錳鉻等金屬元素的釋放明顯增加[24]。這些研究表明在煤的微生物降解過程中金屬元素會(huì)發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化，而目前對煤的好氧降解過程中金屬元素在煤與降解液之間的轉(zhuǎn)移研究較少。

筆者利用從腐木中分離得到的一株真菌和一株細(xì)菌開展了聯(lián)合降解義馬煤研究，對降解液及其酸沉淀產(chǎn)物腐植酸進(jìn)行了分析，為深入分析煤的真菌細(xì)菌聯(lián)合降解過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 煤樣與菌源

(1)硝酸氧化煤。河南義馬煤，破碎篩分至80～120 目(0.125～0.200 mm)，80 ℃烘干48 h。在500 mL 燒杯中加入煤樣100 g、7.6 mol/L 硝酸150 mL，反應(yīng)過程中將燒杯放入室溫水中避免反應(yīng)物溢出，同時(shí)不斷攪拌至黃煙消失后靜置反應(yīng)24 h，用純水清洗煤至上清液pH > 6 后將煤樣在80 ℃下烘干72 h 備用。

(2)菌源。實(shí)驗(yàn)室分離的真菌雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)，簡稱F11；細(xì)菌芽孢桿菌(Bacillussp.)，簡稱B1。

1.2 培養(yǎng)基

(1) PDA 培養(yǎng)基。市售PDB(環(huán)凱生物)培養(yǎng)基干粉24 g、瓊脂粉25 g、純水定容至1 L。

(2) LB 培養(yǎng)基。蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、純水定容至1 L。LB 固體培養(yǎng)基另加入瓊脂粉12 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 真菌細(xì)菌混合物聯(lián)合降解

用接種環(huán)從保存的F11 斜面上刮取適量菌絲轉(zhuǎn)入含有5 mL 無菌水的離心管中，充分震蕩離心管使菌液均勻，取200 μL 菌液滴加于PDA 培養(yǎng)基，用涂布棒均勻涂布，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d，菌絲鋪滿平板。

用接種環(huán)從保存的B1 斜面上蘸取少量菌體轉(zhuǎn)入含有5 mL 無菌水的離心管中，充分震蕩離心管使菌液均勻，取200 μL 菌液滴加于LB 固體培養(yǎng)基，用涂布棒均勻涂布，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2 d，菌落鋪滿平板。

在250 mL 三角瓶中加入150 mL LB 培養(yǎng)基，濕熱滅菌后，用打孔器分別接入4 孔真菌(4F)、3 孔真菌+1 孔細(xì)菌(3F1B)、2 孔真菌+2 孔細(xì)菌(2F2B)、1 孔真菌+3 孔細(xì)菌(1F3B)、4 孔細(xì)菌(4B)、50 孔真菌+1孔細(xì)菌(50F1B)，放入恒溫振蕩器在30 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d，加入2 g 滅菌的硝酸氧化煤振蕩均勻，靜置4 h 后取上清液測pH、吸光度A450作為第0 天的數(shù)據(jù)。放入恒溫振蕩器在30 ℃、150 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每4 d 取降解液測pH、吸光度A450(尤尼柯，UV-4802)。對照組(CK)的培養(yǎng)基中不接種。每組實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行樣。

1.3.2 降解液中金屬元素質(zhì)量濃度測定

待A450穩(wěn)定后(A450為降解液在450 nm 處的吸光度)，將降解液在10 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，按照HJ 700—2014《水質(zhì) 65 種元素的測定 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》測上清液中Cr、As、Mn、Pb、Co、Ni、Cu、Zn、Mo 的質(zhì)量濃度。

1.3.3 腐植酸收集與分析

待A450穩(wěn)定后，將降解液在10 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，用鹽酸將上清液pH 調(diào)至2 以下[15]，靜置沉淀24 h，10 000 r/min 下離心10 min，收集沉淀(腐植酸)，在80 ℃下烘干48 h 后稱重，根據(jù)腐植酸的質(zhì)量計(jì)算產(chǎn)率。

腐植酸產(chǎn)率計(jì)算公式為

式中，ηi為實(shí)驗(yàn)組i的 腐植酸產(chǎn)率，i取1F3B、2F2B、3F1B、50F1B、4B、4F；Mi為實(shí)驗(yàn)組i的腐植酸質(zhì)量，g；MCK為對照組CK 的腐植酸質(zhì)量，g；M0為實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)時(shí)加煤的質(zhì)量，g。

