李利華,王巍,張一美,趙夢輝,鞠成國,2

(1．遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧 大連 116600;2．國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術傳承基地<遼寧>,遼寧 大連 116600)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2],亦稱腐腸、妒婦、苦督郵、枯黃芩、子芩、條黃芩[3]。黃芩氣平,性寒,味苦,無毒。歸肺、脾、大腸經(jīng)[4],大量的研究指出,黃芩的主要功效包括:抗菌、抗炎、抗病毒、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤,護肝和神經(jīng)保護等[5-8]。大量的藥理研究表明,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮及其苷類化學成分為黃芩中的主要生物活性物質[9]。

由于黃芩性味苦、寒,目前臨床上多采用其炮制品酒黃芩[10]。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為“酒制則升”,酒黃芩可借酒的清上焦之力,清除上焦肺熱和四肢膚表之濕熱,黃芩性寒,用辛熱的黃酒炮制,符合寒性緩和的“以熱制寒”學說,既能緩和黃芩的苦寒之性,又能免傷脾陽[11]。歷年以來,《中國藥典》收載的酒制方法均為酒炒法。根據(jù)全國炮制規(guī)范,各地的炮制也均為酒炒法[12],但是傳統(tǒng)炒制易出現(xiàn)火源不穩(wěn)定、火候時間可控性差,受熱不均等問題,現(xiàn)代微波炮制技術已被應用于多種中藥的炮制[13],相較于傳統(tǒng)炒制,微波炮制具有似光特性及穿透特性,熱特性,非熱特性等獨特性能(生物效應)使得炮制加熱均勻,并且溫度穩(wěn)定,智能化程度高,精確度高,易于操作[14]。

本試驗以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分的含量為評價指標[15],采用正交試驗設計結合層次分析法[16],對酒黃芩微波炮制工藝進行優(yōu)化,以期為解析炮制原理提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Waters e2695 HPLC高效液相色譜儀;DFT-200型高速萬能粉碎機(購自浙江溫嶺市林大機械有限公司);XMTD-8222型電熱恒溫鼓風干燥器(購自上海精宏實驗設備有限公司); FA-1004B型電子天平(購自上海精密科學儀器有限公司);AE-240型電子分析天平(十萬分之一,購自瑞士梅特勒-托利多公司);S7G88C型微波爐(購自蘇州三星電子有限公司)。

A.混合對照品;B.黃芩生品;C.黃芩傳統(tǒng)酒制品;D.黃芩微波酒制品 1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素

1.2 試藥黃芩藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學鑒定室李峰教授鑒定為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。所用對照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素(批號分別為B0321A5、O0903AS、J0227AS、M0303AS,均購于大連美侖生物技術有限公司,質量分數(shù)均大于98%),漢黃芩苷購于大連美侖生物技術有限公司,其他對照品購于中國藥品生物制品檢定研究院。黃酒(批號:20190202,酒精度10%)購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,甲醇為色譜純,乙醇、磷酸為分析純,水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 飲片制備

2.1.1 生黃芩飲片取黃芩原藥材除去雜質,置沸水中煮10 min,取出,切成2 mm薄片,于60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干,即得。

2.1.2 傳統(tǒng)酒黃芩飲片取生黃芩飲片適量,置密閉容器內,加入10%的黃酒(即生黃芩飲片質量的10%,下同)拌勻,悶透,待黃酒被吸盡后,置于鍋中,以文火炒干,取出,放涼,即得。

2.1.3 微波酒黃芩飲片取生黃芩飲片適量,加入10%的輔料黃酒拌勻,置密閉容器內悶潤30 min,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,在300 W功率下,微波5 min,取出,放涼,即得。

