劉 冰，趙 晨，王 靜，杜思邈，卜睿臻，鄭新元，周 軍，王 杰*

1.天津市藥品檢驗研究院，天津 300070

2.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

痹祺膠囊（Biqi Capsules）是天津市達仁堂京萬紅公司生產的獨家品種，由馬錢子粉、黨參、白術、丹參、牛膝、地龍、茯苓、川芎、三七、甘草共10味藥材組成，其功效益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛。用于氣血不足、風濕瘀阻、肌肉關節(jié)酸痛、關節(jié)腫大、僵硬變形或肌肉萎縮、氣短乏力；風濕、類風濕性關節(jié)炎、腰肌勞損、軟組織損傷屬上述證候者。其質量標準收載于《中國藥典》2020 年版一部，檢驗項目包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、膠囊檢查項、馬錢子粉中士的寧、馬錢子堿的含量測定[1]。痹祺膠囊處方來源于漢代名醫(yī)華佗傳世驗方“一粒仙丹”，馬錢子是痹祺膠囊的“君藥”，有大毒，具有散寒消腫、通絡止痛作用；臣藥由黨參、白術、茯苓、丹參構成，黨參、白術、茯苓健脾益氣，丹參養(yǎng)血和血，四藥同用益氣養(yǎng)血，切中病機為臣藥；佐藥由三七、川芎、牛膝、地龍構成，活血化瘀，通絡止痛，共為佐藥；甘草調和諸藥為使藥。諸藥配伍，共奏益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛之效[2]。痹祺膠囊臨床主要應用于類風濕性關節(jié)炎、膝骨性關節(jié)炎，頸椎病、腰椎間盤突出等癥[3-8]。目前，痹祺膠囊參考文獻集中在化學成分、藥理藥效等方面，尚無指紋圖譜方面的研究。痹祺膠囊文獻中含量測定方面的較少，主要集中于馬錢子中士的寧和馬錢子堿的含量測定，也有同時測定丹參中丹酚酸B 的含量[9-11]。

劉昌孝院士[12-13]于2016 年正式提出中藥QMarker 新概念和核心理論，建立了中藥質量控制系列共性關鍵技術，構建中藥質量研究新模式，并以痹祺膠囊中馬錢子為例闡述了炮制中藥的 QMarker。張星艷等[14]以痹祺膠囊藥效學、藥動學研究為實例，在Q-Marker 理論的指導下，從特有性、可測性、有效性和中藥理論關聯(lián)性等方面對痹祺膠囊的研究進行總結分析，發(fā)現(xiàn)士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮IIA可作為該復方的Q-Marker。本實驗在Q-Marker 的理論指導下[15-17]，通過網(wǎng)絡藥理學預測相應化學成分的基礎上，采用常見的HPLC 法，結合上述研究基礎，建立痹祺膠囊的指紋圖譜方法，并選取特征明顯的化學成分進行含量測定，用于痹祺膠囊的全面質量評價。

1 儀器與試藥

Waters e2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Shimadzu LC-20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司；Agilent 1260 Infinity II 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；Mettler XS205 型精密天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

對照品丹酚酸B（批號111562-201917，質量分數(shù)96.6%）、黨參炔苷（批號111732-201908，質量分數(shù)≥90%）、士的寧（批號110705-201307，質量分數(shù)97.1%）、馬錢子堿（批號110706-201306，質量分數(shù)91.7%）、丹參素鈉（批號110855-201915，質量分數(shù)97.8%）、迷迭香酸（批號111871-202007，質量分數(shù)98.1%）、丹參酮IIA（批號111766-201520，質量分數(shù)98.9%）、三七皂苷R1（批號110745-201921，質量分數(shù)90.4%）、人參皂苷Rg1（批號110703-202034，質量分數(shù)94.0%）、人參皂苷Rb1（批號110704-202129，質量分數(shù)94.3%）、阿魏酸（批號111773-201915，質量分數(shù)99.4%）、藁本內酯（批號111737-201910，質量分數(shù)≥90%）、β-蛻皮甾酮（批號111638-201907，質量分數(shù)98.3%）、次黃嘌呤（批號140661-202005，質量分數(shù)99.4%）、甘草苷（批號111610-201908，質量分數(shù)95.0%）、甘草次酸（批號110723-201715，質量分數(shù)99.6%）、甘草酸銨（批號110731-202021，質量分數(shù)96.2%），以上均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品茯苓酸，批號DSTDF00101，質量分數(shù)98.0%，購自樂美天醫(yī)藥德思特生物；對照品白術內酯III，批號F0032856，質量分數(shù)98.5%，購自北京曼哈格生物科技有限公司；對照品牛膝皂苷D，批號08M-MXC-22-2，質量分數(shù)96.68%，購自Panphy 化學品公司。

