石穎慧，王鐵山，王煊，盧濤

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院；3 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸科

WHO 國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）的GLOBOCAN項目分析報告［1］表明，2020 年全球新增肺癌患者約220 萬例，占全部新發(fā)惡性腫瘤的11.4%。肺癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一［2］。肺癌的治療方法分為外科治療、放射治療和藥物治療，藥物治療包括化學(xué)療法、分子靶向治療和免疫治療等［3］。尋找高效安全的肺癌治療藥物是世界范圍內(nèi)的研究熱點。多肽類藥物可能通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用，也可通過增強和激發(fā)機體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管生成等發(fā)揮間接抗腫瘤作用［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，線蟲中分離的Mere15 可能通過提高人肺腺癌細胞活性氧簇（ROS）、抑制癌細胞的線粒體膜電位，促進癌細胞凋亡。脾氨肽口服液是一種免疫調(diào)節(jié)劑，主要是從健康牛脾臟中提取的多肽氨基酸和多肽核苷酸混合物，目前主要用于慢性肝炎和過敏性鼻炎的治療中［6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，脾氨肽口服液中的四肽活力成分塔夫素可以通過提高巨噬細胞吞噬作用，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用。脾氨肽口服液對肺癌細胞的增殖、凋亡遷移的影響及其可能作用機制，目前相關(guān)研究較少。2023年1—5月，我們觀察了脾氨肽口服液對人肺癌細胞系A(chǔ)549增殖凋亡遷移的影響，并進一步探討脾氨肽口服液的可能作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 A549 細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。脾氨肽口服液（北京第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司，國藥準字：H10950310，規(guī)格為10 mL：10 mg 多肽；0.1 mg 核苷酸），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素（P/S）溶液和胰蛋白酶購自美國Gibco，細胞增殖-毒性檢測試劑盒Cell counting Kit-8CCK-8、JC-1 線粒體膜電位熒光探針及DCFH-DA ROS 熒光探針購自北京蘭博利德，Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BD。CO2培養(yǎng)箱購自美國NUAIRE，高速離心機購自美國Thermo，冷凍干燥機購自德國CHRIST，酶標儀購自美國BioTek，InCucyte S3 長時間動態(tài)活細胞成像及功能分析系統(tǒng)購自美國Essen Bioscience，流式細胞分析儀LSRFortessa SORP購自美國BD。

1.2 A549 細胞分組及脾氨肽口服液給予方法 取對數(shù)生長期A549細胞，在含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的DEME 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液一次，待細胞融合度達到90%時，胰蛋白酶消化后傳代備用。脾氨肽口服液指導(dǎo)用量10 mL/天，即多肽濃度1.0 mg/mL，本研究將其設(shè)為中劑量濃度，0.5 倍濃度為低劑量濃度（0.5 mg/mL），2 倍為高劑量濃度（2 mg/mL）。將細胞分為四組，1、2、3 組分別在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中加入0.5、1.0 及2.0 mg/mL 脾氨肽口服液，4組不做任何處理。

1.3 各組細胞細胞增殖情況觀察 培養(yǎng)24 h 時采用CCK-8 法檢測各組細胞活力。取各組細胞，加入CCK-8 試劑后培養(yǎng)1 h，使用酶標儀測量各組細胞波長450 nm處的光密度OD值，根據(jù)OD值計算各組細胞活力。細胞活力=［A（加藥孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］/［A（對照孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］。干預(yù)后即刻（培養(yǎng)0 h）將各組細胞置于IncuCyte S3活細胞動態(tài)成像與分析儀器（可對活細胞進行長時程動態(tài)監(jiān)測）中觀察各組細胞的增殖情況。每3 h拍照記錄1 次，連續(xù)監(jiān)測36 h，由InCucyte 內(nèi)置算法利用拍攝圖片測算細胞匯合度（衡量細胞數(shù)量的變化，代表細胞增殖情況）。以培養(yǎng)0 h時細胞匯合度為基準進行歸一化，測算各組培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時的細胞匯合度。實驗重復(fù)測算3 次，取平均值。

