馬 定,高思遠,王 昕,陳可泉,2

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學 國家生化工程技術研究中心,江蘇 南京 211800)

在綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的理念下,綠色制造是實現這一理念的重要手段,也是目前世界各國重要的戰(zhàn)略發(fā)展方向[1]。合成生物學的目標是構建微生物細胞工廠,通過定向修改和重構細胞代謝途徑,賦予微生物新的表型,使之具備目標產物的生產性能[2]。通過代謝工程手段,對底盤細胞進行改造,如敲除副產物途徑或競爭途徑、過表達代謝途徑的關鍵基因等,從而實現目標產物收率最大化、碳源和能量消耗最優(yōu)化[3]。但是,這些策略不僅會導致碳源的浪費、能量的損失、氧化還原的失衡以及毒性代謝物的積累等問題,而且還會引起的細胞代謝網絡的失衡,從而影響細胞的生長,最終限制產品的產量[3-4]。

利用傳感器(sensor)/調節(jié)器(regulator)構建的基因回路則是一個有效的解決辦法[5]。類似于微生物的自然調節(jié)方式,細胞通過感知環(huán)境信號和細胞內信號,實時調節(jié)代謝通路,合理分布碳流向和能量[3,6]。動態(tài)調控系統(tǒng)是動態(tài)代謝調控的重要組成部分,對它進行合理選擇與設計是有效動態(tài)調控代謝途徑的關鍵,其中,響應啟動子是動態(tài)調控系統(tǒng)中的重要組成部分,是響應信號和基因表達的重要樞紐。因此,本文就響應啟動子的發(fā)現、設計與改造以及應用進行綜述,并對其未來的發(fā)展做出展望。

1 動態(tài)調控系統(tǒng)及響應啟動子概述

1.1 動態(tài)調控系統(tǒng)的發(fā)現及原理

動態(tài)調控系統(tǒng)是微生物面臨環(huán)境變化,自發(fā)調控體內代謝網絡,并由多個響應元件逐級調控、協(xié)調工作,實現微生物對環(huán)境變化的響應。因此,挖掘動態(tài)調控的響應元件是構建動態(tài)調控系統(tǒng)的基礎[7]。啟動子工程是工業(yè)底盤細胞中轉錄調控最有效的方法之一[8]。與傳統(tǒng)的組成型啟動子相比,響應啟動子可以在合適的時間和空間啟動基因的表達,所以它們在調控和再分配代謝通量方面發(fā)揮著重要的作用。如,通過響應啟動子調控碳流再分配,實現生物量積累和產物積累的平衡,加速有毒產物的消耗和外排以提高菌株耐受性和產物產量[9]。目前,常規(guī)的誘導啟動子廣泛應用于合成生物學中,雖然它們可對宿主進行代謝調控,但是存在較多局限性:如,有毒的(IPTG)或者能耗盡(乳糖)的誘導劑并不利于工業(yè)化生產。此外,在培養(yǎng)期間添加誘導物,需要監(jiān)測細胞生長狀態(tài)并優(yōu)化誘導物添加的時間[10],這會增加工藝路線及生產成本。因此,開發(fā)響應啟動子受到研究人員更多的關注。

