周 華,孫志興,劉 順,王 婕,吳旭彤,袁加才

(1.江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

勃起功能障礙(ED),是指陰莖持續(xù)不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性交,且病程達3個月以上[1-2],為男科最常見的性功能障礙之一。中醫(yī)學(xué)將之描述為痿而不舉,舉而不堅,堅而不久,簡稱為陽萎。ED的病因分為精神類因素、器質(zhì)性因素以及其他類因素等。目前ED的病理機制尚不明確,劉繼紅等[3]和肖堯等[4]指出:與腺苷信號水平有關(guān),其中,NO-cGMP通路調(diào)控作用的發(fā)現(xiàn)是最為經(jīng)典,研究也最為深入的。器質(zhì)性因素對于ED具有直接的影響作用,與神經(jīng)、血管和內(nèi)分泌等方面有著密切的聯(lián)系[5]。盡管目前相關(guān)的研究并不多,但還是有通過中醫(yī)藥的方法調(diào)整神經(jīng)、血管和內(nèi)分泌等方面,以整體調(diào)節(jié)的方式治療ED的報道[1]。

二地鱉甲方由生地黃、熟地黃、菟絲子、茯苓、枸杞子、金櫻子、丹參、天花粉、續(xù)斷、桑寄生、鱉甲、牡蠣、丹皮和五味子等14味中藥組成,為江蘇省中醫(yī)院徐福松教授臨床經(jīng)驗方,主要用于陰虛火旺為主要表現(xiàn)的陽痿等男科病癥,且頗有良效[6-10]。其中,菟絲子、枸杞子、續(xù)斷和五味子均歸腎經(jīng),具有補肝益腎之功效,是古今治療ED中運用較多的藥方。

江蘇省中醫(yī)院對二地鱉甲方進行了繼承與創(chuàng)新,在保證療效的情況下,將其開發(fā)為單劑量包裝的顆粒劑,提高了二地鱉甲煎劑的穩(wěn)定性。為更有效控制該制劑質(zhì)量,確保臨床用藥的安全性和有效性,筆者在參考大量文獻的基礎(chǔ)上,建立了二地鱉甲顆粒中菟絲子、枸杞子、續(xù)斷和五味子的薄層色譜法(TLC),以及2種活性成分五味子醇甲和川續(xù)斷皂苷Ⅵ同時測定的高效液相色譜法(HPLC);以期對二地鱉甲顆粒的質(zhì)量進行更加快速全面的控制,為其品質(zhì)與臨床用藥安全的提升提供參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器設(shè)備

Acquity Arc型高效液相色譜儀,美國沃特世公司;CAPCELL PAK C18 MGⅡ型色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),日本曹達集團;AX224ZH/E型電子天平,常州市奧豪斯儀器有限公司;BP-211D型十萬分之一電子天平,北京市賽多利斯天平公司;SK6200H型超聲清洗器,上海市科導(dǎo)超聲儀器有限公司;R19676D型100～1 000 μL可調(diào)移液器,德國eppendorf公司;2 mL一次性使用無菌注射器,江蘇省蘇云醫(yī)療器材有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇杰瑞爾電器有限公司;VISUALIZER 2型TLC,瑞士CAMAG公司。

1.2 實驗材料

硅膠G板(批號:2021010)、硅膠板GF254(批號:20191122、20170406),青島市海洋化工有限公司;聚酰胺薄膜板(批號:20191009),臺州市路橋四甲生化塑料廠。

五味子醇甲(批號:Y14F10H80840,純度≥98%),川續(xù)斷皂苷VI對照品(批號:Y14F10H80840、ZI8M10L83256,純度≥98%),上海市源葉生物科技有限公司;菟絲子對照藥材,枸杞子對照藥材,續(xù)斷對照藥材和五味子對照藥材(批號:121232-201403、121072-201611、121033-201812和120922-201610),中國食品藥品檢定研究院;二地鱉甲顆粒(批號:2012001、2012002和2012003),江蘇省中醫(yī)院制劑部自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 五味子薄層色譜的鑒別

