曾凡松 翟亞美 袁斌 龔雙軍 向禮波 薛敏峰 闕亞偉 史文琦 鄭磊 張強(qiáng) 楊立軍 喻大昭

摘要：為了明晰小麥白粉菌BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的序列特點(diǎn)及它們在白粉菌產(chǎn)孢過程中的表達(dá)動態(tài)，為解析velvet蛋白在調(diào)控白粉菌無性繁殖中的作用提供理論依據(jù)，采用基于RNA-seq數(shù)據(jù)的克隆測序技術(shù)獲得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的CDS序列，用生物信息學(xué)方法分析它們編碼的蛋白質(zhì)序列特征和空間結(jié)構(gòu)，用RT-qPCR監(jiān)測它們在白粉菌分生孢子形成時期的表達(dá)模式。結(jié)果表明，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的ORF長度依次為1470、1341、1143 bp，分別編碼489、446、380個氨基酸，分子量在54.0～48.0 ku，屬于堿性、親水性、熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，均含有核定位信號，不含跨膜螺旋和信號肽，空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出近球形。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA分別與其他真菌來源的VosA、VelB、BrlA蛋白具有同源性，且與白粉菌同源蛋白具有更近的親緣關(guān)系，氨基酸序列在白粉菌自然群體中均高度保守。BgtVosA、BgtVelB屬于典型的velvet蛋白家族成員，可能通過分子互作形成復(fù)合物，但其結(jié)構(gòu)與構(gòu)巢曲霉同源蛋白復(fù)合物存在明顯差異。在小麥白粉菌無性繁殖階段，BgtVosA、BgtVelB基因均顯著上調(diào)（P<0.01），BgtBrlA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化（P>0.05）。 DNA結(jié)合區(qū)域分析推測BgtVosA-BgtVelB復(fù)合物不能靶向BgtBrlA啟動子，調(diào)控其BgtBrlA的表達(dá)。BgtVosA、BgtVelB基因在調(diào)控白粉菌無性生殖中起重要作用。

關(guān)鍵詞：小麥白粉菌；Velvet蛋白；BrlA基因；無性產(chǎn)孢；表達(dá)分析

中圖分類號：S435.121.4+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0026-09

收稿日期：2022-11-23

基金項(xiàng)目：國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-3-1-2）。

作者簡介：曾凡松（1980—），男，湖北宜昌人，博士，副研究員，主要從事小麥病害防控研究。E-mail：zengfansong2005@126.com。

通信作者：楊立軍，博士，研究員，主要從事小麥病害防控研究。E-mail：Yanglijun1993@163.com。

小麥白粉病是由禾谷類白粉菌小麥?；停˙lumeria graminis f. sp. tritici，Bgt）引起的重要病害。白粉病降低小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，在我國常年發(fā)生面積約700萬hm²，對小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅^［1］。禾谷類白粉菌只能在活的寄主上生活，可通過有性生殖和無性生殖繁衍后代，其中有性生殖每年只發(fā)生1次；而無性生殖可在1個生長季節(jié)發(fā)生很多次，產(chǎn)生的分生孢子不僅是無性世代的繁殖體，而且是病害流行的主要侵染源^［2］。分生孢子落在小麥葉片上1 d后侵入寄主表皮細(xì)胞，2 d后形成成熟的吸器，從寄主細(xì)胞中不斷汲取營養(yǎng)物質(zhì)，3 d后形成大量的營養(yǎng)菌絲，4 d后進(jìn)入無性生殖階段，菌絲上開始形成足細(xì)胞，5 d后開始形成分生孢子梗，不斷分化出分生孢子，在風(fēng)力的作用下擴(kuò)散傳播，導(dǎo)致病害迅速擴(kuò)散^［3］。解析白粉菌產(chǎn)孢相關(guān)基因的功能，有助于揭示白粉菌無性繁殖的分子機(jī)制，為白粉病的流行和防控提供理論依據(jù)。關(guān)于絲狀真菌產(chǎn)孢遺傳機(jī)制的研究始于對構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究。BrlA基因編碼1個C₂H₂—鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它能夠激活A(yù)baA、WetA基因的表達(dá)，這3個基因組成的BrlA-AbaA-WetA途徑在構(gòu)巢曲霉無性產(chǎn)孢過程中起核心調(diào)控作用^［4］。Velvet家族蛋白是絲狀真菌特有的蛋白，它們具有Velvet結(jié)構(gòu)域，參與真菌無性、有性發(fā)育過程的調(diào)控和次生代謝產(chǎn)物的合成，其成員包括VosA（viability of spores A）、VeA （velvet）、VelB（velvet like B）、VelC（velvet like C）、VelD（velvet like D）^［5-6］。Velvet蛋白可在BrlA-AbaA-WetA途徑下游起調(diào)控作用，其中VosA能夠與VelB形成復(fù)合物，結(jié)合到BrlA的啟動子區(qū)域，反饋抑制BrlA的表達(dá)，從而影響分生孢子的數(shù)量和成熟^［7-8］。VosA、VelB能夠直接或間接地調(diào)節(jié)異源G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和促分裂原蛋白激酶信號途徑相關(guān)基因，影響真菌無性生殖、初生代謝和次生代謝^［9-10］。國內(nèi)外關(guān)于白粉菌velvet蛋白的研究還未見報(bào)道。從已發(fā)表的小麥白粉菌基因組中找到了3個含有velvet結(jié)構(gòu)域的蛋白，NCBI登錄號分別為：EPQ65573.1、EPQ63747.1、EPQ67732.1^［11］。