處方飲片黨參（批號1-2009007）、制馬錢子粉（批號1-2004017）、茯苓（批號1-2007004）、白術（批號1-2008043）、丹參（批號1-2009002）、三七（批號1-2008036）、川芎（批號1-2007005）、牛膝（批號1-2008044）、地龍（批號1-2008024）、甘草（批號1-2008053），均由天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供。

痹祺膠囊樣品由天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格為0.3 g/粒，批號分別為311282、311284、311285、311393、311403、311413、311414、311415、311416、311417、311544、311545、311546、311554、311555、311556、311557、311558、311725，分別編號S1～S19。

乙腈（液質聯(lián)用級）、甲醇（色譜純），天津市康科德科技有限公司；磷酸，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司：實驗用水為去離子水，Milli-Q 超純水儀。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Shiseido Capcell Pak C18MG II 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，2%～12%乙腈；8～20 min，12%～25%乙腈；20～32 min，25%～30%乙腈；32～35 min，30%～45%乙腈；35～60 min，45%～55%乙腈；60～70 min，55%～65%乙腈；70～75 min，65%～95%乙腈；75～80 min，95%乙腈；80～81 min，95%～2%乙腈；81～90 min，2%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長203 nm；進樣體積10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.2 mg/L 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項下內容物，研細，取約1 g，精密稱定，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取同一批（批號S19）痹祺膠囊，按“2.1.3”項下方法操作，連續(xù)測定6 次，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以丹酚酸B 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。36 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批（批號S19）痹祺膠囊，按“2.1.3”項下方法操作，分別在0、3.0、7.5、12.0、19.5、24.0 h 進樣，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以丹酚酸B 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。36 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批（批號S19）痹祺膠囊，按“2.1.3”項下方法操作，平行制備6 份，分別進樣，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以丹酚酸B 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。36 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明該方法重復性較好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及相似度分析 取收集的19 批樣品，按“2.1.3”項下樣品處理方法平行2 份操作，按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，所得圖譜以《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012 年版處理，以S1 為參照，時間窗為0.10，mark 峰匹配方式，對照圖譜生成以平均數(shù)計算，生成對照指紋圖譜。各批樣品（S1～S19）與對照指紋圖譜相比較，相似度測定結果分別為0.992、0.992、0.992、0.993、0.975、0.994、0.996、0.992、0.992、0.994、0.991、0.990、0.991、0.991、0.991、0.991、0.989、0.991、0.973，相似度在0.973～0.996，表明各批次之間相似度良好。19 批樣品的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖1。

圖1 19 批 (S1～S19) 痹祺膠囊的HPLC 指紋圖譜及對照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC fingerprints of 19 batches (S1—S19) of Biqi Capsules and reference fingerprint (R)

2.1.8 共有峰的歸屬 取處方中的10 味藥材，分別按“2.1.3”項下供試品處理方法制備藥材供試品溶液，并與對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣檢測，先將藥材及對照品與制劑比對，確定保留時間相同的色譜峰，再用二極管陣列檢測器中光譜圖進行驗證，最終選取了歸屬明確、指紋性強的色譜峰，確定了36 個峰作為共有峰。結果見表1。

表1 共有峰的歸屬Table 1 Attribution of common peaks

2.2 含量測定研究

在上述指紋圖譜研究基礎上，兼顧君臣佐使的原則，選取具有代表性的化學成分進行含量測定研究。君藥中馬錢子粉已有士的寧、馬錢子堿含量測定方法；本實驗選取臣藥丹參中丹酚酸B、佐藥川芎中阿魏酸、使藥甘草中甘草苷進行含量測定研究。