1.4 各組細胞遷移情況觀察 培養(yǎng)0 h時取各組細胞，立刻放入InCucyte S3 長時間動態(tài)活細胞成像及功能分析系統(tǒng)，每2 h 拍照記錄1 次，連續(xù)拍照36 h。由InCucyte 內(nèi)置算法利用拍攝圖片計算相對劃痕區(qū)域密度（某一個時間點劃痕面積占初始劃痕面積百分比，代表細胞遷移能力）。以培養(yǎng)0 h 時細胞相對劃痕區(qū)域密度為基準進行歸一化，測算各組培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時各組細胞相對劃痕區(qū)域密度。實驗重復(fù)測算3 次，取平均值。

1.5 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術(shù)。培養(yǎng)48 h 時取各組細胞，用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，400 g 離心5 min，棄去上清液，加入300 μL Binding Buffer 重懸細胞并收集培養(yǎng)上清中的細胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC，避光室溫孵育15 min，在上機前5 min 再加入5 μL 的PI進行染色，使用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)測算3次，取平均值。

1.6 各組細胞線粒體膜電位檢測 培養(yǎng)24 h 時取各組細胞，600 g離心5 min后棄上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化下孔板上的細胞，400 g 離心5 min 后棄上清。使用JC-1 線粒體膜電位熒光探針檢測線粒體膜電位，0.5 mL 的JC-1 工作液重懸細胞，37 ℃孵育15 min，400 g 離心5 min 后棄上清，PBS 洗滌2次，加入500 μL 的PBS 重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測，選擇525 nm 激發(fā)，PE 通道檢測以及490 nm 激發(fā)，F(xiàn)ITC 通道檢測分析測算線粒體膜電位。實驗重復(fù)測算3次，取平均值。

1.7 各組細胞ROS 檢測 培養(yǎng)24 h 時取各組細胞，0.25%的胰蛋白酶消化，400 g 離心5 min，用無血清培養(yǎng)液將DCFH-DA 稀釋至終濃度為10 μmol/L，每個細胞樣品加入1 mL 稀釋好的DCFH-DA 工作液重懸細胞，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。待孵育完成后用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次，使用流式細胞儀測算DCFH-DA 的熒光值（代表細胞ROS相對表達量）。實驗重復(fù)測算3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk 檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以-x± s 表示，組間比較用獨立樣本t 檢驗或方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖情況比較 培養(yǎng)24 h 時1、2、3、4 組細胞的細胞活力分別為80.62% ± 5.30%、49.10% ± 10.03%、39.03% ± 6.37%、100.00% ±6.17%。與4組比較，培養(yǎng)24 h時1、2、3組細胞的細胞活力低（P均＜0.05），隨脾氨肽口服液濃度上升，細胞的細胞活力逐漸下降，且呈劑量依賴性（F=91.659，P＜0.05）。

培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時1 組細胞匯合度分別為1.01 ± 0.02、1.11 ± 0.02、1.22 ±0.02、1.32 ± 0.03、1.42 ± 0.02、1.53 ± 0.04、1.64 ± 0.04、1.73 ± 0.04、1.84 ± 0.06、1.94 ±0.06，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時2 組細胞匯合度分別為1.01 ± 0.03、1.11 ± 0.03、1.22 ± 0.05、1.31 ± 0.04、1.39 ± 0.04、1.46 ±0.04、1.53 ± 0.07、1.59 ± 0.08、1.64 ± 0.08、1.67 ± 0.11，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h時3組細胞匯合度分別為1.01 ± 0.01、1.05 ± 0.01、1.08 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.05 ± 0.05、0.95 ± 0.15、0.89 ± 0.17、0.87 ±0.13，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時4 組細胞匯合度分別為1.09 ± 0.00、1.19 ± 0.01、1.30 ± 0.02、1.41 ± 0.02、1.52 ± 0.03、1.63 ±0.04、1.73 ± 0.03、1.84 ± 0.05、1.91 ± 0.07、1.98 ± 0.12。與4 組比較，各時間點2、3 組細胞的細胞匯合度低（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)24 h時細胞的細胞匯合度逐漸降低，呈劑量依賴性（F= 76.110，P＜0.05）。