20世紀70年代,研究人員發(fā)現,費氏弧菌在菌體密度達到一定閾值時出現生物發(fā)光現象,直到1994年Fuqua等[11]根據這種現象提出了群體感應(QS)的概念,發(fā)現了LuxI/R、EsaI/R等一系列群體感應系統(tǒng),其中,自誘導劑高絲氨酸內酯(AHL)在QS系統(tǒng)中起到關鍵作用,因為隨著細菌密度的增加,當細胞外周環(huán)境中由細菌分泌的AHL積聚到一定濃度閾值時,可與細胞質中的作為受體的LuxR蛋白的氨基殘端結合,激活誘導啟動子,使調控的基因得到表達。2010年,Valdez-Cruz等[12]發(fā)現,溫敏啟動子PR/PL受溫敏阻遏蛋白CI857調控,基于此開發(fā)溫敏啟動子,繼而溫敏啟動子在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物中得到大規(guī)模的應用[13]。近年來,響應啟動子得到了更廣泛的挖掘。Rohlhill等[14]在分析甲醛解毒操縱子的基礎上,在大腸桿菌中開發(fā)甲醛響應啟動子,結果發(fā)現:當轉錄因子FrmR特異結合到響應啟動子上會抑制基因表達,但該轉錄因子受甲醛變構調節(jié)作用解除抑制,加速甲醛的消耗,使之能在更高濃度的甲醇中生長。Xu等[15]通過雜交啟動子技術插入PdhR box,雜交啟動子能特異性識別丙酮酸,通過檢測細胞內丙酮酸濃度來優(yōu)化中心代謝的代謝流,從而使枯草芽孢桿菌高效合成葡萄糖二酸。周大袁等[16]根據可溶性血紅蛋白(VHb)能在低溶氧下攝氧而開發(fā)溶氧響應啟動子Pvhb,通過對溶氧響應啟動子的串聯(lián),增強誘導強度,使表面活性素(surfactin)表達強度得到顯著提升。Zhang等[17]通過天然存在的脂肪酸敏感蛋白FadR開發(fā)了脂肪酸響應啟動子PFadR,結果發(fā)現:當轉錄因子與響應啟動子特異性結合抑制表達,脂肪酸能解除該特異結合;將轉錄因子結合位點雜交到強啟動子T7上提高動態(tài)響應范圍,加速中間代謝產物脂肪酸消耗,提高終產物脂肪酸乙脂的產量。

1.2 響應啟動子的結構及調控機制

啟動子是一段位于目標基因上游的核苷酸序列,具有能夠被RNA聚合酶特異性識別并實現轉錄的特性[18]。轉錄調控是基因表達實現供給平衡的重要方法之一[19],啟動子是轉錄調控的核心元件[20-21]。一般原核生物的啟動子主要由上游序列、-35區(qū)、間隔序列、-10區(qū)、轉錄起始位點及核糖體結合位點(RBS)等部分組成。-35區(qū)和-10區(qū)的序列和距離相對保守,對RNA聚合酶的結合與轉錄有很大的影響[22]。真核生物的啟動子則較為復雜,而且不被RNA聚合酶直接識別,需要某些反式作用因子識別及其相互作用才能識別。真核生物的啟動子可分為三類,分別由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ轉錄起始。RNA聚合酶Ⅰ啟動子(Ⅰ類)主要由-45至+20的核心啟動子和-187至-107的上游調控元件構成。RNA聚合酶Ⅱ啟動子(Ⅱ類)是研究最多的類型,由基本啟動子、上游元件、起始子及應答元件構成。RNA聚合酶Ⅲ啟動子組成較復雜,可分為3個亞類,即I型基因內啟動子、Ⅱ型基因內啟動子和基因外啟動子(Ⅲ型)。

在啟動子的結構中存在著轉錄因子結合位點,這些轉錄因子結合位點一般都與響應信號有關,實現對目標基因表達調控?；虻谋磉_調控一般由正反饋或者負反饋調控完成。負反饋調節(jié)是由阻遏蛋白或抑制因子結合到啟動子的操縱區(qū)上,從而抑制目標基因的正常表達。當細胞中存在響應信號時,響應信號與阻遏蛋白結合,改變阻遏蛋白構型,使之不能與啟動子序列結合,目標基因得以正常表達(圖1)。正反饋調節(jié)則是在響應信號存在的情況下,激活蛋白結合在啟動子上,從而使RNA聚合酶能在啟動子上順利轉錄翻譯與表達(圖2)。目前開發(fā)的大部分響應啟動子,都是基于轉錄因子來實現對信號的響應到基因表達的傳導。由于轉錄因子與響應啟動子特異結合,阻止了RNA聚合酶的轉錄,從而實現對目的基因表達的抑制,當轉錄因子受到響應信號的變構調節(jié)解除抑制,目的基因得以表達?；陧憫獑幼拥南嚓P原理,研究人員開發(fā)出了各種調控開關,通過響應信號對啟動子的激活或者抑制,實現對目的基因表達的激活或者抑制,如,對代謝過程關鍵酶的調控來增加產量[23]、對抗逆基因的過表達增加抗逆性等[24]。