2.2.1 對照品溶液的制備 取甘草苷對照品、阿魏酸對照品、丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為甘草苷30 μg/mL、阿魏酸5 μg/mL、丹酚酸B 60 μg/mL 的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品內容物，研細，取約0.5 g，精密稱定，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，分別取除甘草、川芎、丹參外其他藥材，按制法項下的工藝制成制劑，再按“2.2.3”供試品溶液制備方法，分別制得缺甘草、川芎、丹參的陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱為Shiseido Capcell Pak C18MG II 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水-磷酸（21∶79∶0.1）；體積流量1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；以二極管陣列檢測器檢測，甘草苷檢測波長為276 nm，阿魏酸檢測波長為321 nm，丹酚酸B 檢測波長為286 nm；進樣體積10 μL。典型色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品 (276 nm, A; 321 nm, D; 286 nm, G)、痹祺膠囊供試品 (276 nm, B; 321 nm, E; 286 nm, H)、缺甘草的痹祺膠囊陰性對照 (276 nm, C)、缺川芎的痹祺膠囊陰性對照 (321 nm, F)、缺丹參的痹祺膠囊陰性對照 (286 nm, I) 的HPLC 圖Fig.2 HPLC of mixed reference substances (276 nm, A; 321 nm, D; 286 nm, G), Biqi Capsules test sample (276 nm, B; 321 nm, E; 286 nm, H), Biqi Capsules negative control solution lack of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (276 nm, C), Biqi Capsules negative control solution lack of Chuanxiong Rhizoma (321 nm, F), Biqi Capsules negative control solution lack of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (286 nm, I)

2.2.5 線性關系考察 取甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質量濃度為甘草苷30.35 μg/mL、阿魏酸5.046 μg/mL、丹酚酸B 61.79 μg/mL 的混合對照品溶液，分別精密吸取1、3、5、10、15 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，分別測定各自峰面積，以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程：甘草苷Y＝1.923 4×106X＋6 135.7，r＝0.999 9；阿魏酸Y＝4.929 0×106X＋398.81，r＝0.999 9；丹酚酸BY＝1.250 8×106X＋13 053，r＝0.999 9；結果表明，甘草苷進樣量在30.35～455.30 ng、阿魏酸進樣量在5.046～75.690 ng、丹酚酸B 進樣量在61.79～926.90 ng 與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取同一批（S19）痹祺膠囊，按“2.2.3”項下方法操作，連續(xù)進樣6 次，樣品中甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為1.50%、1.11%、0.83%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批（S19）痹祺膠囊，按“2.2.3”項下方法操作，分別在0、2.0、5.5、9.0、16.5、24.0 h 進樣測定，結果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 峰面積的RSD 分別為0.77%、1.46%、0.60%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 取同一批（S19）痹祺膠囊，按“2.2.3”項下方法操作，平行制備6 份，進樣測定，結果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 質量分數(shù)的RSD 分別為0.45%、1.05%、0.61%。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的批號S19 樣品0.25 g，平行6 份，精密稱定，分別精密加入甘草苷對照品（質量濃度12.21 μg/mL）、阿魏酸對照品（質量濃度2.858 μg/mL）和丹酚酸B 對照品（質量濃度30.48 μg/mL）的75%甲醇溶液25 mL，按“2.2.3”項下方法制備供回收用供試品溶液，進樣測定，計算各成分的平均加樣回收率，結果甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 平均加樣回收率分別為98.43%、102.12%、101.59%，RSD 分別為1.21%、1.48%、1.19%。

2.2.10 樣品測定 取19 批（S1～S19）痹祺膠囊樣品，按“2.2.3”項下方法操作，進樣測定，計算甘草苷、阿魏酸和丹酚酸B 的含量，結果見表2，結果顯示19 批（S1～S19）痹祺膠囊樣品中成分甘草苷質量分數(shù)在0.630～1.428 mg/g，阿魏酸質量分數(shù)在0.188～0.260 mg/g，丹酚酸B 質量分數(shù)在2.539～3.442 mg/g，結果表明制劑工藝穩(wěn)定。

