宋紫騰 ，卜睿臻，韓彥琪 ，王 磊，姚鵬飛 , ，許 浚 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標志物重點實驗室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點實驗室，天津 300462

4.天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

5.津藥達仁堂集團股份有限公司，天津 300193

6.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要特征的、導致多關(guān)節(jié)進行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。RA在臨床上的病理特征主要表現(xiàn)為3 個方面：炎癥、滑膜增生、骨破壞[2]。因其發(fā)病機制尚不完全明確，市面上沒有治療RA 的特效藥，RA 仍危害著大量人群的健康[3]。目前臨床治療RA 的化學藥主要用于減輕癥狀，長期使用會產(chǎn)生不良反應，包括嘔吐、皮疹、白細胞減少和肝腎損傷[4]。相反，中藥不僅來源廣泛、種類豐富、不良反應小，且具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點、多通路綜合作用的特點[5-6]，因此中藥在類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療上具有獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)學認為RA 屬于“痹證”范疇，中醫(yī)經(jīng)典中的“歷節(jié)病”“骨痹”“頑痹”“尪痹”“鶴膝風”等均歸于RA[7]。其中，風寒濕邪、經(jīng)絡(luò)不暢、痰瘀互結(jié)是導致RA 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病機。故RA 的臨床治療亦遵循祛風除濕、散寒通絡(luò)、扶正祛邪、祛痰化瘀、清熱利濕、活血通絡(luò)的治則[8]。中醫(yī)藥良好的控制炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用在治療RA 中得到了廣泛研究與應用[9-10]。

痹祺膠囊來源于漢代名醫(yī)華佗傳世驗方“一粒仙丹”，用于治療水濕之地百姓常見的骨病，由馬錢子、黨參、丹參、白術(shù)、茯苓、川芎、三七、地龍、甘草、牛膝10 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風除濕、活血止痛的功效，臨床上用于治療氣血不足、風濕阻滯、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、關(guān)節(jié)僵硬變形等，經(jīng)多年臨床使用證實其對RA 有確切療效[11-13]。然而，痹祺膠囊治療RA 的作用機制尚不完全明確，限制了其廣泛應用。因此，本研究通過建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導單核巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型、細胞核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（macrophagestimulating factor，M-CSF）與RAW264.7 共孵育誘導破骨細胞分化模型以及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導人風濕性關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞RA-HFLS 增殖模型，探究痹祺膠囊及其方中19 個重要單體成分馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛、抑制破骨細胞形成及抑制滑膜增生的藥效及相關(guān)作用機制，并確定痹祺膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BDS200 型倒置顯微鏡、311 型MCO-5M CO2細胞培養(yǎng)箱均購自賽默飛世爾科技公司；HFsafe-1200LC 型超凈工作臺購自上海Heal Force 公司；Spectra Max M5 型酶標儀、T100 型PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；BD FACSVerse 型分析型流式細胞儀購自美國BD 公司；LightCycler480II 型熒光定量PCR 儀購自Roche 公司。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（批號311574，天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司），地塞米松、LPS、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號分別為WXBD5583V、12190801、SLCK0288，美國Sigma 公司），胎牛血清、雙抗（批號分別為2173968CP、2321126，美國Gibco 公司），甲基三氯硅烷（methyltrichlorosilane，MTS）（批號474372，美國Promega 公司），小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（批號分別為2105251、2110261，上海西塘生物科技有限公司），一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號120320210414，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），人TNF-α、RANKL、M-CSF（批號分別為021825、0319233、0419245，美國Peprotech 公司），Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（批號為021921210512，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TRNzol Universal Reagent（批號為W9623，北京天根科技生物公司），cDNA 合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（批號分別為54746820、57313500，瑞士Roche 公司），定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物（上海生工生物工程股份有限公司）。馬錢子堿、士的寧、人參皂苷Rb1（批號分別為110706-200505、110705-200306、110704-201827，質(zhì)量分數(shù)分別為95.9%、97.0%、91.2%，中國藥品生物制品檢定所），阿魏酸、牛膝皂苷D、次黃嘌呤（批號分別為L03A9D57744、S04GB159770、T13J11X107944，質(zhì)量分數(shù)分別為≥98%、≥94%、≥98%，上海源葉生物科技有限公司），黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、甘草次酸、甘草苷（批號分別為MUST-21061005、MUST-20110611、MUST-18072910、MUST-18060920、MUST-17101811、MUST-21030110、MUST-18053110、MUST-21011910、MUST-20110810、MUST-21090104、MUST-21060110、MUST-21030707、MUST-21052114，質(zhì)量分數(shù)分別為99.57%、99.97%、98.31%、98.38%、99.33%、98.60%、99.02%、98.12%、99.16%、≥98%、99.12%、99.10%、99.16%，成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.3 細胞來源及培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7，購自中國科學院上海生命科學院研究院，于DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含1%雙抗和10%胎牛血清）置37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。人類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞RA-HFLS，購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，于DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗和10%胎牛血清）置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。