圖1 負反饋調節(jié)示意

圖2 正反饋調節(jié)示意

2 響應啟動子的類型及特征

目前,根據啟動子的響應信號可分為化學信號和物理信號兩大類。在化學信號響應啟動子中,目前還是以類似IPTG的外源添加誘導劑為主(圖3),但這種類型的誘導啟動子在目前還存在著一定的缺陷:一方面,誘導劑價格昂貴,不適合工業(yè)規(guī)模的生產;另一方面,誘導劑對宿主菌有一定毒性且添加誘導劑時需要持續(xù)觀測菌株的生長情況等。

響應啟動子受外源壓力或添加的誘導劑激活,關鍵酶過表達,加速底物消耗,增加終產物產量

物理信號響應啟動子主要基于細胞代謝過程的各種環(huán)境因素為響應信號而被開發(fā)出來。一般以代謝過程中的環(huán)境溫度、溶氧及滲透壓等因素作為響應信號,實現對代謝過程的動態(tài)調控。與外源添加的信號相比,宿主自身代謝產生的內源信號(多為化學信號)則有更多優(yōu)勢(圖4),因為宿主會更加及時地處理內源信號,且不需要觀測菌株的生長代謝情況再進行調控,可大大減少工作量,提高調控精確度,更好地為代謝目標產物服務,所以目前越來越多的研究人員將研究重點放在內源性響應啟動子開發(fā)方面。通過對響應啟動子的開發(fā)以及后續(xù)的改造等,實現啟動子對整個代謝途徑的動態(tài)調控,來解決代謝過程中的相關問題,如,提高終產物產量、加速有毒中間產物的消耗、檢測胞內產物濃度、增加抗逆性等。

中間代謝產物或者終產物積累過多,誘導啟動子被激活,關鍵酶過表達,加速中間產物消耗或者終產物外排

2.1 化學信號類型的響應啟動子

為了實現細胞代謝過程的動態(tài)調控,減少誘導劑的使用,目前在響應啟動子領域的研究取得較多成果。大腸桿菌在生產倍半萜紫穗二烯時,會產生有毒的中間代謝產物法尼焦磷酸(FPP),這會嚴重影響目標產物的產量,Dahl等[25]在FPP脅迫條件下對全基因組進行轉錄組分析,篩選出對FPP毒性作出反應的啟動子PrstA和PgadE,雖然這兩個啟動子的響應機制還尚不清楚,但使用這兩個啟動子能使目標產物倍半萜紫穗二烯的產量比組成型啟動子的提高2倍,同時也減少了副產物的積累(圖5)。這種在不清楚響應機制的情況下,通過轉錄組分析得到理想的啟動子的思路受到越來越廣泛的關注,因為這能夠大大減少各種類型響應啟動子開發(fā)的時間。

圖5 PFPP響應示意

同時也存在另一種情況,即通過解析細胞對有毒物質的解毒機制來尋找響應啟動子,但是這種方法需建立在對有毒代謝物有一定的研究基礎上。如,Rohlhill等[14]通過對中間代謝產物的甲醛進行解毒機制分析后得到甲醛解毒操縱子frmRAB及甲醛響應啟動子Pfrm,再對啟動子進行突變并篩選陽性突變株,這極大地提高了啟動子在甲醛誘導下的響應強度;同時發(fā)現,突變體能在更高濃度的甲醇中生長,能更好地利用甲醇,這種結合細胞自身的解毒機制和自我保護機制為響應啟動子的開發(fā)提供了新思路,正成為響應啟動子開發(fā)的一種重要方法。