2.2 各組細胞遷移情況比較 培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時1 組細胞相對劃痕區(qū)域密度分別為8.51 ± 4.54、9.36 ± 4.51、10.32 ± 4.15、11.6 ± 3.76、12.14 ± 3.40、13.03 ±3.57、13.85 ± 3.65、14.65 ± 3.55、15.22 ± 3.46、15.81 ± 3.26、16.72 ± 3.03、17.53 ± 2.93、18.84 ±3.08、19.92 ± 3.23、27.23 ± 4.60，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時2 組細胞相對劃痕區(qū)域密度分別為9.71 ± 4.05、11.22 ±4.07、12.25 ± 3.78、13.47 ± 3.84、15.04 ± 4.11、17.05 ± 4.06、19.19 ± 4.37、21.74 ± 4.70、23.82 ±5.00、26.22 ± 5.42、28.78 ± 5.67、31.49 ± 5.79、34.1 ± 6.08、36.6 ± 6.70、40.81 ± 7.71，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時3 組細胞相對劃痕區(qū)域密度分別為14.54 ± 4.65、15.84 ± 4.60、16.88 ± 4.25、18.2 ± 3.94、19.98 ±4.13、20.99 ± 3.56、23.07 ± 3.60、25.36 ± 3.30、27.76 ± 2.84、30.18 ± 3.13、32.69 ± 3.09、35.64 ±3.03、38.52 ± 3.35、41.22 ± 3.51、46.15 ± 4.83，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時4組細胞相對劃痕區(qū)域密度分別為18.91 ± 2.74、20.39 ± 2.42、21.66 ± 2.41、23.05 ± 1.74、25.01 ±1.89、27.44 ± 1.11、29.95 ± 1.65、33.03 ± 1.94、35.71 ± 2.40、38.74 ± 2.92、41.97 ± 2.60、44.70 ±2.78、47.59 ± 3.10、51.18 ± 3.34、56.28 ± 2.64。

與4組比較，各培養(yǎng)時間1、2、3組細胞相對劃痕區(qū)域密度?。≒均＜0.05），隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)36 h 時細胞相對劃痕區(qū)域密度逐漸降低（F=76.110，P＜0.05）。

2.3 各組細胞凋亡率比較 培養(yǎng)48 h 時1、2、3、4組細胞的細胞凋亡率分別為12.08% ± 1.56%、50.07% ± 1.64%、71.03% ± 2.75%、3.82% ±0.49%，與4 組比較，培養(yǎng)48 h 時1、2、3 組細胞的細胞凋亡率高（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)48 h時細胞的細胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞線粒體膜電位比較 培養(yǎng)24 h 時1、2、3、4 組細胞的線粒體膜電位分別為0.79 ±0.18、0.70 ± 0.24、0.65 ± 0.11、1.11 ± 0.06，與4組比較，培養(yǎng)24 h 時1、2、3 組細胞的線粒體膜電位低（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)24 h時細胞的線粒體膜電位逐漸下降，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

2.5 各組細胞ROS 相對表達量比較 培養(yǎng)24 h時1、2、3、4 組細胞的ROS 相對表達量分別為5 541.67 ± 390.69、6 758.50 ± 235.87、13 534.00 ±710.99、5 458.33 ± 605.87，與4 組比較，培養(yǎng)24 h時2、3 組細胞的ROS 相對表達量高（P均＜0.05）。與2 組比較，培養(yǎng)24 h 時3 組細胞ROS 相對表達量高（P＜0.05）。