2 方法

2.1 痹祺膠囊及單體化合物抗炎藥效實驗

2.1.1 供試液的制備 精確稱取痹祺膠囊粉末100 mg，加入1 mL DMSO 超聲提取30 min，離心后過0.2 μm 的濾膜，得到質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的高濃度儲存液。精確稱取適量馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷對照品，加入一定量DMSO 同法配制成濃度為100 mmol/L 的高濃度儲存液，經(jīng)梯度稀釋得到供試溶液。

2.1.2 對RAW264.7 細胞存活率的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞以2×105個/mL 均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。加入含不同濃度痹祺膠囊（4、20、100、200、500 μg/mL）或單體化合物（1、10、50、100 μmol/L）的培養(yǎng)基處理細胞，同時設(shè)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加20 μL MTS 溶液置于培養(yǎng)箱孵育2 h，測孔板490 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。

2.1.3 對NO、TNF-α 及IL-6 含量的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞以2×105個/mL 均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜后吸去上清，按實驗分組，每組設(shè)3 個復孔，空白組每孔加入100 μL 含2%血清的DMEM，模型組加入100 μL 終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 的LPS，陽性藥地塞米松組加入100 μL 終濃度為100 μmol/L 地塞米松和0.1 μg/mL LPS 的混合溶液，痹祺膠囊組每孔加入100 μL 終質(zhì)量濃度為200、20、2 μg/mL 的痹祺膠囊與0.1 μg/mL LPS 混合溶液，馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草苷給藥組分別加入100 μL 終濃度為100、10、1 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL 的LPS 混合溶液，丹參酮IIA、甘草次酸溶液給藥組分別加入100 μL 終濃度為50、10、2 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL的LPS 混合溶液，藁本內(nèi)酯給藥組分別加入100 μL終濃度為10、2、0.4 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL 的LPS 混合溶液。各組細胞處理后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細胞培養(yǎng)上清液，用試劑盒檢測NO、TNF-α、IL-6 的含量，具體實驗步驟參照試劑盒說明書。

2.2 痹祺膠囊及單體化合物對破骨細胞分化的影響

2.2.1 對破骨細胞形成的影響 取生長至80%～90%的RAW264.7 細胞，以5×103/孔的密度接種于24 孔板，8 h 后（已貼壁）吸去原培養(yǎng)基，按實驗分組，每組設(shè)3 個復孔，空白組每孔加入500 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，模型組加入500 μL 含100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，痹祺膠囊組每孔加入500 μL 終質(zhì)量濃度為200、100、50 μg/mL 的痹祺膠囊及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基；馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草苷組每組加入500 μL終濃度為100、10 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，丹參酮IIA、甘草次酸組每組加入500 μL 終濃度為50、5 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，藁本內(nèi)酯組每組加入100 μL 終濃度為10、1 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM完全培養(yǎng)基。各組細胞處理后于培養(yǎng)箱孵育，隔天換液，共培養(yǎng)5 d 后，進行TRAP 染色，根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書進行實驗操作。

2.2.2 對破骨細胞形成相關(guān)基因TRAP、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）表達的影響 取對數(shù)生長期RAW264.7 細胞，接種于6 孔板，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8 h 后，選取對破骨細胞分化有顯著抑制作用的化合物，按照“2.2.1”項下進行分組和給藥，培養(yǎng)24 h，隔天換液，培養(yǎng)至第5天采用TRIZOL 法提取細胞總RNA 后，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，于熒光定量PCR 儀上檢測TRAP、CTSK的mRNA 相對表達量。引物序列見表1。