白粉菌無法在人工培養(yǎng)基上生長，只能在活的寄主上存活，因而很難對其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，基因功能研究進(jìn)展速度偏慢。本研究對小麥白粉菌2個velvet蛋白BgtVosA、BgtVelB以及調(diào)控因子BgtBrlA進(jìn)行了氨基酸序列分析、功能注釋、結(jié)構(gòu)預(yù)測和變異位點(diǎn)檢測，對這些基因在小麥白粉菌分生孢子形成過程中的表達(dá)譜進(jìn)行了監(jiān)測，旨在為揭示白粉菌無性生殖調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的小麥白粉菌菌株Bgt21-2來自江蘇省鹽城市^［12］。培養(yǎng)白粉菌的小麥材料為感病品種Chancellor。種植小麥的土壤為含有水溶肥（山東金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司）的營養(yǎng)土，白粉菌的接種、擴(kuò)繁參照Yang等的方法^［3］。菌株在Chancellor離體葉段上進(jìn)行擴(kuò)繁，每12 d擴(kuò)繁1次。

1.2 基因克隆

以構(gòu)巢曲霉AnVosA、AnVelB（NCBI登錄號分別為ABI51618.1、ABQ17967.1）和煙曲霉（A. fumigatus）AfBrlA蛋白質(zhì)序列（NCBI登錄號 XP_753026.1）為查詢序列，在已發(fā)表的參考菌株 96224蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫^［11］中進(jìn)行BLASTp比對，獲得BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的候選蛋白。根據(jù)菌株Bgt21-2分生孢子形成階段轉(zhuǎn)錄組測序的reads比對參考基因組后的數(shù)據(jù)^［13］，獲取覆蓋3個基因ORF的cDNA序列。采用Primer Premier 6.0軟件從ORF上游和下游設(shè)計(jì)引物，送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

采用醋酸纖維素包埋法^［14］將接種5 d后的小麥葉片表面的菌絲體剝離，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol試劑盒和PrimeScript^TM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物科技有限公司）提取總RNA和合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系包含1 μL cDNA，2.5 μL 10×ExTaq PCR buffer，1.25 μL 50 mmol/L Mg²⁺，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，上下游引物各0.5? μL，0.25 μL ExTaq酶（大連寶生物科技有限公司），補(bǔ)ddH₂O至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到T-vector pMD^TM19，送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。為檢測目的基因DNA序列變異，采用CTAB法提取菌株分生孢子樣品中的基因組DNA^［15］。用相同的方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物連接和序列測定。