除了加速有毒中間代謝產物消耗外,響應啟動子還在提高終產物產量方面得到很好的應用,更可用于監(jiān)測產物的濃度。Binder等[26]研究堿性氨基酸誘導的啟動子后發(fā)現,轉錄因子LysG與啟動子Psenlys特異性結合后,受賴氨酸變構調控,可通過響應啟動子Psenlys實時監(jiān)控胞內賴氨酸濃度。最近Zhao等[27]在轉錄因子cgmAR中發(fā)現了腐胺、尸胺等二胺的響應啟動子PcgmA,因為cgmR能與響應啟動子特異結合,抑制基因的表達,但該轉錄因子受二胺的變構調節(jié)后,解除與啟動子的結合;同時他們通過對轉錄因子的隨機突變獲得更加靈敏的傳感器,該傳感器通過響應啟動子調控報告基因GFP,再通過監(jiān)測胞內熒光值變化來實時監(jiān)測細胞產二胺的情況(圖6)。

圖6 PcgmA響應示意

除了代謝產物作為誘導信號外,影響代謝過程外部環(huán)境中的化學信號也受到廣泛關注,Xu等[28]在研究大腸桿菌對酸的耐受性時發(fā)現,啟動子PfabA、PfabB能對中性酸(pH 4.0～5.0)作出響應,通過提高細胞膜的不飽和脂肪酸(UFAs)的含量,從而提高細胞對酸的耐受。該啟動子對酸響應主要是通過雙組分系統(tǒng)CpxRA周質組氨酸殘基質子化來實現的:在低pH情況下,CpxA周質結構的H52和H117的組氨酸殘基質子化,使CpxA磷酸化激活CpxR蛋白,該蛋白能直接結合到響應啟動子PfabA和PfabB上,從而增強啟動子轉錄的強度,增加不飽和脂肪酸的含量,從而產生對中性酸的耐受性,使對數生長期的大腸桿菌在該酸性環(huán)境下實現從生存到生長的轉變(圖7)。這種由細胞分級調控、最后由啟動子響應來調控目的基因的表達,這種動態(tài)調控方式將會受到越來越多的關注。

圖7 PfabA、PfabB響應示意

2.2 物理信號類型的響應啟動子

除了上述的化學誘導信號外,細胞內還存在與代謝過程的環(huán)境因素密切相關的物理信號。物理信號作為代謝過程的重要指標,在微生物代謝過程中起到重要的作用,影響著細胞的生長代謝過程。因此,溫度、滲透壓及溶氧等物理信號在響應啟動子開發(fā)方面受到了越來越多的關注,研究人員試圖以物理信號為誘導因子來調控細胞代謝,以減少代謝過程產生的一系列負擔以及副產物等,從而提高終產物的產量以及菌株對環(huán)境因素的耐受性。

在這些物理信號中,溫度是應用最廣泛的,溫敏啟動子也被隨之開發(fā)出來。溫敏系統(tǒng)主要由啟動子PL和PR及溫敏蛋白CI857ts兩部分構成,其中PL和PR來源于大腸桿菌λ噬菌體,具有極強的RNA轉錄功能,在合成生物學中有廣泛的應用。更重要的是,該啟動子受蛋白CI857ts負調控:在30 ℃時,CI857ts具有抑制PL/PR啟動子的活性,但在42 ℃時,該蛋白則失去抑制啟動子的活性,啟動子能正常調控基因表達[12,29]。Harder等[13]用溫度敏感的CI857阻遏蛋白來調控大腸桿菌生物合成衣康:在37 ℃時,積累菌體生物量,而在28 ℃時合成目標產物衣康酸,最終將衣康酸產量從32 g/L提高至47 g/L(圖8)。除了PL/PR類型的溫敏型啟動子外,Wang等[30]通過全基因組轉錄組分析及qRT-PCR擴增得到一個高溫敏響應啟動子PCgcwp1,將其應用于谷氨酸棒桿菌,使木糖醇的產量提高了204%,達到15.4 g/L;同時,在木糖醇發(fā)酵驗證實驗中發(fā)現,與30 ℃發(fā)酵相比,雖然在42 ℃發(fā)酵的生物量較低,但是木糖醇的產量從5.07 g/L提高到15.40 g/L,使更多的碳源流向了終產物。該研究擴大了溫敏啟動子“工具箱”,使其不再局限于PL/PR啟動子。