表1 TRAP、CTSK 引物序列Table 1 Primer sequences of TRAP and CTSK

2.3 痹祺膠囊及單體化合物對TNF-α 誘導的RAHFLS 細胞增殖和凋亡的影響

2.3.1 對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞增殖的影響取生長至80%～90%的RA-HFLS 細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/孔均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后給藥處理，實驗設(shè)置空白組，每孔加100 μL 完全培養(yǎng)基；模型組每孔加含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基；痹祺膠囊組每孔加入100 μL 終質(zhì)量濃度為1000、500、250 μg/mL 的痹祺膠囊和10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液；馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷組每孔加入100 μL 終濃度為100、10、1 μmol/L 的供試品和10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液。給藥后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTS，37 ℃，5% CO2的環(huán)境下孵育2 h后于490 nm 下檢測吸光度值，計算細胞存活率。

2.3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期RA-HFLS 細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于12 孔板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，設(shè)對照組和給藥組，對照組加入1 mL含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基，給藥組加入1 mL質(zhì)量濃度分別為1000、500、250 μg/mL 的痹祺膠囊或不同濃度的待測化合物（除藁本內(nèi)酯和甘草次酸濃度設(shè)為50、5 μmol/L 外，其余化合物濃度均設(shè)為為100、10 μmol/L）與10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液，培養(yǎng)24 h 后，將所有細胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 r/min 離心3 min，棄上清，取一定量細胞加入195 μL Annexin VFITC 結(jié)合液，混勻后加入5 μL Annexin V-FITC 以及10 μL 碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min 后用流式細胞儀檢測細胞凋亡狀況。

2.3.3 對RA-HFLS 細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases-3，MMP-3）、RANKL基因表達的影響 取對數(shù)生長期RA-HFLS 細胞，接種于6 孔板，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，按實驗分組給藥，空白組加入2 mL 完全培養(yǎng)基，模型組加入2 mL 含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基，各給藥組加入不同濃度的供試品溶液（濃度設(shè)置同“2.3.2”項下）與10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液，培養(yǎng)24 h，按照TRIZOL 法提取細胞總RNA 后，測定RNA 濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，于熒光定量PCR 儀上檢測MMP-3、RANKL的mRNA 相對表達量。引物序列見表2。

表2 MMP-3、RANKL 引物序列Table 2 Primer sequences of MMP-3 and RANKL

2.4 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 痹祺膠囊及單體化合物對LPS 誘導RAW264.7細胞炎癥反應的影響

3.1.1 對RAW264.7 細胞存活率的影響 如圖1-A 所示，痹祺膠囊質(zhì)量濃度低于200 μg/mL 時，細胞存活率與空白組相比無顯著性差異，因此，后續(xù)實驗痹祺膠囊最大質(zhì)量濃度設(shè)為200 μg/mL。19 個化合物不同濃度下對RAW264.7 細胞存活率的影響如圖1-B、C所示，丹參酮IIA和甘草次酸溶液濃度為100 μmol/L時細胞存活率顯著低于空白組（P＜0.001），藁本內(nèi)酯溶液濃度高于50 μmol/L 時細胞存活率顯著低于空白組（P＜0.001），其余16 個化合物在1～100 μmol/L 對RAW264.7 細胞增殖均無顯著影響。因此，丹參酮IIA和甘草次酸活性檢測最大濃度設(shè)為50 μmol/L，藁本內(nèi)酯活性檢測最大濃度設(shè)為10 μmol/L，其余16 個化合物活性檢測最大濃度設(shè)為100 μmol/L。

3.1.2 對LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥反應的影響結(jié)果如圖2、3 所示，LPS 作用于細胞后，細胞上清液中的NO、TNF-α 和IL-6 分泌量明顯增加，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.001），陽性藥地塞米松給藥濃度為100 μmol/L 時能顯著抑制NO、TNF-α 和IL-6的釋放（P＜0.001）。與模型組比較，除2 μg/mL 痹祺膠囊對細胞上清液中TNF-α 的分泌量無顯著差異外，各濃度痹祺膠囊能明顯降低細胞上清液中的NO、TNF-α 和IL-6 含量（P＜0.05、0.001），并且呈劑量相關(guān)性。與模型組比較，0.4 μmol/L 藁本內(nèi)酯對細胞上清中NO 的釋放無顯著抑制作用；低濃度士的寧和丹參素、低濃度和中濃度馬錢子堿和人參皂苷Rg1以及3 個濃度黨參炔苷給藥組細胞上清液中TNF-α 的含量無顯著性差異；低濃度次黃嘌呤和牛膝皂苷D，低濃度和中濃度士的寧、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸和丹參素以及3 個濃度丹參酮IIA、甘草次酸和藁本內(nèi)酯給藥組細胞上清液中IL-6 的含量無顯著性差異，其他單體化合物在高、中、低濃度時對細胞上清液中NO、TNFα 和IL-6 的含量均有顯著性抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001），并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

