龔敏 陳明亮 金鵬 紀(jì)少凡 王朝政 李備

（1. 海南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)預(yù)警防控中心 海南?？?570100；2. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 海南海口 570100；3. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江杭州 311300；4. ?？诤ｊP(guān)技術(shù)中心/海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 海南?？?570311）

黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一類聚酮衍生的呋喃氧雜萘鄰?fù)?，產(chǎn)生并分布于農(nóng)作物生長、收獲、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)階段，常見的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2四種亞型，是目前具有最高生物學(xué)活性的毒素，毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[1]。研究表明，黃曲霉毒素在水產(chǎn)飼料中普遍存在[2-3]，并在水產(chǎn)生物體內(nèi)富集，造成水產(chǎn)生物飼料轉(zhuǎn)化率和抗病能力低、死亡率增加[4-6]。同時(shí)，水產(chǎn)生物在攝入被黃曲霉毒素污染的飼料后，其肌肉組織中存在毒素殘留風(fēng)險(xiǎn)[7]，影響消費(fèi)者的身體健康。2019 年11 月，水產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測(cè)被列入海關(guān)總署《2019 年度進(jìn)出口食品化妝品抽樣檢驗(yàn)及風(fēng)險(xiǎn)計(jì)劃》補(bǔ)充計(jì)劃，但目前尚無水產(chǎn)品中黃曲霉毒素殘留含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的黃曲霉毒素檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法和免疫親和層析凈化-液相色譜法，且現(xiàn)有的水產(chǎn)品中黃曲霉毒素檢測(cè)的文獻(xiàn)較少，前處理方法主要采用固相萃取凈化[8-9]，存在檢測(cè)過程繁瑣、耗時(shí)、成本高等問題，對(duì)其質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究亦鮮有報(bào)道。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用而達(dá)到除雜凈化的目的，具有快速、簡便、成本低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)[10]。本研究采用QuEChERS[11-12]結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，建立了一種水產(chǎn)品中4 種黃曲霉毒素殘留量的高效檢測(cè)方法，并對(duì)其可能的質(zhì)譜裂解機(jī)理進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；旋渦混勻器（廣州IKA 公司）；離心機(jī)（Eppendorf 公司）；G-285 電子天平（Mettler公司）。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純（德國默克公司）；中性氧化鋁、C18、PSA、佛羅里硅土吸附劑（迪馬科技）；QuEChERSEMR-Lipid（安捷倫公司）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2 標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于等于99%，購自天津阿爾塔）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)品采用甲醇作為溶劑，配制成25 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20℃下避光保存。

1.2.2 樣品處理 將粉碎勻漿后的樣品準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g），于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈渦旋震蕩提取5 min 后，加入5 g 無水硫酸鈉，渦旋震蕩混合1 min；以9 000 r/min 離心5 min，吸取1 mL 至玻璃試管中，加入100 mg 中性氧化鋁吸附劑，渦旋混合1 min 后，以5 000 r/min離心3 min，取上清液過濾膜（0.22 μm），待LCMS/MS 測(cè)定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；流速：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：5 mmol 乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度 500 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h，錐孔反吹氣流速150 L/h，碰撞氣體（氬氣）流量0.14 mL/min。質(zhì)譜優(yōu)化條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪。乙腈極性較大，作為提取溶劑時(shí)，蛋白質(zhì)、脂肪等難被提取出來，能夠有效減少提取過程中的共萃物，被作為QuEChERS 法常用的提取溶劑。黃曲霉毒素類化合物屬于弱極性化合物，4 種黃曲霉毒素均易溶于乙腈。分別考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，酸化乙腈的提取效果與直接采用乙腈作為提取溶劑的提取效果無顯著差異，故采用乙腈作為水產(chǎn)品中4 種黃曲霉毒素的提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