圖8 溫敏啟動子響應示意[13]

除了溫度外,滲透壓對代謝過程的影響也很大。一般在發(fā)酵中后期,滲透壓成為發(fā)酵過程中不得不考慮的因素,因為過高的滲透壓不僅影響細胞的生長,還會大大降低目標產物的產量,所以越來越多的研究人員也將目光聚焦于此。Huang等[24]研究調節(jié)滲透保護基因mtrA/mtrB后發(fā)現,PNCgl1418對滲透壓的響應是最明顯的,但與傳統(tǒng)的IPTG誘導啟動子和組成啟動子相比,表達強度還有很大的差距。因此,對該啟動子間隔序列進行了隨機突變,得到了一個突變體,強度為對照組的8.5倍,常規(guī)啟動子的1.5倍,將該突變啟動子PNCgl1418/A10用來調控賴氨酸轉運蛋白基因lysE,通過加速發(fā)酵中后期賴氨酸的外排來提高賴氨酸的產量;通過滲透壓響應啟動子對賴氨酸轉運蛋白基因的過表達和 CRISPRi對賴氨酸消耗途徑的抑制相結合,賴氨酸產量從17.0 g/L提升到28.0 g/L,增長了64.7%(圖9)。這在一定程度上解決了滲透壓對代謝的影響。因為滲透壓是在代謝過程中普遍存在的物理信號,比化學信號有更高的特異性,所以應用更廣泛,普適性更強。

圖9 滲透壓響應啟動子示意[24]

在發(fā)酵過程中,溶氧是至關重要的影響因素。Hwang等[23]對啟動子的間隔序列進行隨機突變,篩選了強、中、弱3個不同強度的啟動子調控關鍵基因,經研究發(fā)現:在大腸桿菌中引入溶氧響應啟動子Pnar,成功地將D-乳糖產量從79.0 g/L增至105.6 g/L,增加了34%;在2,3-丁二醇生產中,將丙酮酸到2,3-丁二醇途徑的3個酶用3個不同強度的Pnar進行調控后得到最優(yōu)組合,2,3-丁二醇的產量也從51.1 g/L增至88.0 g/L,提高了88%。與其他啟動子不同的是,他們使用了響應啟動子的組合,不再是單一啟動子的調控,而是通過不同強度的啟動子調控,實現供給和消耗的平衡,使終產物產量達到最優(yōu)。

綜上可知,通過對物理和化學信號響應啟動子的開發(fā)與改造,可拓寬目前啟動子的“工具箱”,根據不同的信號類型、發(fā)酵條件、發(fā)酵中間代謝產物和終產物選擇合適的響應啟動子。同時,也可以使用相關啟動子的開發(fā)和改造方法來挖掘更多的響應啟動子。如,可通過在脅迫條件下進行轉錄組學分析得到PCgcwp1、Pstress,對解毒操縱子或者保護機制的分析得到PNCgl1418、Pfrm,對現有已發(fā)現響應操縱子的解析得到:PcgmA、PmarO和PPuuR以及在前人研究的基礎上開發(fā)的響應啟動子Pnar、PBAD、Pc120和Psenlys。由于新開發(fā)的響應啟動子的強度一般還達不到常規(guī)成熟的啟動子的性能,所以對其突變改造是必不可少的。目前,對響應啟動子的改造主要集中于啟動子全序列的隨機突變、對間隔序列的隨機突變、轉錄因子的隨機突變以及雜交啟動子的利用等方面,另外通過induces box與強啟動子的結合,可改變box與啟動子結合區(qū)域的位置等方面以獲得理想型響應啟動子[15]。雖然通過相關的方法開發(fā)和改造已獲得一些響應啟動子,但對于建立微生物細胞工廠的需求來說,這些響應啟動子的數量還是遠遠不夠的,特別是基于化學信號的響應啟動子對中間產物或終產物具有特異性識別,存在較多的局限性,所以在響應啟動子開發(fā)方面還是任重道遠。迄今為止,研究人員已開發(fā)出受不同的化學或物理信號調控的響應啟動子,對目標基因進行不同強度的調控表達,總結部分響應啟動子的相關研究進展于表1。