2.2 指標成分定量測定

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量,用甲醇溶解并定容,制備成對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量,甲醇稀釋,搖勻經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得分別含黃芩苷0.044 mg·mL-1,漢黃芩苷0.021 mg·mL-1,黃芩素0.008 mg·mL-1,漢黃芩素0.008 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備按照《中國藥典》2020年版[1]黃芩項下含量測定方法制備供試品溶液,即取黃芩粉末約0.3 g,精密稱定,加70%乙醇40 mL,水浴回流3 h,冷卻至室溫,過濾,濾液濾至100 mL容量瓶中,容器及濾渣用70%乙醇進行分次洗滌,洗滌液濾入同一個容量瓶內,70%乙醇定容至刻度,搖勻。精密移取1 mL上述供試品溶液,置10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件色譜柱:Xtimate C18柱;流動相:甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)(0～17 min,47%A;17～20 min,47%A→70%A;20～30 min,70%A→100%A);流速:1.0 mL·min-1;PDA檢測波長為:280 nm;樣品進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液適量,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,詳見圖1。由圖1可知,各色譜峰均與基線分離,分離度均大于1.5。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察將對照品儲備液稀釋成系列不同濃度的對照品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,以峰面積為縱坐標(Y),以各待測成分進樣量為橫坐標(X),得到黃芩苷回歸方程Y=3 221 445.9X-95 126,r=0.999 8,漢黃芩苷回歸方程Y=1 647 552.4X-26 610.8,r=0.999 7,黃芩素回歸方程Y=1 083 325X-5 468.8,r=0.999 9,漢黃芩素回歸方程Y=1 081 090X-5 101,r=0.999 7,表明黃芩苷在0.008 7～0.435 0 μg,漢黃芩苷0.004 2～0.210 0 μg,黃芩素在0.001 6～0.080 0 μg,黃芩素在0.001 6～0.080 0 μg進樣范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗精密吸取混合對照品溶液,按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,計算得黃芩苷,漢黃芩苷,黃芩素,漢黃芩素峰面積的RSD分別為:0.18%、0.57%、0.20%、0.44%,n=6,表明該儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液,照“2.3”項下色譜條件,在樣品制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為:0.69%、0.65%、1.06%、1.64%,n=6,表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗精密稱取同一黃芩供試品粉末6份,按2.3項下方法制備供試品溶液,進樣測定,計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量分別為:12.07%、4.76%、2.31%、0.23%;RSD分別為:1.66%、1.37%、0.78%、1.17%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗精密稱定已知含量的黃芩粉末6份,各0.15 g,按對照品加入量∶樣品中量≈1∶1的比例加入對照品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進行測定,計算各成分加樣回收率,結果:黃芩苷平均加樣回收率為102.22%,RSD為1.20%;漢黃芩苷平均加樣回收率為100.50%,RSD為1.76%;黃芩素平均加樣回收率為100.83%,RSD為2.10%;漢黃芩素平均加樣回收率為98.48%,RSD為1.41%。4種黃酮類化合物的加樣回收率均在規(guī)定的回收限度內,表明該方法的加樣回收率良好。

2.6 炮制工藝優(yōu)化

2.6.1 多指標綜合加權評分法根據(jù)層次分析法(AHP)原理,利用Yaahp v10.3應用軟件以綜合評分OD值作為決策目標,以各個指標的權重系數(shù)作為方案層,并建立判斷矩陣,判斷矩陣一致性比率(CR)<0.1,表明判斷矩陣一致性良好,得到的權重系數(shù)是合理和有效的,不存在邏輯混亂,結果見表1。分別給予黃芩苷0.6,漢黃芩苷0.2,黃芩素0.1,漢黃芩素0.1的權重系數(shù),加權綜合評分,計算綜合OD值。

表1 關于工藝指標的準則層判斷矩陣

綜合評分=(60×X/Xmax+20×Y/Ymax+10×W/Wmax+10×Z/Zmax)×100%,其中X為黃芩苷含量,Y漢黃芩苷含量,W為黃芩素含量,Z為漢黃芩素含量,綜合評分越高表示樣品質量越好。

2.6.2 單因素考察

2.6.2.1 加酒量考察取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入生黃芩飲片質量的5%、10%、15%、20%、25%的黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率300 W、微波時間3 min,考察不同加酒量對綜合評分的影響。結果,當加酒量為10%時,綜合評分最高,故選擇加酒量5%～15%進行正交試驗,詳見表2。

表2 不同加酒量對綜合評分的影響

2.6.2.2 悶潤時間取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤10、20、30、40、50 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率300 W、微波時間3 min,考察不同悶潤時間對綜合評分的影響。結果,悶潤30 min時的綜合評分較高,故選擇悶潤時間20～40 min進行正交試驗,詳見表3。

表3 不同悶潤時間對綜合評分的影響

2.6.2.3 微波功率取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,分別設定微波功率100、180、300、450、600 W,微波時間3 min,考察不同微波功率對綜合評分的影響。結果,微波功率為180 W時的綜合評分較高,故選擇微波功率100～300 W進行正交試驗設計,詳見表4。

表4 微波功率對綜合評分的影響

2.6.2.4 微波時間取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率180 W、分別設定微波時間1、2、3、4、5 min,考察不同微波時間對綜合評分的影響。結果,微波時間為4 min時的綜合評分較高,故選擇微波功率3～5 min進行正交試驗設計,詳見表5。

表5 不同微波時間對綜合評分的影響

2.7 正交試驗在單因素試驗結果為依據(jù),本研究以加酒量(A)、悶潤時間(B)、微波功率(C)、微波時間(D)為考察因素,以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的綜合評分為評價指標,采用L9(34)正交表進行設計。酒黃芩微波炮制工藝的因素與水平見表6,試驗設計方案與結果見表7,方差分析結果見表8。