動(dòng)物源性樣品基質(zhì)復(fù)雜，脂質(zhì)干擾是影響檢測(cè)的重要因素，不僅會(huì)導(dǎo)致儀器對(duì)待測(cè)組分的靈敏度下降，還會(huì)縮短儀器和色譜柱的使用壽命，所以質(zhì)譜分析前應(yīng)進(jìn)行除脂凈化。本研究使用EMR-Lipid、C18、PSA、中性氧化鋁、佛羅里硅土對(duì)脂肪有一定吸附能力的吸附劑進(jìn)行凈化。結(jié)果表明，使用EMR-Lipid、C18 和佛羅里硅土作為吸附劑回收率偏低，尤其在使用佛羅里硅土凈化時(shí)，回收率不足50%；PSA 作為吸附劑雖然回收效果好，但在檢測(cè)黃曲霉毒素G2時(shí)不能有效除去譜圖中的雜質(zhì)峰，基線不平穩(wěn)，影響定量分析的準(zhǔn)確性。采用中性氧化鋁作為凈化劑時(shí)，4 種黃曲霉毒素的回收率好，基線平穩(wěn)，能夠滿足檢測(cè)需求，主要是由于中性氧化鋁作為吸附劑，分子表面可呈電中性，易吸附芳香族和脂肪胺等富電化合物，同時(shí)能夠保留含氧、硫、磷的基團(tuán)。經(jīng)中性氧化鋁凈化樣品和未凈化樣品檢測(cè)的黃曲霉毒素G2譜圖見圖1。不同凈化方式下，4 種黃曲霉毒素在羅非魚和對(duì)蝦中的添加濃度水平為10.0 μg/kg 時(shí)，回收率見圖2。

圖1 凈化前后羅非魚樣品中黃曲霉毒素G2 色譜圖

圖2 不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg 時(shí)的回收率

2.3 色譜條件選擇

分別考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相對(duì)峰形、響應(yīng)值等影響。結(jié)果表明：選擇0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，4 種黃曲霉毒素響應(yīng)值最高、峰形最好。所以選用 0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液乙腈作為流動(dòng)相體系，4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖3。UPLC 使用的超高壓色譜柱體積小，進(jìn)樣量過大容易產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，導(dǎo)致峰形變寬，出現(xiàn)前延峰；同時(shí)，進(jìn)樣量大小直接影響到儀器靈敏度和方法檢測(cè)限。本研究以5 ng/mL 的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，比較了進(jìn)樣量在2 、5、6、7、8、9、10 μL 時(shí)的峰形和響應(yīng)值變化。由圖4 可見，進(jìn)樣量大于5 μL時(shí)，峰形開始變寬，峰高不再隨進(jìn)樣量增大成比例增高，5 μL 為最佳進(jìn)樣量。

圖4 不同進(jìn)樣體積黃曲霉毒素B1 色譜圖

2.4 黃曲霉毒素的裂解機(jī)理研究

采用質(zhì)譜針泵直接注射黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，一級(jí)質(zhì)譜采用正離子掃描待測(cè)物的母離子，選用[M + H]+作為分子離子峰。經(jīng)氦氣轟擊分子離子后，利用二級(jí)質(zhì)譜對(duì)碎片離子進(jìn)行分析，選用豐度最高的2 個(gè)離子碎片作為子離子。通過質(zhì)譜對(duì)4 種黃曲霉毒素八組離子對(duì)可能的裂解過程進(jìn)行詳細(xì)分析。黃曲霉毒素的裂解機(jī)理見表3。

表3 黃曲霉毒素的裂解機(jī)理

表4 四種黃曲霉毒素的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系及檢出限

采用相對(duì)響應(yīng)值法（基質(zhì)中待測(cè)組分響應(yīng)/純?nèi)軇┲写M分響應(yīng)×100%）[13-14]對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：經(jīng)過中性氧化鋁凈化后，4 種黃曲霉毒素在水產(chǎn)品中的基質(zhì)添加回收率均在90%～100%，基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。4 種黃曲霉毒素在0.1～10.0 ng/mL 有良好的線性關(guān)系，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表 4。以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比（S/N）10 作為定量限，本方法的定量限為0.4 μg/kg。

2.6 回收率與精密度試驗(yàn)

采用羅非魚和對(duì)蝦樣品作為基質(zhì)，分別進(jìn)行低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做6 次平行試驗(yàn)，考察回收率和精密度。回收率及RSD見表5、6?；厥章试?3.1%～95.4%，RSD為2.0%～6.2%。

表5 羅非魚中4 種黃曲霉毒素不同添加濃度水平下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表6 對(duì)蝦中4 種黃曲霉毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

利用QuEChERS 結(jié)合UPLC—MS/MS，建立了水產(chǎn)品中4 種黃曲霉毒素的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法采用乙腈作為提取溶劑，中性氧化鋁為吸附凈化劑，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描，外標(biāo)法定量。通過分析結(jié)果可知，該檢測(cè)方法操作簡便、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，能滿足水產(chǎn)品中黃曲霉毒素的檢測(cè)要求。