1.3 基因序列特征分析

采用DNAMAN v6.0軟件和NCBI ORF finder工具對基因編碼區(qū)進(jìn)行序列分析。采用ExPASy-ProtParam和ExPASy-Scale工具分析蛋白質(zhì)氨基酸的理化性質(zhì)，包括分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪指數(shù)和親水性指數(shù)^［16］。采用SinalP v5.0、NLStradamus 和TMHMM v2.0等軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽、核定位信號和跨膜區(qū)^［17-19］。采用MEME Suite v5.5.0 進(jìn)行motif分析。采用I-TASSER在線工具計(jì)算 B-因子（B-factor），預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)^［20］。采用ZDOCK Server（https：//zdock.umassmed.edu/）進(jìn)行蛋白之間的分子對接^［21］。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列在NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp比對，搜索并下載同源序列。采用MEGA v6.0軟件和鄰接法（Neighbor-Joining method）進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建^［22］，并進(jìn)行bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.5 表達(dá)譜分析

在接種菌株Bgt21-2后3 dpi（菌絲生長期）、4 dpi （足細(xì)胞發(fā)育期）和5 dpi（分生孢子梗發(fā)育期），取感染的小麥離體葉段進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，顯微觀察和拍照。采用醋酸纖維素包埋法收集3個時間點(diǎn)的葉表面菌體，每個時間點(diǎn)樣品重復(fù)3次?？俁NA的提取和cDNA合成方法同“1.2”節(jié)。根據(jù)“1.2”節(jié)方法克隆的目標(biāo)基因的ORF序列，設(shè)計(jì)引物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系采用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix-Universal Kit （吐露港生物科技有限公司）配制。PCR反應(yīng)參照Hacquard等的方法^［14］執(zhí)行。PCR反應(yīng)在ABI 7500 real-time PCR儀上完成，每個反應(yīng)重復(fù)3次。采用2^-ΔΔC_T方法和SPSS v26.0軟件計(jì)算基因相對表達(dá)量和統(tǒng)計(jì)分析^［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因的克隆

通過BLASTp比對從菌株96224基因組中獲得了候選BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白序列，NCBI登錄號分別為EPQ63747.1、EPQ65573.1、EPQ63980.1。根據(jù)菌株Bgt21-2轉(zhuǎn)錄組reads覆蓋參考基因組區(qū)段，從非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了特異性PCR引物對（表1）。 以5dpi菌體樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了覆蓋BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA等3個基因完整ORF區(qū)域的cDNA序列，包含完整的ORF區(qū)域長度，分別為1 470、1 341、1 143 bp，編碼489、446、380個氨基酸（圖1），其中BgtVosA、BgtVelB各含有3、4個內(nèi)含子，BgtBrlA不含內(nèi)含子（圖2）。

2.2 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的理化性質(zhì)、序列特征和功能注釋

BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA這3個基因編碼的蛋白質(zhì)的分子量分別為54.6、47.8、43.7 ku，等電點(diǎn)為7.2～8.0，均屬于偏堿性蛋白質(zhì)。這些蛋白親水指數(shù)（GRAVY）為-0.93～-0.50，脂肪指數(shù)為42.0～59.0，提示它們都是親水性、熱不穩(wěn)定蛋白。3個蛋白均不含跨膜區(qū)和信號肽（表2）。BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的核定位信號分別位于第191～204位氨基酸（RVRKEQNRTLIRKR）、第431～437位氨基酸（RKDAAKG）、第325～358位氨基酸（DKGGPDRPNRRTQYFKDAGKIIKAMSRRGGKLFS）。BgtVosA、BgtVelB具有典型的velvet結(jié)構(gòu)域（Pfam數(shù)據(jù)庫：PF11754.11；Interpro數(shù)據(jù)庫：IPR037525），屬于velvet蛋白。BgtBrlA蛋白是1個C₂H₂型鋅指蛋白（Pfam數(shù)據(jù)庫：PF02200.19；PF13465.9；Interpro數(shù)據(jù)庫：IPR013087），具有結(jié)合DNA和調(diào)控轉(zhuǎn)錄的功能，推測為1個轉(zhuǎn)錄因子（圖2）。