取烘干后的腐植酸1 g 加入5 mL 甲醇， 50 ℃浸泡萃取72 h[25]。萃取完成后，將上清液用氮吹儀在45 ℃濃縮至1 mL，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 7890A-5795C)進(jìn)行組分分析。色譜柱采用Agilent VFWAXms(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純度的氦氣，進(jìn)樣量0.8 μL，柱流速1.0 mL/min，柱子初始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，保持20 min。分析完成后用NIST08 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行有機(jī)物鑒定。

采用島津IRAffinity-1S 對腐植酸進(jìn)行紅外光譜掃描，樣品與溴化鉀質(zhì)量比為1∶200，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描24 次，分辨率0.5 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物元素分析

研究表明，煤的硝酸氧化反應(yīng)可以將煤中的脂肪結(jié)構(gòu)、酚羥基和醌結(jié)構(gòu)氧化破裂生成腐植酸、草酸和小分子脂肪酸[26]，煤的微生物好氧降解產(chǎn)物是腐殖酸[27]。因此經(jīng)過鹽酸沉淀后對照組的產(chǎn)物是化學(xué)提取的腐植酸(chemically extracted humic acid, cHA)，實(shí)驗(yàn)組是生物提取的腐植酸(bio-extracted humic acid,bHA)。由表1 可知，原煤經(jīng)過硝酸氧化后氮、氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，這是因?yàn)槊合跛嵫趸磻?yīng)過程中存在著硝化反應(yīng)[26]。DONG 等[28]的研究說明褐煤好氧降解過程中腐植酸(bHA)結(jié)合了培養(yǎng)基中的氮，VERHEYEN 等[29]研究發(fā)現(xiàn)原煤氧化過程中40%的氫生成了脂肪化合物，其中乙酸、丁二酸和丙二酸是主要產(chǎn)物。本文所用LB 培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母粉都是富含氮元素的試劑，由表1 可知氮、氫質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出bHA >cHA > 氧化煤的趨勢，說明bHA 和cHA 均可結(jié)合培養(yǎng)基中的氮且在微生物的作用下bHA 結(jié)合氮能力大于cHA，腐植酸生成的過程中還富集了煤中的氫元素，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[30-31]一致。

表1 樣品元素分析Table 1 Ultimate analysis of samples %

2.2 降解機(jī)理分析

以實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的吸光度及腐植酸質(zhì)量作圖，結(jié)果如圖1 所示，2 組數(shù)據(jù)變化趨勢一致。經(jīng)相關(guān)性分析可知其相關(guān)系數(shù)為0.998，說明2 者間存在強(qiáng)相關(guān)性。將吸光度與產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行線性擬合，如圖2 所示，判定系數(shù)R2=0.997，說明吸光度可以指示煤的降解程度[32]。

圖1 不同組降解液吸光度與腐植酸質(zhì)量變化趨勢Fig.1 Trend of absorbance of degradation solution and humic acid quality in different groups

圖2 不同組降解液吸光度與腐植酸質(zhì)量擬合Fig.2 Fitting of absorbance of degradation solution and humic acid quality in different groups

實(shí)驗(yàn)組(1F3B、2F2B、3F1B、50F1B、4B、4F)及對照組(CK)的產(chǎn)物質(zhì)量分別為1.23、1.38、1.34、1.31、1.25、1.20、0.03 g，根據(jù)式(1)計(jì)算得混合菌(1F3B、2F2B、3F1B、50F1B)降解的產(chǎn)物產(chǎn)率分別為60.00%、67.17%、65.17%、63.67%，真菌(4F)、細(xì)菌(4B)分別為58.17%、61.00%，降解率整體上呈現(xiàn)出混合菌大于純菌、細(xì)菌大于真菌的規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)過程中各組的pH 變化規(guī)律如圖3 所示，對照組(CK)的pH 從5.33 緩慢降低到4.46 后穩(wěn)定，與文獻(xiàn)報(bào)道的現(xiàn)象一致[31,33]，而實(shí)驗(yàn)組的pH 從第4 天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束在7.86～8.72 的堿性范圍內(nèi)波動(dòng)，說明真菌、細(xì)菌及其混合物在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生了堿性物質(zhì)。純菌作用下的pH 始終略低于混合菌，結(jié)合吸光度變化規(guī)律(圖4)可知相應(yīng)的混合菌的降解率高于純菌，說明真菌細(xì)菌聯(lián)合降解煤時(shí)具有相互促進(jìn)的作用，混合菌產(chǎn)生的堿性物質(zhì)比純菌多，堿性物質(zhì)在煤降解過程中發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)時(shí)，真菌實(shí)驗(yàn)組的pH 與其他實(shí)驗(yàn)組相差約1，而吸光度則約為其他實(shí)驗(yàn)組的1/3，也說明了堿性物質(zhì)對煤降解產(chǎn)生了重要影響。