圖3 單體化合物對RAW264.7 細胞上清液中NO (A、B)、TNF-α (C、D) 和IL-6 (E、F) 釋放的影響 (±s , n=3)Fig.3 Effects of monomer compounds on release of NO (A, B), TNF-α (C, D) and IL-6 (E, F) in supernatant of RAW264.7 cells(±s , n=3)

3.2 痹祺膠囊及單體化合物對RAW264.7 細胞分化為破骨細胞的抑制作用

3.2.1 對破骨細胞形成的影響 通過對各組RAW264.7 細胞進行TRAP 染色，研究痹祺膠囊及19個單體化合物對RANKL 和M-CSF 誘導RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響。從圖4 可以看出，空白組中沒有觀察到破骨細胞分化，而添加RANKL和M-CSF 的模型組破骨細胞數(shù)顯著增多（P＜0.001），說明模型建立成功。與模型組相比，痹祺膠囊各濃度均能顯著抑制破骨細胞分化的數(shù)量（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系。如表3 所示，與模型組相比，阿魏酸和丹參酮IIA低濃度給藥組，白術(shù)內(nèi)酯III、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和牛膝皂苷D 低濃度和高濃度給藥組破骨細胞數(shù)均無顯著性差異，其余化合物低濃度和高濃度給藥組均能顯著抑制破骨細胞的分化，破骨細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖4 痹祺膠囊對RAW246.7 細胞分化為破骨細胞的影響 (×500，±s , n=3)Fig.4 Effects of Biqi Capsules on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (× 500,±s , n=3)

表3 不同濃度化合物給對RAW246.7 細胞分化為破骨細胞的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (±s , n=3)

表3 不同濃度化合物給對RAW246.7 細胞分化為破骨細胞的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (±s , n=3)

與空白組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001###P < 0.001 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group

組別 濃度/(μmol·L?1) 破骨細胞數(shù)/個 組別 濃度/(μmol·L?1) 破骨細胞數(shù)/個空白 — 0 三七皂苷R1 100 15.5±2.1***模型 — 91.5±3.5### 10 20.0±1.4***藁本內(nèi)酯 10 7.0±1.4*** 人參皂苷Rg1 100 51.5±3.5***1 55.5±5.0** 10 66.0±2.8**馬錢子堿 100 39.0±2.8** 人參皂苷Rb1 100 56.5±2.1***10 63.0±5.7* 10 69.5±2.1**士的寧 100 33.0±2.8*** 阿魏酸 100 77.0±2.8*10 50.5±3.5** 10 88.0±1.4黨參炔苷 100 52.0±2.8** 蛻皮甾酮 100 83.5±2.1 10 71.0±5.7* 10 87.5±3.5白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 100 89.5±2.1 次黃嘌呤 100 86.0±1.4 10 90.0±4.2 10 89.0±1.4茯苓酸 100 45.0±4.2** 甘草苷 100 7.0±1.4***10 63.5±4.9* 10 65.5±3.5**丹參素 100 13.5±2.1*** 牛膝皂苷D 100 82.5±4.9 10 37.0±2.8*** 10 89.5±3.5丹酚酸B 100 18.5±2.1*** 丹參酮ⅡA 50 7.0±1.4***10 61.0±2.8** 5 74.0±7.1迷迭香酸 100 16.0±1.4*** 甘草次酸 50 6.0±1.4***10 57.0±4.2** 5 77.5±3.5*

3.2.2 對破骨細胞形成相關(guān)基因TRAP、CTSK表達的影響 如圖5、6 所示，RAW264.7 細胞與RANKL和M-CSF 共孵育后，與空白組相比，破骨細胞標志性基因CTSK和TRAP表達量顯著升高（P＜0.001），痹祺膠囊各濃度給藥處理后CTSK和TRAP的基因表達量均顯著減少（P＜0.001），且呈劑量相關(guān)性。與模型組相比，馬錢子堿、黨參炔苷、丹酚酸B、人參皂苷Rg1和藁本內(nèi)酯低濃度給藥組CTSK基因相對表達量無顯著性差異，丹酚酸B 低濃度給藥組TRAP基因相對表達量無顯著性差異，其余化合物低濃度和高濃度給藥組CTSK、TRAP基因均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖5 痹祺膠囊對RAW264.7 細胞與RANKL 和M-CSF 共孵育后CTSK、TRAP mRNA 表達的影響 (±s , n=3)Fig.5 Effect of Biqi Capsules on mRNA expression of CTSK and TRAP in RAW264.7 cells after co-incubation with RANKL and M-CSF (±s , n=3)