取二地鱉甲顆粒適量,研細,稱粉末約5 g,加20 mL熱水溶解,冷卻后,用經(jīng)H2O飽和的三氯甲烷振搖提取2次,每次15 mL,棄去水液。合并三氯甲烷溶液,用三氯甲烷液蒸干,殘渣加三氯甲烷1 mL使其溶解,即得。

取適量五味子對照藥材和缺五味子的陰性制劑,分別制成五味子對照藥材及缺五味子的陰性制劑供試品溶液。缺五味子的陰性制劑為原方中去除五味子藥材,按制劑工藝進行制備所得制劑。

取適量五味子醇甲對照品,加三氯甲烷溶解制成五味子醇甲對照品溶液。

參照文獻[11]的方法,依次吸取上述4種溶液適量,點樣于同一硅膠GF254薄層板上,以石油醚-甲酸乙酯-甲酸(30～60 ℃,體積比15∶5∶1)的上層溶液展開,取出晾干后,置于紫外光燈254 nm下檢視。

1.3.2 菟絲子薄層色譜的鑒別

取二地鱉甲顆粒適量,研細,稱粉末約1 g,加甲醇20 mL,水浴加熱回流30 min,過濾,濾液濃縮至2 mL,即得。

取適量菟絲子對照藥材和缺菟絲子的陰性制劑,同法分別制成菟絲子對照藥材與缺菟絲子的陰性制劑供試品溶液。缺菟絲子的陰性制劑為原方中去除菟絲子藥材,按制劑工藝進行制備所得制劑。

另取適量金絲桃苷對照品,加甲醇溶解制成金絲桃苷對照品溶液。

分別取上述供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液和對照品溶液適量,點于同一塊聚酰胺薄膜板,以冰醋酸-水(體積比1∶1)展開,取出,晾干后,噴體積分數(shù)為5% AlCl3溶液,于105 ℃加熱5 min,待冷卻后,置于紫外燈366 nm下檢視。

1.3.3 枸杞子薄層色譜的鑒別

參照文獻[12]的方法,取二地鱉甲顆粒適量,研細,稱粉末約1 g,加H2O 10 mL,超聲處理30 min,過濾,濾液用經(jīng)H2O飽和的乙酸乙酯振搖提取3次,每次20 mL,棄去水液,合并乙酸乙酯液,經(jīng)乙酸乙酯液蒸干后,殘渣加乙酸乙酯1 mL使其溶解,即得。

取適量枸杞子對照藥材和缺枸杞子的陰性制劑,同法分別制成枸杞子對照藥材和缺枸杞子的陰性制劑供試品溶液。缺枸杞子的陰性制劑為原方中去除枸杞子藥材,按制劑工藝進行制備所得制劑。

分別取上述供試品溶液、陰性樣品溶液和對照藥材溶液適量,點于同一硅膠G薄層板上,參照文獻[13]的方法,以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(體積比為3∶2∶1)溶液展開,取出晾干后,置于紫外光燈366 nm下檢視。

1.3.4 續(xù)斷薄層色譜的鑒別

參照文獻[14]的方法,取二地鱉甲顆粒適量,研細,稱粉末約5 g,加甲醇20 mL,超聲處理30 min,過濾,濾液蒸干后,殘渣加水20 mL使其溶解,用經(jīng)H2O飽和的正丁醇振搖提取2次,每次20 mL,棄去水液,合并正丁醇液,用20 mL氨試液洗滌,棄去NH3·H2O,經(jīng)正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇1 mL使其溶解,即得。

取適量續(xù)斷對照藥材及缺續(xù)斷的陰性制劑,同法分別制成續(xù)斷對照藥材和缺續(xù)斷的陰性制劑供試品溶液。缺續(xù)斷的陰性制劑為原方中去除續(xù)斷藥材,按制劑工藝進行制備所得制劑。