表2 樣品測定結果Table 2 Determination results of samples

3 討論

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 流動相的選擇 本方由10 味藥材組成，經(jīng)粉碎混合后直接入藥，成分復雜，劉建庭等[18]采用UPLC-Q/TOF-MS 方法對痹祺膠囊化學物質組及入血成分進行了研究，共鑒定出280 個化學成分，如白術中主要有11 個內酯類成分[19]；茯苓中主要有21 個三萜酸類成分；丹參中主要有53 個丹酚酸類和二萜醌類成分[20]；三七中主要有41 個為皂苷類成分[21]；甘草中主要有59 個黃酮類和三萜類成分。入血成分共得到81 個痹祺膠囊相關的外源性化合物，包括59 個吸收原型藥物成分和22 個代謝產物。指紋圖譜實驗流動相首選采用梯度洗脫程序[22]，試驗中分別采用過甲醇-1%冰醋酸水溶液與乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)進行測定，經(jīng)比較，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液進行梯度洗脫，色譜圖基線平直，色譜峰數(shù)目多并且分離度較好。含量測定選用較為簡單的等度洗脫，以節(jié)約時間成本及試劑成本，最終確定乙腈-水-0.1%磷酸（21∶79∶0.1），各相關成分分離度均＞1.5，分離效果較好。

3.1.2 檢測波長的選擇 指紋圖譜研究中采用二極管陣列檢測器，在波長200～400 nm 掃描，并分別在203、254、280、321 nm 檢測波長下色譜圖進行比較，203 nm 所得的色譜圖不論在色譜峰數(shù)目及色譜峰強度上均優(yōu)于其他波長處色譜圖，故確定203 nm 作為檢測波長。含量測定中3 種成分光譜圖差異較大，選取單一波長測定較為困難，故采用多波長同時測定，分別選取3 種成分的最大吸收波長作為檢測波長：甘草苷檢測波長為276 nm，阿魏酸檢測波長為321 nm，丹酚酸B 檢測波長為286 nm。

3.1.3 其他色譜條件的選擇 指紋圖譜實驗中分別選用Shiseido Capcell Pak C18MG II（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種不同品牌的色譜柱；分別進行不同柱溫；不同體積流量進行篩選，最終選取Shiseido Capcell Pak C18MG II（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，35 ℃柱溫以及1.0 mL/min 體積流量的色譜條件。

3.2 供試品溶液制備的確定

指紋圖譜及含量測定實驗考察了供試品溶液的提取方式（超聲處理、加熱回流）、提取溶劑（50%、75%、100%甲醇）、提取時間（15、30、45、60 min），指紋圖譜提取溶劑量（10、20 mL）、含量測定提取溶劑量（25、50 mL）對各成分提取效率的影響，綜合考慮，最終確定供試品溶液制備方法。

3.3 耐用性考察

取同一批痹祺膠囊（批號S19），指紋圖譜采用不同批號色譜柱及不同品牌儀器，含量測定采用不同品牌色譜柱及不同儀器品牌，分別按相應的色譜條件進樣檢測，指紋圖譜相似度在0.964～0.976，含量測定測定結果均在2%以內，結果表明色譜柱與儀器均無影響。

3.4 指紋圖譜共有峰的確定

痹祺膠囊由10 味藥材組成，均為生粉入藥，確定的36 個共有峰中1、2、8、32、35 號峰歸屬于多個藥材，其余峰均歸屬于單一藥材。從藥材分析，茯苓藥材峰數(shù)最少，僅有2 個，甘草藥材峰數(shù)最多，共計11 個，與甘草中成分吸收值較高相關，黨參、牛膝、白術、茯苓、地龍等5 味藥材其峰面積吸收值整體偏低，黨參炔苷、β-蛻皮甾酮等成分在指紋圖譜未檢出，一方面是因為這些成分在藥材中本身含量較低，另一方面是因為有的成分無明顯的紫外吸收。

本實驗建立的HPLC 指紋圖譜及含量測定方法操作簡便，重復性好，建立的對照指紋圖譜中10 味藥材均有體現(xiàn)，通過相似度的測定，19 批痹祺膠囊的相似度測定結果均在0.97 之上，表明痹祺膠囊生產工藝穩(wěn)定，質量一致性較好，該方法可用于痹祺膠囊質量的全面評價。本實驗通過采用中藥QMarker 理論，重點開展指紋圖譜-含量測定相應檢測方法，達到“指紋成分-工藝過程可重現(xiàn)性”“質量物質可測性”和“質量標準穩(wěn)定性”相關要素研究，為建立痹祺膠囊藥品全新的質量管理體系提供科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突