圖6 13 個化合物對RAW264.7 細胞與RANKL 和M-CSF 共孵育后CTSK、TRAP mRNA 表達的影響 (±s , n=3)Fig.6 Effects of 13 compounds on mRNA expression of CTSK and TRAP in RAW264.7 cells after co-incubation with RANKL and M-CSF (±s , n=3)

3.3 痹祺膠囊及單體化合物對TNF-α 誘導RAHFLS 細胞增殖和凋亡的影響

3.3.1 對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞增殖的影響痹祺膠囊及19 個單體化合物對TNF-α 誘導的RAHFLS 細胞增殖活性影響結(jié)果如圖7、8 所示。與空白組相比，TNF-α 誘導后細胞增殖能力顯著增高（P＜0.001），表明造模成功。痹祺膠囊在3 個給藥濃度下均能顯著降低TNF-α 誘導的細胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。與模型組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤在3 個給藥濃度下均能顯著降低TNFα 誘導的細胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），丹參酮IIA、人參皂苷Rb1、甘草次酸、牛膝皂苷D 在高濃度和中濃度下能顯著降低TNF-α誘導的細胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和蛻皮甾酮僅在高濃度給藥時顯著降低TNF-α 誘導的細胞增殖活性（P＜0.01、0.001），其中藁本內(nèi)酯、甘草次酸在100 μmol/L 濃度下有很強的抑制活性，細胞存活率均低于50%，因此后續(xù)實驗最大濃度設(shè)為50 μmol/L，其余化合物抑制細胞增殖活性不明顯。

圖8 不同濃度單體化合物對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞增殖的影響 (±s , n=3)Fig.8 Effects of different concentrations of monomer compounds on TNF-α-induced RA-HFLS cell proliferation(±s , n=3)

3.3.2 痹祺膠囊及單體化合物對TNF-α 誘導的RAHFLS 細胞凋亡的影響 通過流式細胞儀檢測痹祺膠囊及抑制細胞增殖活性較好的9 個單體化合物對RA-HFLS 細胞凋亡的影響，結(jié)果如圖9、10 所示。與對照組相比，痹祺膠囊高濃度和中濃度給藥組均能顯著促進RA-HFLS 細胞的凋亡（P＜0.05、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系。與對照組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤、丹參酮IIA、蛻皮甾酮、甘草次酸在低濃度和高濃度給藥時均能明顯促進RA-HFLS 細胞的凋亡（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖9 不同濃度痹祺膠囊對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.9 Effects of Biqi Capsules at different concentrations on TNF-α-induced apoptosis of RA-HFLS cells (±s , n=3)

圖10 不同濃度單體化合物對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.10 Effects of different concentrations of compounds on TNF-α-induced apoptosis of RA-HFLS cells (±s , n=3)

3.3.3 對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞MMP-3、RANKL基因表達的影響 痹祺膠囊及9 個單體化合物對MMP-3和RANKL基因表達的影響結(jié)果如圖11、12 所示。與空白組相比，TNF-α 作用于RAHFLS 細胞后MMP-3和RANKL基因的表達量顯著升高（P＜0.001）。與模型組相比，痹祺膠囊高、中、低濃度組MMP-3基因的表達量均顯著減少（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系；痹祺膠囊高、中濃度也同樣能顯著抑制RANKL基因的表達（P＜0.001），抑制活性隨濃度的增大而升高。與模型組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和甘草次酸在高、低濃度給藥時均能顯著抑制MMP-3基因的表達（P＜0.05、0.01、0.001），丹參酮IIA和藁本內(nèi)酯在高濃度給藥時顯著抑制MMP-3基因的表達（P＜0.001）；馬錢子堿、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤和甘草次酸在高、低濃度給藥后均能顯著抑制RANKL基因的表達（P＜0.05、0.01、0.001），士的寧、丹參酮IIA和蛻皮甾酮高濃度給藥時對RANKL基因表達的抑制效果顯著（P＜0.001）。

圖11 痹祺膠囊對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞MMP-3、RANKL 基因表達的影響 (±s , n=3)Fig.11 Effects of Biqi Capsules on TNF-α-induced expression of MMP-3 and RANKL in RA-HFLS cells (±s , n=3)

圖12 單體化合物對TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞MMP-3、RANKL 基因表達的影響 (±s , n=3)Fig.12 Effects of compounds on TNF-α-induced expression of MMP-3 and RANKL in RA-HFLS cells (±s , n=3)