3 討論

肺癌的發(fā)病是一個復(fù)雜的過程［9］，目前肺癌療法的總體治療效果均不佳［3］?？拱╇氖悄壳霸诎l(fā)展中的抗癌藥物的一種類型，很多抗癌肽已經(jīng)進入臨床階段甚至已經(jīng)獲批上市［10］。提取自牛脾臟的多肽具有多種免疫活力，不僅可以緩解化療引起的免疫抑制［11］、改善小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的造血功能損傷［12］還可以可以通過ROS 促進肝癌細胞的凋亡［13］。同樣主要成分是提取自牛脾臟的多肽類藥物，脾氨肽口服液也因其抗癌活力受到了關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)而脾氨肽口服液不僅可以改善乳腺癌患者的預(yù)后還可以和含鉑藥物聯(lián)合治療結(jié)直腸癌［14］。但目前國內(nèi)外對脾氨肽口服液抑制肺癌的研究甚少，結(jié)合多肽類藥物多通過促進腫瘤細胞凋亡的方式，本研究通過檢測A549細胞的活力、凋亡以及遷移能力探究脾氨肽口服液抗肺癌的活力，并通過檢測JC-1 以及細胞內(nèi)ROS 的變化，評價脾氨肽口服液對肺癌細胞氧化應(yīng)激水平的影響，進一步解釋其抗癌作用的機制。

CCK-8 試劑常被用來測定細胞的活力、細胞增殖、細胞毒性等，在450 nm 波長處測定的吸光度越高，則細胞活力越強。從CCK-8 實驗可發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細胞A549的活力，并且隨著脾氨肽口服液給藥濃度的升高，細胞的活力下降的更加明顯，這也初步說明了脾氨肽口服液具有一定的抗肺癌作用。

為進一步證實脾氨肽口服液對肺癌的抑制作用，使用InCucyte S3對給藥后A549細胞增殖情況進行了實時的檢測，發(fā)現(xiàn)在給予脾氨肽口服液處理后的30 h內(nèi)A549細胞的細胞匯合度明顯下降，這代表著A549細胞的增殖受到了抑制，并且隨著劑量的增加，抑制的趨勢更加明顯，說明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細胞A549 細胞的增殖。此結(jié)果說明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細胞A549 細胞的增殖，也進一步證實脾氨肽口服液確實有抗癌活力。

惡性的腫瘤細胞具有經(jīng)淋巴道、血管或者體腔從原發(fā)部位到達機體的其他部位繼續(xù)生長的特點，因此在評價藥物對腫瘤細胞的作用時還會評價藥物對腫瘤細胞遷移能力的影響。劃痕實驗是評價細胞遷移能力的一種方式，通過InCucyte S3 對脾氨肽口服液處理的A549 細胞相對劃痕區(qū)域密度進行監(jiān)測與分析，發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液處理組A549細胞的相對劃痕區(qū)域密度明顯低于正常培養(yǎng)組，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。這表明發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以抑制A549細胞的遷移，進一步說明脾氨肽口服液不僅抑制了肺癌細胞的活力，還可以抑制肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，在治療肺癌中可以起到一定的作用。

綜合以上的活力實驗、增殖實驗和劃痕實驗的結(jié)果可以得出結(jié)論：脾氨肽口服液可以抑制人肺癌細胞A549 細胞的活力、增殖并降低其遷移能力，表明脾氨肽口服液有抑制腫瘤細胞發(fā)展的能力，能夠在肺癌治療中起到一定的作用。但其作用機制尚不明確，因此，在接下來的實驗中進一步對其抑癌作用的原理和機制進行探究。