2.3 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

選擇同源蛋白質(zhì)序列分別構(gòu)建BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。BgtVosA與來自白粉菌的同源蛋白能聚到1個較大的分支中。小麥白粉菌、小黑麥白粉菌、大麥白粉菌等禾谷類白粉菌的同源蛋白之間的親緣關(guān)系最近，處在同1個小分支中。它們與來自擬蘭芥白粉菌等雙子葉植物上白粉菌的同源蛋白也具有較近的親緣關(guān)系。BgtVelB、BgtBrlA呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，但不同的是，來自白粉菌的同源蛋白與來自腐生生活真菌的同源蛋白分別處在彼此獨(dú)立的分支中，表現(xiàn)出更遠(yuǎn)的進(jìn)化距離。

同源蛋白的模體分析表明，從BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA的同源蛋白中分別找到了10、6、5個保守的模體。23個VosA同源蛋白均含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它們的注釋為velvet 蛋白結(jié)構(gòu)域。在25個VelB同源蛋白序列中發(fā)現(xiàn)了4個保守的模體，分別為Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4，它們均為velvet蛋白結(jié)構(gòu)域。18個BrlA同源蛋白中高度保守的模體包括Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5，其中Motif 1、Motif 2為鋅指結(jié)構(gòu)域，Motif 5為核定位信號序列（圖3）。

2.4 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)分析

BgtVosA的二級結(jié)構(gòu)含有4個α螺旋和9個延伸鏈，分布在氨基酸序列的N端，84.5%的序列為無規(guī)則卷曲（圖4-A），B-因子在N端富含二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域呈現(xiàn)頻繁的起伏變化，說明BgtVosA該區(qū)域在空間上具有明顯的剛性和柔性相結(jié)合的特性。在BgtVelB序列中只發(fā)現(xiàn)了1個α螺旋和6個延伸鏈，超過90%的序列為無規(guī)則卷曲（圖4-B），在C端第350～400位氨基酸區(qū)域，B因子具有明顯的增加，說明該區(qū)域有利于蛋白折疊時塑造更加靈活的空間結(jié)構(gòu)。BgtBrlA蛋白含有相對較多的α螺旋（占13.2%），而延伸鏈只占1.6%。

基于二級結(jié)構(gòu)，BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA蛋白的三級結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)出近球形，屬于球形蛋白（圖5）。BgtVosA、BgtVelB分別與PDB數(shù)據(jù)庫中來自構(gòu)巢曲霉的AnVosA-AnVelB 復(fù)合物（PDB登錄號：4n6r）的A鏈（VosA，4n6r.1.A）、B 鏈（VelB，4n6r.1.B）能夠較好地匹配，校正的Z-score分別達(dá)到9.07、8.60（表3）。其中BgtVosA、BgtVelB與A鏈和B鏈氨基酸序列的一致性分別為54.9%、50.3%，提示BgtVosA與BgtVelB可能存在類似的互作。進(jìn)一步通過ZDOCKER在線服務(wù)器對BgtVosA、BgtVelB進(jìn)行分子對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們可以在空間上接近，形成1個復(fù)合物，互作的區(qū)域位于BgtVosA蛋白靠近N端的延伸鏈區(qū)、BgtVelB蛋白靠近C端的延伸鏈，與構(gòu)巢曲霉的復(fù)合物存在明顯差異（圖5-D）。

2.5 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麥白粉菌自然群體中的變異

采用PCR產(chǎn)物測序的方法，對來自江蘇等省份白粉菌的BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因序列進(jìn)行了測定，序列比對結(jié)果表明，在BgtVosA基因ORF中，有3個菌株的第1 234位堿基發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致第412位氨基酸有甘氨酸（G）突變?yōu)榻z氨酸（S），屬于非錯義突變。突變菌株有2個來自甘肅省，1個來自河北?。ū?）。突變位點(diǎn)不在velvet功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在BgtVelB、BgtBrlA基因序列中未檢測到突變。