表6 酒黃芩微波炮制工藝的因素與水平

表7 酒黃芩微波炮制工藝L9(34)正交試驗

表8 酒黃芩微波炮制工藝的方差分析

表9 生黃芩飲片與兩種炮制品含量對比(n=3)

由正交試驗結果,各因素對4種黃酮類化學成分的影響大小順序依次為:D>A>B>C,最優(yōu)組合為A1B2C3D3,由方差分析結果,因素D對綜合評分有顯著影響(P<0.05),因素A、B、C無顯著影響(P>0.05),正交試驗結果顯示當加酒量為5%時,綜合評分較高,但是因為加酒量沒有顯著性差異,參考相關文獻結合單因素試驗結果[17],選擇加酒量為10%。即加酒量10%,悶潤時間為30 min,微波功率為300 W,微波時間5 min為微波炮制酒黃芩的最佳工藝。

2.8 驗證試驗取3批“2.1”項下生黃芩飲片,每批100 g,按上述最優(yōu)微波炮制工藝制備3批酒黃芩樣品,再按“2.2”項下方法分別測定含量。結果,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為15.65%、5.94%、3.00%、0.33%,平均評分98.24,RSD為0.99%,表明該工藝所得微波炮制工藝穩(wěn)定可行。

2.9 生黃芩飲片與兩種炮制品的含量比較分別取“2.1.1”項下生黃芩飲片20 g,按照“2.1.2”和“2.1.3”項下方法炮制傳統(tǒng)酒黃芩飲片和微波炮制酒黃芩飲片,再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,“2.3”項下方法分別測定生黃芩飲片及其兩種炮制品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量,每份樣品平行測定3次。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。結果顯示,與黃芩生品相比,黃芩傳統(tǒng)酒制與微波酒制品中4種黃酮類化合物的含量均顯著性升高(P<0.05);與傳統(tǒng)酒制品相比,微波酒制黃芩中4種黃酮類化學成分顯著性增加(P<0.05)。

3 討論

黃芩作為一種常用的中藥材,具有清熱燥濕的功效。然而,由于其苦寒的性質,長期大量使用可能會侵襲人體的正氣。為了緩解這種潛在的副作用,在臨床上常采用黃酒來進行炮制。研究表明,黃酒可以在一定程度上改變黃芩的藥性[18]。黃酒的熱性可以緩和黃芩的苦寒性質,同時其易入血分的特性也有助于增強黃芩的清熱功效[19-22]。黃酒作為溶媒在炮制過程中與黃芩發(fā)生相互作用,研究發(fā)現(xiàn)黃酒可以改變黃芩的化學成分,并使其總黃酮含量增加,與酒制增效的傳統(tǒng)理論相符[23]。

中藥飲片經(jīng)炮制后臨床功效的改變基于其所含化學成分的變化,因此,中藥飲片的規(guī)范化炮制及其炮制后化學成分的微妙變化成為近些年研究的熱點。以黃芩苷為例,黃芩活性的發(fā)揮離不開鄰二酚羥基的存在,然而隨著溫度的升高,其氧化降解速度加快,這是黃芩活性發(fā)揮的關鍵物質基礎。此外,隨著炮制時間的增加,黃芩中鄰二酚羥基的含量呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢[24],所以,在炮制工藝優(yōu)化過程中,應避免長時間,較高溫度的加熱。炒制、蒸制、煮制是中藥炮制中經(jīng)常用的方法,但是長期以來中藥炮制技術由于機理不明,工藝粗糙,而且在炮制過程中還受到諸多主觀因素影響,致使飲片質量很難控制[25]。與傳統(tǒng)炮制方法比較,現(xiàn)代微波炮制有操作簡便、工藝參數(shù)容易控制、效率高、產(chǎn)品質量均勻和溶出度好等優(yōu)點[26]。

本試驗將層次分析法與判斷矩陣相結合,針對關鍵影響因素黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別給予相應的權重系數(shù),因為黃芩苷是藥典中規(guī)定的主要檢測成分,并且是黃芩中發(fā)揮藥效的主要活性成分,所以給予黃芩苷0.6的權重系數(shù)[14,27-28],同樣為苷類成分的漢黃芩苷給予0.2的權重系數(shù)[29-30],而黃芩素和漢黃芩素含量較少,且其含量與溫度關系密切,所以,分別給予0.1的權重系數(shù)[23]。并與加權評分相結合,得出了微波加工酒黃芩的最佳工藝條件,從而更加合理和可信。通過方法學的驗證表明本方法具有重復性和專屬性,且穩(wěn)定性較好。但是因為微波炮制工藝作為一種新的炮制工藝是否能完全取代傳統(tǒng)炮制方法還需要后續(xù)藥理藥效試驗、毒理實驗、化學成分分析和臨床研究來進一步證實。