取適量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品,加甲醇制成續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液。

分別取上述供試品溶液、陰性樣品液、對照藥材溶液和對照品溶液適量,點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-10%(體積分數(shù))NaOH(體積比為17∶7∶2)的下層溶液展開,取出晾干,噴以體積分數(shù)10% H2SO4甲醇溶液,于105 ℃加熱至斑點顯色清晰,在紫外光燈366 nm下檢視,再置于日光下檢視。

1.3.5 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MGⅡ型,4.6 mm×150 mm色譜柱;純H2O(A)-乙腈(B)作為流動相,檢測波長為212 nm,柱溫為30 ℃,流速為1.00 mL/min,進樣體積為10 μL,梯度洗脫程序見表1。

1.3.6 對照品溶液的制備

取適量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品,精密稱量后,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度為128.9 μg/mL溶液,作為川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液;取適量五味子醇甲對照品,精密稱定后,加甲醇制成質(zhì)量濃度為51 μg/mL溶液,作為五味子醇甲對照品溶液。

分別取上述2種對照品溶液適量,置于10 mL容量瓶中,制成含51.56 μg/mL川續(xù)斷皂苷Ⅵ與10.2 μg/mL五味子醇甲的混合對照品溶液。

1.3.7 供試品溶液的制備

精密稱定二地鱉甲顆粒粉末樣品約1 g,置于25 mL棕色容量瓶,加甲醇適量,超聲處理30 min,放至室溫后,以甲醇定容至刻度,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

1.3.8 陰性樣品溶液的制備

分別取缺續(xù)斷、缺五味子的陰性制劑適量,按1.3.7節(jié)方法制成陰性樣品溶液。缺續(xù)斷、缺五味子的陰性制劑為原方中分別去除續(xù)斷、五味子藥材,分別按制劑工藝進行制備所得制劑。

1.3.9 方法學(xué)的考察

1.3.9.1 專屬性實驗

分別取上述混合對照品溶液、二地鱉甲顆粒供試品溶液2種陰性樣品溶液,按照1.3.5節(jié)色譜條件,進樣10 μL,進行專屬性實驗。

1.3.9.2 線性關(guān)系實驗

取適量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液和五味子醇甲對照品溶液,精密稱取,配制成質(zhì)量濃度分別為51.56、10.2 μg/mL的初始混合對照品溶液。將初始混合對照品溶液精密稀釋0、2、4、8、10和20倍,分別進樣10 μL。按照1.3.5節(jié)色譜條件進行進樣測定并記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲的峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(Y),混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線并進行線性回歸。

1.3.9.3 精密度實驗

精密吸取1.3.6節(jié)的川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲的混合對照品溶液,按照1.3.5節(jié)的色譜條件重復(fù)進樣6次,每次10 μL,記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲的峰面積,計算相對標準偏差(RSD)。

1.3.9.4 重復(fù)性實驗

分別稱取同批顆粒6份,按照1.3.7節(jié)方法制成供試品,按照1.3.5節(jié)的色譜條件分別進樣10 μL,測定并記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲的峰面積,計算RSD。

1.3.9.5 穩(wěn)定性實驗

取1.3.9.4節(jié)供試品溶液適量,分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12和24 h進樣10 μL,測定并記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲的峰面積,計算RSD。

1.3.9.6 加樣回收實驗

精密稱定二地鱉甲顆粒約0.5 g,共6份,分別加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲對照品適量,按1.3.7節(jié)的方法制備成供試品溶液,并按照1.3.5節(jié)的色譜條件進行測定。記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ、五味子醇甲的峰面積,計算加樣回收率。

1.3.10 樣品含量的測定

取3批二地鱉甲顆粒樣品,按照1.3.7節(jié)的方法制備供試品溶液,按照1.3.5節(jié)的色譜條件分別進樣10 μL,記錄峰面積,并計算川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量與五味子醇甲含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 五味子薄層色譜的鑒別結(jié)果