4 討論

RA 是一種由自身免疫功能障礙引起的疾病，具體以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鳎０橛衅渌K器功能受損的慢性炎癥疾病。RA 患者的主要癥狀是滑膜增生、關(guān)節(jié)窩炎性細胞浸潤、關(guān)節(jié)破壞、嚴重者功能喪失等，其特征是手、腕及對稱足關(guān)節(jié)炎癥[14]。目前RA的發(fā)病機制尚不明確，但多數(shù)研究認為T 淋巴細胞及巨噬細胞釋放大量炎性細胞因子如TNF-α、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 等引起骨關(guān)節(jié)破壞是RA 發(fā)病的主要機制[15-16]。除了T細胞及巨噬細胞外，成纖維樣滑膜細胞（fibroblastlikesynoviocytes，F(xiàn)LS）是RA 中引起滑膜炎癥病變及關(guān)節(jié)破壞的主要效應細胞[17]，炎癥反應產(chǎn)生的大量TNF-α 在RA 患者滑液、血清、關(guān)節(jié)滑膜等組織中表達異常升高，且一定濃度的TNF-α 能刺激FLS 大量增殖并分泌炎性細胞因子（IL-6、TNFα 等）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、趨化因子、MMPs 等，進一步導致局部炎癥反應、滑膜細胞增殖與凋亡平衡失調(diào)、血管翳生成、軟骨破壞及骨侵蝕[18]。FLS 的過度增殖使其通過類腫瘤細胞樣方式侵蝕組織，是RA 滑膜炎及最終導致骨破壞的重要機制[19-20]。關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞是關(guān)節(jié)畸形的重要因素，而破骨細胞是引起骨破壞的關(guān)鍵細胞之一，破骨細胞是體內(nèi)唯一負責吸收骨質(zhì)的巨大多核細胞，其起源于骨髄單核-巨噬細胞譜系細胞，由單核前體細胞通過多種方式融合而形成[21]，受M-CSF 和RANKL 2 個細胞因子調(diào)控。M-CSF 結(jié)合其受體巨噬細胞集落刺激因子受體（macrophage-stimulating factor receptor，c-Fms），在加快破骨細胞分化中具有重要的生物學功能[22]。RANKL 結(jié)合破骨細胞前體細胞或者破骨細胞的膜蛋白RANK，可激活一系列下游信號通路，促進破骨細胞分化[23-24]。另外，滑膜大量的炎癥因子，如TNF-α 可促進破骨細胞生成和提高活性，最終使骨重建的天平失衡，介導骨破壞。因此，抑制破骨細胞的生成和功能，有助于改善RA 的病程發(fā)展[25]。

本研究利用LPS 刺激RAW264.7 細胞作為炎癥模型，對痹祺膠囊及19 個關(guān)鍵化學成分的抗炎活性進行驗證，結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷19 個成分均表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，均能顯著抑制LPS 誘導的細胞內(nèi)NO、TNF-α、IL-6 的釋放，因此推測，該19 個單體成分可能為痹祺膠囊發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。進一步通過體外小鼠單核巨噬細胞 RAW264.7 與 M-CSF 和RANKL 因子共培養(yǎng)，建立體外破骨細胞分化模型，探究痹祺膠囊及19 個單體化合物對破骨細胞分化的抑制作用，TRAP 染色結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、藁本內(nèi)酯、甘草次酸和甘草苷13 個化合物均能顯著抑制破骨細胞的分化，其作用可能是通過抑制破骨細胞發(fā)揮骨吸收作用的關(guān)鍵靶標酶CTSK和TRAPmRNA 的相對表達實現(xiàn)的[26-27]，因此推測該13 個單體成分是痹祺膠囊抑制破骨細胞分化的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。通過建立TNF-α 誘導的RA-HFLS 細胞增殖模型檢測痹祺膠囊及19個單體化合物對RA-HFLS 細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、丹參素、丹參酮IIA、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和甘草次酸9 個化合物對RA-HFLS 細胞的增殖均有顯著的抑制作用，進一步流式細胞檢測結(jié)果表明痹祺膠囊和9 個化合物均能不同程度促進細胞的凋亡，且均能顯著抑制RA-HFLS 細胞中參與骨破壞相關(guān)因子MMP-3和RANKL基因的表達[28-29]，因此推測該9 個化合物是痹祺膠囊中發(fā)揮抑制滑膜增生作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突