2.6 BgtVosA、BgtVelB、BgtBrlA基因在小麥白粉菌無性產(chǎn)孢階段的表達(dá)譜分析

基因表達(dá)量檢測結(jié)果表明，與葉表面菌絲生長階段（3 dpi）相比，BgtVosA、BgtVelB在4、5 dpi均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（P<0.01），其中BgtVosA持續(xù)上調(diào)表達(dá)，BgtVelB在產(chǎn)孢階段維持較高的表達(dá)水平。BgtBrlA基因水平在整個過程中沒有表現(xiàn)出顯著的差異（圖6）。這些結(jié)果說明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌無性生殖過程中起重要調(diào)控作用，BgtBrlA可能起基礎(chǔ)作用。根據(jù)Ahmed等的報(bào)道，構(gòu)巢曲霉AnVosA-AnVelB復(fù)合物能夠特異性地結(jié)合到BrlA基因啟動子區(qū)域的CCGCGG的基序^{［8，10］}。采用DNAMAN軟件在BgtBrlA 5′非翻譯區(qū)搜索2個基序，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)相關(guān)DNA序列，作者推測BgtVosA-BgtVelB復(fù)合物可能不是通過類似的方式調(diào)控BgtBrlA的基因表達(dá)。

3 討論

Velvet蛋白普遍存在于植物病原真菌中，例如玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）^［24-26］。它們均含有同源的velvet結(jié)構(gòu)域序列，與其他已知蛋白缺乏相似性，這些序列具有DNA結(jié)合能力^［27］。在本研究中，小麥白粉菌BgtVosA、BgtVelB的序列特征、功能模體分析表明，它們均含velvet結(jié)構(gòu)域， 說明它們能夠與特定DNA結(jié)合。而且，它們具有核定位信號，沒有跨膜螺旋和信號肽，提示可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，調(diào)控其他基因的表達(dá)。對構(gòu)巢曲霉AnVosA、AnVelB蛋白的靶向基因啟動子序列分析結(jié)果表明，它們具有十分相似的DNA結(jié)合序列（5′-CCXTGG-3′、 5′-CCXXGG-3′），靶向包括BrlA在內(nèi)的166個參與無性繁殖調(diào)控的基因^［10］。而且，AnVosA-AnVelB復(fù)合物能夠抑制AnBrlA的表達(dá)，阻止構(gòu)巢曲霉無性生殖的開始^［4］。BgtVosA、BgtVelB在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上均分別與AnVosA、AnVelB蛋白存在顯著的相似性，經(jīng)預(yù)測能夠互作形成復(fù)合物，提示它們可能靶向相似的基因，例如AnBrlA。但是，BgtVosA-BgtVelB復(fù)合物在空間結(jié)構(gòu)上與AnVosA-AnVelB復(fù)合物存在明顯差異^［8］，而且在BgtBrlA基因啟動子區(qū)域并未找到類似的序列，BgtBrlA基因也不隨BgtVosA、BgtVelB基因的變化而變化，推測BgtVosA-BgtVelB復(fù)合物不調(diào)控BgtBrlA的表達(dá)。AnVosA-AnVelB復(fù)合物還能夠靶向構(gòu)巢曲霉vidD、McrA等生長發(fā)育相關(guān)基因的啟動子并調(diào)控它們的表達(dá)^［28-29］。對BgtVosA、BgtVelB及其復(fù)合物開展蛋白表達(dá)、空間結(jié)構(gòu)、與DNA互作分析將有助于發(fā)現(xiàn)它們調(diào)控的基因。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，BgtVosA、BgtVelB與其他真菌的同源蛋白具有保守的基序，可能具有相對保守的功能。BgtVosA的序列在不同白粉菌菌株中是高度保守的，在velvet結(jié)構(gòu)域沒有發(fā)現(xiàn)突變，BgtVelB的序列則完全一致。而且，BgtVosA、BgtVelB在小麥白粉菌分生孢子形成過程中顯著上調(diào)。上述結(jié)果說明，BgtVosA、BgtVelB可能在白粉菌的無性生殖調(diào)控中起重要作用，在白粉菌進(jìn)化過程中一直得以保留。Velvet蛋白家族成員可通過自身形成二聚體，彼此形成二聚體或者與其他非velvet蛋白（如LeaA）形成復(fù)合物，通過反饋抑制參與曲霉無性生殖的調(diào)控^［4］。然而，BgtVosA、BgtVelB的空間結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，部分區(qū)域B-因子數(shù)值較高，它們的互作模型具有較強(qiáng)的可縮性，可形成不同結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，導(dǎo)致它們參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與構(gòu)巢曲霉等真菌存在差異。下一步研究將對3個基因開展沉默和表型分析、轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白-DNA互作等研究，有望進(jìn)一步解析它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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