五味子供試品薄層色譜的鑒別結(jié)果見圖1。由圖1可知:在與五味子對照藥材、五味子醇甲對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯出相同顏色的斑點,且陰性樣品無干擾。

注:1為供試品溶液,2為五味子醇甲對照品溶液,3為缺五味子的陰性樣品溶液,4為五味子對照藥材溶液

2.2 菟絲子薄層色譜的鑒別結(jié)果

菟絲子供試品薄層色譜的鑒別結(jié)果見圖2。由圖2可知:在與菟絲子對照藥材、金絲桃苷對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯出相同顏色的斑點,且陰性樣品無干擾。

2.3 枸杞子薄層色譜的鑒別結(jié)果

枸杞子供試品薄層色譜的鑒別結(jié)果見圖3。由圖3可知:在與枸杞子對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯出相同顏色的斑點,且陰性樣品無干擾。

注:1為供試品溶液,2為缺枸杞子的陰性樣品溶液,3為枸杞子對照藥材溶液

2.4 續(xù)斷薄層色譜的鑒別結(jié)果

續(xù)斷供試品薄層色譜的鑒別結(jié)果見圖4。由圖4可知:在與續(xù)斷對照藥材、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯出在相同顏色的斑點,且陰性樣品無干擾。

注:1為供試品溶液,2為缺續(xù)斷的陰性樣品溶液,3為續(xù)斷對照藥材溶液,4為川續(xù)斷皂苷VI對照品

2.5 專屬性的考察實驗結(jié)果

專屬性的考察實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知:陰性樣品色譜在混合對照品色譜上無對應(yīng)的色譜峰出現(xiàn),說明陰性樣品無干擾,此方法具有專屬性。

圖5 專屬性實驗考察結(jié)果

2.6 線性關(guān)系的考察實驗結(jié)果

線性關(guān)系考察得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回歸方程為Y=2.123 8X-8.860 1,r=0.999 9;五味子醇甲的回歸方程為Y=59.988X+0.275 7,r=0.999 5。結(jié)果表明:川續(xù)斷皂苷Ⅵ在2.578～51.560 μg/mL,五味子醇甲在0.510～10.200 μg/mL時,線性關(guān)系良好,可用于準確定量。

2.7 方法學(xué)的考察實驗結(jié)果

五味子醇甲、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率結(jié)果見表2。由表2可知:本實驗建立的方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率。

表2 五味子醇甲、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量的測定結(jié)果

樣品含量的測定結(jié)果見表3。由表3可知:本研究所建立的定量檢測方法準確、快速且靈敏,3批樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ和五味子醇甲批間差異較小,結(jié)果穩(wěn)定可靠。

表3 含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

在查閱大量文獻的基礎(chǔ)上,通過采用不同供試品處理方法及展開劑進行試驗,對二地鱉甲顆粒全方藥都進行了TLC法定性鑒別研究,成功鑒別出菟絲子、枸杞子、續(xù)斷及五味子4味藥材。色譜斑點均清晰、分離效果較好,重現(xiàn)性好;其供試品溶液制備方法也比較為簡單。因此,可作為制劑質(zhì)量控制的定性指標。

采用HPLC法同時測定了顆粒中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、五味子醇甲2個活性成分的含量,所建立的方法靈敏準確、穩(wěn)定可行;且其供試品溶液制備方法及色譜條件均較簡單。因此,可為二地鱉甲顆粒的質(zhì)量標準制定提供參考。

本研究在預(yù)實驗階段對二地鱉甲顆粒中的君藥生地、熟地也進行了含量測定方面的研究,但由于其指標性成分如:梓醇、地黃苷D、毛蕊花糖苷,或受熱后穩(wěn)定性不足、易降解,或在制劑中含量較少,因此,考慮在后續(xù)的研究中引入HPLC-MS/MS等方法來滿足更多指標性成分的含量測定。