蘇 昊，薛 潔，李維新*，任香蕓，林曉姿，梁璋成

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點實驗室（部省共建），福建 福州 350003；3.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350003；4.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

在葡萄酒的釀造工藝中，采用橡木桶陳釀是提升葡萄酒品質(zhì)的重要貯藏方式之一，其優(yōu)點一是在貯藏過程中葡萄酒與橡木充分接觸，橡木特有的風(fēng)味可以溶入到酒體中，二是橡木桶具有透氣性，空氣中的氧氣可以通過桶壁緩慢地溶入到酒中，與葡萄酒發(fā)生緩慢的微氧化反應(yīng)，可使葡萄酒中的單寧物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)，從而可以穩(wěn)定葡萄酒的色澤，提升葡萄酒口感和香氣[1-3]。橡木桶陳釀對葡萄酒的陳釀香氣的產(chǎn)生[4-5]、色澤的穩(wěn)定性[6]和口感的柔和度[7]都有非常重要的作用。但葡萄酒采用橡木桶陳釀存在造價高、重復(fù)使用效果差、裝桶和出桶無法機械化、需要定時添酒等缺陷。不銹鋼罐陳釀是葡萄酒大批量陳釀方式，具有安全、成本低、可機械化操作等特點，但因為不銹鋼貯藏葡萄酒與外界完全隔絕，空氣中的氧氣無法滲入，且不具有橡木桶的香氣，因此不銹鋼陳釀葡萄酒的效果不如橡木桶。葡萄酒的人工快速陳釀技術(shù)如微波處理[8-10]、電磁場陳釀[11-12]、微氧處理[13-14]、超高壓處理[15-16]、超聲處理[17]等，其效果與橡木桶自然陳釀相比仍然具有差距，且存在食品安全隱患。采用人工催陳或添加橡木片結(jié)合微氧處理等技術(shù)來縮短葡萄酒的陳釀時間、加速葡萄酒的成熟成為近年來葡萄酒陳釀技術(shù)研究的熱點[18]。

陶缸是由特殊的泥土材料燒制，具有橡木桶類似的透氣性能，因此在陳釀酒類產(chǎn)品時，也可以使少量的氧氣緩慢地溶入到酒體中[19-20]。同時，陶缸壁中存在著銅、鈣、鐵等離子，對酒類的酯化、醇醛縮合等有一定的催化作用，在溶入氧的作用下可以加速酒體的陳化[21]。因此，陶缸存貯是中國傳統(tǒng)白酒及黃酒的主要陳釀方式，目前仍然被大多數(shù)企業(yè)廣泛采用[22]。傳統(tǒng)土陶缸為防止?jié)B漏，都采用缸體內(nèi)外雙面上釉，因此其透氣性比橡木桶的透氣性能要差；缺少進出酒的閥門不宜機械化操作。伴隨土陶缸加工技術(shù)的進步，目前研發(fā)出了新型的陶缸，可以實現(xiàn)不上釉、配備不銹鋼閥門、密封蓋等，極大地提高了陶缸的透氣性能和使用的便利性，并可實現(xiàn)進出酒的機械化，降低人工成本[23]。

本研究分別以玻璃缸（不透氣）、橡木桶為對照，研究無釉陶缸陳釀葡萄酒過程酒體中溶解氧含量的變化規(guī)律，分析無釉陶缸協(xié)同不同添加量的不定型橡木片處理對葡萄酒的主要營養(yǎng)品質(zhì)及揮發(fā)性成分的影響，并基于揮發(fā)性風(fēng)味成分結(jié)果進行正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。旨在為葡萄酒的新型陳釀技術(shù)提供技術(shù)支撐，在葡萄酒的仿橡木桶陳釀、降低陳釀成本、提高陳釀效率等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

葡萄酒（桂葡1號）：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所。不定型橡木片（7～15 mm，中度熏烤）（不規(guī)則的小橡木片）：天津博尼酒業(yè)貿(mào)易有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜鹽酸、氯化鈉、醋酸（HAc）、醋酸鈉（NaAc）（均為分析純）：濟寧博誠化工有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：四川省維克奇生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