表1 不同類型的響應啟動子

3 響應啟動子的應用

在響應啟動子的開發(fā)和改造方面,研究人員通過一系列方法獲得較為理想的響應啟動子?，F在響應啟動子的應用不再局限于終產物的產量最大化,而是根據實際需要,多元化應用響應啟動子。如,加速中間有毒代謝產物的消耗,提高終產物的產量;響應細胞生長環(huán)境中的各種壓力脅迫,提高細胞的耐受性;響應生長環(huán)境變化,使細胞從生物量的積累轉化到產物的積累,通過響應細胞代謝產物,報告基因及時反饋終產物的濃度。這些響應啟動子的多元化應用也加速響應啟動子的開發(fā)。

3.1 響應脅迫壓力提高耐受性

除了有毒中間代謝產物會影響細胞的產能外,在細胞生長代謝過程中,尤其是在發(fā)酵的中后期,各種脅迫壓力嚴重影響細胞的生長和代謝。雖然這些因素是無法避免的,但它們也是天然存在的誘導信號,每個代謝過程都存在,比化學信號有更好的普適性。Qin等[35]通過在高溫和高葡萄糖濃度等脅迫條件下獲得多個脅迫響應啟動子,通過對各響應啟動子的組合來優(yōu)化谷胱甘肽(GSH)抗氧化系統(tǒng)以提高酵母對各種脅迫的耐受性,最終酵母的耐受性得到提高,繼而大幅提高木質纖維素發(fā)酵產乙醇能力,比對照組提升了49.5%。Huang等[24]在研究滲透壓調節(jié)保護系統(tǒng)時發(fā)現:天然滲透壓響應啟動子,在大腸桿菌發(fā)酵產賴氨酸時,該啟動子對發(fā)酵后期的滲透壓及時響應,通過賴氨酸外排蛋白LysE及其CRISPR系統(tǒng)來調控;當發(fā)酵體系的滲透壓過高時,響應啟動子被激活,賴氨酸外排蛋白LysG過表達,加速賴氨酸外排,從而提高賴氨酸產量;另一方面,CRISPR系統(tǒng)在高滲下被激活,抑制了賴氨酸消耗途徑,使賴氨酸產量進一步提高。這些脅迫壓力的響應啟動子既可解決各種脅迫,又可提高菌株的耐受性,提升終產物的產量,這類普適性較好的響應啟動子在合成生物學研究及生物制造中會有更廣泛的應用。

3.2 響應環(huán)境變化增加產量

通過響應環(huán)境變化,使微生物從生物量積累轉變到產物的積累,一般以物理類型的響應啟動子來實現,其中溶氧響應啟動子、光響應啟動子因其能快速切換,在相關的研究與生產中得到廣泛應用。特別是更為簡便的QS系統(tǒng)因其受細胞密度誘導,在生長與生產切換之間有著獨特的優(yōu)勢,成為應用最多的系統(tǒng)。Soma等[44]將QS系統(tǒng)的LuxI/R應用到大腸桿菌乙酰輔酶A的消耗途徑中,實現了大腸桿菌從生物量積累切換到產物異丙醇的合成:當細胞密度較低時,更多的碳源經TCA循環(huán)來增加生物量;當細胞密度達到閾值時,QS系統(tǒng)激活,減少乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)來增加終產物異丙醇的碳通量,減少碳損失的同時增加終產物的產量。Zhao等[33]在釀酒酵母中應用光響應啟動子,實現光控制發(fā)酵:在光誘導下,丙酮酸脫羧酶(PDC)表達,最終產生乙醇,菌體正常生長;在黑暗狀態(tài)下,菌體生長被抑制,乳酸脫氫酶表達,使丙酮酸流向乳酸,最終實現產物異丁醇和2-甲基-1-丁醇的生產。