圖3 不同組降解液pH 變化趨勢Fig.3 Trend of pH in different degradation solutions

圖4 不同組降解液吸光度變化趨勢Fig.4 Trend of absorbance in different degradation solutions

2.3 降解液金屬元素變化規(guī)律

如圖5 所示，Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Mo、Pb 等9 種金屬元素在對照組(CK)中均檢出，說明即使無微生物的降解作用也會(huì)有一定量的金屬元素從煤中遷移到降解液中，這是因?yàn)閺?qiáng)酸氧化處理過的煤即使無生物或化學(xué)試劑的作用也可在水中部分溶解[34]。

圖5 降解液中金屬元素質(zhì)量濃度分布Fig.5 Distribution of metal element content in degradation solution

Cr、Co、Ni、Cu、Zn、As、Mo、Pb 等8 種金屬元素在實(shí)驗(yàn)組降解液中質(zhì)量濃度高于對照組(CK)，說明真菌、細(xì)菌及其混合物在降解煤的同時(shí)具有促進(jìn)金屬元素從煤中向降解液中遷移的作用，這與武俐等[23]在煤的生物氣化過程中發(fā)現(xiàn)的As、Ba、Co、Ni 和Pb 等金屬元素元素從煤中轉(zhuǎn)移到了降解液的現(xiàn)象類似。

將金屬元素質(zhì)量濃度與吸光度進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖6 和表2 所示，Cr、As、Pb、Ni、Cu、Mo 等6種金屬元素與A450擬合的判定系數(shù)(R2)大于0.6 且模型檢驗(yàn)結(jié)果為顯著，即Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 與A450正相關(guān)，也即煤降解液中的金屬元素Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 質(zhì)量濃度越高，相應(yīng)的煤降解率也越高。

圖6 金屬元素質(zhì)量濃度與吸光度擬合Fig.6 Fitting of metal element content and absorbance

表2 金屬元素與吸光度擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of metal elements and absorbance

如圖6(d)所示，Mn 元素在對照組(CK)中質(zhì)量濃度高于細(xì)菌實(shí)驗(yàn)組(4B)，與吸光度間無顯著的相關(guān)關(guān)系。對照組中含有錳元素說明煤中含有該元素。一方面由上文分析可知細(xì)菌(4B)實(shí)驗(yàn)組的煤發(fā)生了降解，因此煤中的Mn 元素會(huì)轉(zhuǎn)移至降解液中導(dǎo)致Mn元素質(zhì)量濃度升高。另一方面，微生物分離過程中發(fā)現(xiàn)真菌F11 和細(xì)菌B1 均可使苯胺藍(lán)平板褪色而苯胺藍(lán)可以指示錳過氧化物酶的存在，說明兩株菌均可產(chǎn)生錳過氧化物酶。研究表明錳過氧化物酶的反應(yīng)需要Mn 的參與[35-36]，因此降解液中的錳因參與反應(yīng)而導(dǎo)致質(zhì)量濃度降低。綜上所述，在煤的降解過程中Mn 元素存在著釋放與利用平衡?；旌暇鷮?shí)驗(yàn)組的Mn 元素質(zhì)量濃度高于對照組(CK)且與之存在顯著差異(P< 0.05)，說明真菌與細(xì)菌混合具有協(xié)同作用，錳元素的釋放大于利用，因此在降解液中的質(zhì)量濃度升高，這與pH 分析的結(jié)果一致。Co、Zn 的質(zhì)量濃度與吸光度間無顯著的相關(guān)關(guān)系，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

2.4 腐植酸甲醇萃取物GCMS 分析

由圖7 及表3 可知，2、3、9、11、13、14、18、19號峰為對照組及實(shí)驗(yàn)組共有的峰，對應(yīng)的化合物為乙二酸、十六烷酸、十八烷酸、吡咯、4 種吡咯衍生物。

圖7 不同組腐植酸甲醇萃取物GCMSFig.7 GCMS of methanol extracts of humic acid in different groups

表3 腐植酸甲醇萃取物GCMS 定性結(jié)果Table 3 GCMS qualitative results of methanol extracts of humic acid