抗腫瘤藥物的作用方式主要有促進腫瘤細胞凋亡、促進細胞壞死、抑制癌細胞DNA 合成等方式。大多數(shù)抗癌藥物是通過凋亡途徑抑制癌癥細胞的生長，結(jié)合多肽類藥物多通過促進腫瘤細胞凋亡的方式抑制癌癥，推測脾氨肽口服液可能通過凋亡途徑實現(xiàn)對腫瘤細胞的抑制。隨著細胞的凋亡，細胞質(zhì)膜內(nèi)部小葉上的磷脂酰絲酸會外翻到外部小葉，暴露在細胞外部，使用膜連蛋白（Annexin V）的熒光耦連物和活細胞非滲透染料PI 雙染對外翻的磷脂酰絲酸檢測。發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液處理24 h后磷脂酰絲酸外翻的A549 細胞數(shù)量增多，且呈現(xiàn)濃度依賴，這說明脾氨肽口服液可以促進A549 細胞的凋亡。細胞的凋亡是一個高度受控的復(fù)雜過程，是多個信號通路共同參與的結(jié)果，無法僅通過一種實驗方式對細胞凋亡進行全面的檢測，需要對脾氨肽口服液促進A549細胞凋亡的途徑進行進一步探索。

細胞凋亡的途徑分為內(nèi)在途徑和外在途徑，其內(nèi)在途徑主要與線粒體相關(guān)，也被稱為線粒體途徑。另一個細胞凋亡的典型特征就是線粒體活力受損。相較于磷脂酰絲酸的外翻，線粒體膜電位的改變是細胞凋亡的早期事件。進一步使用陽離子染料JC-1 對線粒體膜電位的變化進行了檢測，在線粒體中JC-1 會表現(xiàn)出電位依賴性的積累，當JC-1 染色后檢測到的紅色/綠色熒光強度比降低時，提示細胞內(nèi)線粒體功能下降，線粒體功能與細胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)。通過對脾氨肽口服液處理24 h 后的A549 細胞線粒體膜電位進行檢測，發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以促進A549細胞線粒體膜電位的去極化，一方面證實脾氨肽口服液促進了人肺癌上皮細胞A549的凋亡，另一方面也說明其促腫瘤細胞凋亡的機制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。

ROS 的過量積累會引起細胞的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細胞損傷、凋亡甚至壞死。ROS 主要來源于線粒體，其在線粒體中的產(chǎn)生主要是通過細胞呼吸鏈產(chǎn)生的，它是細胞凋亡的一個早期事件。細胞內(nèi)的ROS 和線粒體之間的關(guān)系是一個正反饋，當細胞凋亡時細胞內(nèi)的線粒體會釋放ROS，而環(huán)境中過高的ROS又會促使細胞凋亡［15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)從線蟲中分離出的多肽可以升高細胞內(nèi)的ROS 水平，破壞線粒體膜電位，誘導(dǎo)人紅白血病K526細胞凋亡。假設(shè)脾氨肽口服液可能也是通過提高細胞內(nèi)ROS 的水平促進線粒體膜電位去極化，進一步導(dǎo)致肺癌細胞凋亡，檢測細胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA的熒光值與細胞內(nèi)ROS 的水平呈正比，脾氨肽口服液培養(yǎng)24 h后A549 細胞DCFH-DA 的熒光值升高了，說明其促進了A549 細胞內(nèi)ROS 的釋放，并且隨著藥物濃度的增大，細胞內(nèi)ROS 升高的水平也隨之升高。證實了脾氨肽口服液是通過促進細胞內(nèi)ROS 水平的升高進一步破壞線粒體膜電位并實現(xiàn)使肺癌細胞凋亡的。

綜上所述，通過觀察脾氨肽口服液對人肺癌細胞系A(chǔ)549增殖、凋亡、遷移的影響，證實脾氨肽口服液可以抑制A549細胞的活力，進一步研究表明脾氨肽口服液是通過ROS 相關(guān)的線粒體途徑來誘導(dǎo)人肺癌細胞A549細胞的凋亡，抑制A549細胞的活力、增殖及遷移，發(fā)揮抗肺癌作用。