3.3 響應檢測產物濃度

響應啟動子不僅在提高耐受性、增加終產物產量方面得到很好的應用,而且在監(jiān)測產物濃度的應用也逐漸被開發(fā)出來。生物傳感器一般用于產物的濃度檢測及高通量篩選,主要是由響應啟動子和報告基因實現的,通過報告基因的熒光值能反映胞內產物濃度。Binder等[26]開發(fā)了堿性氨基酸誘導的啟動子,轉錄因子LysG能夠與啟動子Psenlys特異性結合,受賴氨酸變構調控,通過響應啟動子PsenLys實時監(jiān)控胞內賴氨酸濃度。Zhao等[27]在操縱子cgmAR中發(fā)現二胺響應啟動子PcgmA,轉錄因子cgmR能與響應啟動子特異結合,抑制基因的表達;通過對轉錄因子的隨機突變獲得更加靈敏的傳感器,整個傳感器通過調控報告基因GFP,監(jiān)測胞內熒光值實現對細胞產二胺的實時監(jiān)控。而傳統(tǒng)的二胺類檢測一般采用高效液相色譜(HPLC)法[45],存在樣品前期處理和檢測流程復雜等缺點,與傳統(tǒng)的HPLC方法相比,生物傳感器具有檢測方法便捷,在實現高通量檢測同時能夠實時檢測,大大提高檢測效率。

4 結論與展望

在綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的理念下,綠色制造產業(yè)蓬勃發(fā)展,合成生物學產業(yè)化在未來的發(fā)展中必將成為熱點。啟動子作為合成生物學重要的元件之一,通過調控目的基因表達與代謝路徑,最終達到高效合成產物和酶的目標,所以啟動子的研究是高效構建細胞工廠的關鍵。開發(fā)新型響應啟動子,不斷豐富合成生物學的“工具箱”,為更多的生物合成體系提供服務。啟動子的應用研究正逐步從最初的IPTG誘導型啟動子邁向更加復雜類型的響應啟動子,從單一的啟動子到多個啟動子串聯(lián)雜交應用。目前的研究主要集中在特殊的代謝中間產物和終產物方面的響應啟動子的開發(fā),因為這些類型的啟動子似乎更加具有創(chuàng)新性。因為化學信號的響應啟動子與對應的代謝產物之間存在特異性,對其他代謝過程并不一定通用;而物理信號響應啟動子,具有更好的廣譜性和可控性等優(yōu)點,使它們不再局限于某一特定代謝途徑。一般來說,在發(fā)酵過程中,溫度和溶氧都要維持在較為穩(wěn)定的狀態(tài),但是在變溫和混菌等特殊的發(fā)酵過程中,應用溫度和溶氧響應啟動子是一種很好的選擇。

目前,響應啟動子的開發(fā)仍然存在許多具有挑戰(zhàn)性的科學問題。如,單一啟動子調控代謝過程常常伴隨著表達泄露的問題,目前還不能從根本上解決這問題;特異性的響應啟動子響應強度和程度還不能滿足工業(yè)化生產的要求,達不到組成型啟動子和常規(guī)誘導啟動子的性能,還需要對其進行突變和改造來提高其性能。目前,已開發(fā)的響應啟動子的工作原理和調控機制還需要進一步解析。這些問題是響應啟動子開發(fā)的重點方向。隨著生物信息學的快速發(fā)展,用計算機以及人工智能技術來挖掘各種類型的響應啟動子,能夠大大減少工作量,同時在響應啟動子的改造和突變方面,可采用理性設計來取代隨機突變構建文庫。從單一的響應啟動子調控向多級調控的生物傳感器模塊乃至擴大到細胞全局調控都將是未來響應啟動子的研究重點。

綜上所述,響應啟動子的開發(fā)及應用仍然面臨許多挑戰(zhàn)和瓶頸,但在未來必將成為研究熱點,這不僅可推動綠色生物制造產業(yè)的發(fā)展,更可為我國的綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展做出不可替代的貢獻。