由對照組、4F、4B 組的色譜圖(圖7)可知，7、17號峰僅出現(xiàn)在4F 實(shí)驗(yàn)組，因此對應(yīng)的化合物十八甲基環(huán)九硅氧烷、順-13-二十二碳烯酸為真菌特征性產(chǎn)物。1、6、16 號峰僅出現(xiàn)在4B 實(shí)驗(yàn)組，對應(yīng)的N-乙基吡咯、苯乙酸、4-羥基苯乙酸為細(xì)菌的特征性產(chǎn)物。結(jié)合混合菌實(shí)驗(yàn)組的色譜圖可知，細(xì)菌的特征性產(chǎn)物在混合菌實(shí)驗(yàn)組中檢出而真菌的特征性產(chǎn)物則未檢出，說明混合后細(xì)菌占主導(dǎo)作用。由圖3 可以看出，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)尤其是第4 天之前混合菌降解液的pH 始終與細(xì)菌降解液接近，也從側(cè)面說明混合后細(xì)菌占主導(dǎo)作用。

4、5、8、10、12 號峰在對照組未檢出，其中4、5號峰定性為丁二酸，8、10 號峰為長鏈脂肪酸(C13、C14、C15)、揮發(fā)性脂肪酸(C3、C4、C5)，12 號峰為2種吡咯衍生物。與對照組的cHA 相比，除了共有的十六烷酸(C16)、十八烷酸(C18)、4 種吡咯衍生物之外，實(shí)驗(yàn)組的bHA 中含有更多脂肪鏈較短、分子量較小的脂肪酸和種類更豐富的吡咯衍生物。GHANI M J等[13]的研究表明相對于cHA，bHA 的分子量和芳香性降低，與本文的研究結(jié)果類似。

15 號峰在實(shí)驗(yàn)組及對照組均可定性為芳香族化合物，在對照組為含氧稠雜環(huán)化合物，在實(shí)驗(yàn)組中為含氮稠雜環(huán)化合物或有含氮官能團(tuán)的化合物，說明bHA 的含氮化合物更多，與元素分析的結(jié)果一致。

2.5 腐植酸紅外光譜分析

如圖8 所示，各組產(chǎn)物的紅外光譜圖相似，3 500～2 000 cm-1有一個(gè)彌散的強(qiáng)吸收譜帶，對應(yīng)羧基COOH 的O—H 和NH+伸縮振動(dòng)[37]。2 362 cm-1處為羧基的氫鍵締合伸縮振動(dòng)[38-39]。1 720、1 666 cm-1處為羰基C=O 的伸縮振動(dòng)[37,40-41]。1 543、1 407 cm-1處苯環(huán)骨架振動(dòng)[37]。說明腐植酸大分子的基本結(jié)構(gòu)含有芳香環(huán)并富含羧基、羥基、羰基等活性官能團(tuán)。如前文所述，實(shí)驗(yàn)組含有更多的含氮稠雜環(huán)化合物或含氮官能團(tuán)，其中吡咯、呋喃和噻吩的結(jié)構(gòu)是與苯環(huán)類似封閉的芳香共軛體系[42]。雜環(huán)的骨架吸收峰與苯環(huán)相似[43]，因此在1 407 cm-1處吸收峰比對照組強(qiáng)。

圖8 不同組腐植酸紅外光譜Fig.8 FTIR of humic acid in different groups

3 結(jié) 論

(1)雅致小克銀漢霉(C.elegans)和芽孢桿菌(Bacillussp.)均可通過堿性物質(zhì)作用機(jī)理實(shí)現(xiàn)硝酸氧化煤的降解，腐植酸產(chǎn)率分別為58.17%、61.00%。兩株菌混合具有協(xié)同作用，腐植酸產(chǎn)率可提高到67.17%。

(2)芽孢桿菌(Bacillussp.)的特征性產(chǎn)物在混合菌實(shí)驗(yàn)組中檢出而雅致小克銀漢霉(C.elegans)的特征性產(chǎn)物則未檢出，混合菌降解液的pH 始終與芽孢桿菌(Bacillussp.)降解液接近，說明混合后芽孢桿菌(Bacillussp.)占主導(dǎo)作用。

(3)在煤的生物降解過程中Cr、As、Mn、Pb、Co、Ni、Cu、Zn、Mo 等9 種金屬元素從煤遷移到了降解液中，其中Cr、Ni、Cu、As、Mo、Pb 等6 種與吸光度A450具有顯著的正相關(guān)性，可以表征煤降解率的相對大小。Mn 在煤的生物降解過程中存在釋放與利用平衡。

(4) cHA 與bHA 均富含羧基、羥基、羰基等活性官能團(tuán)、含有長鏈脂肪酸、4 種吡咯衍生物。同時(shí)，bHA 還含有分子量較小的脂肪酸(C3、C4、C5、C13、C14、C15)及含氮化合物，bHA 結(jié)合氮、富集氫的能力大于cHA。