玻璃瓶（5L）：江蘇匯達(dá)醫(yī)療器械有限公司；橡木桶（5 L，中度熏烤）：天津博尼酒業(yè)貿(mào)易有限公司；無釉陶缸（5 L）：四川省榮縣雙龍?zhí)諛I(yè)有限公司；Oxysense Gen III型溶解氧測定儀：美國Oxysense Inc公司；SPX-250BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PHS-3C數(shù)字式酸度計：上海埃依琪實業(yè)有限公司；TQ8040三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取頭：美國SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 不同容器陳釀葡萄酒對其溶解氧含量的影響

桂葡1號葡萄酒分別裝入5L玻璃瓶、5L橡木桶、5 L無釉陶缸中，滿罐貯藏，橡膠塞緊，插入溶解氧探頭，置于20℃環(huán)境條件下，每15 d檢測一次酒體中溶解氧含量，連續(xù)檢測180 d。

1.3.2 無釉陶缸協(xié)同橡木陳釀處理對葡萄酒品質(zhì)指標(biāo)的影響

無釉陶缸（5 L）15只，分別裝入桂葡1號葡萄酒，并添加中度熏烤的橡木片，添加量為0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L，以5 L橡木桶為對照處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)。貯藏12個月后，檢測陳釀葡萄酒的酒精度、pH值、總酸、花青素、花色苷及總酚等主要品質(zhì)。

1.3.3 無釉陶缸協(xié)同橡木陳釀處理對葡萄酒香氣成分的影響

經(jīng)1.3.2節(jié)結(jié)果分析確定無釉陶缸陳釀葡萄酒適宜的橡木片添加量，后將添加適宜量橡木的無釉陶缸及橡木桶同時裝滿葡萄酒，并置于20 ℃環(huán)境下貯藏12個月，采用GC-MS方法對兩種陳釀處理12個月的酒樣進行香氣成分分析。

1.3.4 測定方法

（1）理化指標(biāo)測定

溶解氧含量檢測：Oxysense Gen III溶氧儀測定。原花青素含量的檢測：參考LISJAK K等[24]的方法；多酚含量的檢測：采用Folin-ciocalteu法[25]；總糖、酒精度等其他指標(biāo)的測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

游離花色苷含量的測定：采用OHNSON J等[26]的方法，并稍加修改。待測酒樣分別用HCl-NaCl緩沖液（pH=1.0）和HAc-NaAc緩沖液（pH=4.5）稀釋50倍，掃描吸收峰，在最大吸收波長處和700 nm處測定吸光度值。吸光度值A(chǔ)計算公式如下：

A=（Amax-A700nm）pH1.0-（Amax-A700nm）pH4.5

葡萄酒中游離花色苷含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，CGE）來表示：

式中：MW為CGE分子質(zhì)量，449.6；DF為酒樣的稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)，29 600。

（2）揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測

將待測葡萄酒酒樣的酒精度稀釋至6%vol（20 ℃，V/V），量取6 mL樣液，加入20 mL的頂空瓶中。使用萃取頭在50 ℃條件下吸附40 min，250 ℃解吸7 min，用于GC-MS測定。

氣相色譜條件：TG-WAXMS色譜柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm），進樣口的溫度為250 ℃。程序升溫如下：40 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫到100 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min。載氣為高純氦氣（He）（＞99.999%），不分流，流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子化方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，發(fā)射電流為50 μA，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，掃描范圍為33～400 amu。

定性定量方法：采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)庫比對，用GC-MS化學(xué)工作站進行數(shù)據(jù)分析，對相似度＞80%的化合物進行定性。采用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2018繪制圖形，采用SIMCA 14.1進行香氣成分的偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同容器陳釀葡萄酒對其溶解氧含量的影響

葡萄酒在陳釀期間其酒體中溶解氧的含量對葡萄酒的成熟控制至關(guān)重要，過低陳釀時間變長，過高葡萄酒易氧化褐變。為了解橡木桶及無釉陶缸陳釀葡萄酒的微氧作用，以不透氣的玻璃瓶為對照，分別檢測了玻璃瓶、橡木桶、無釉陶缸陳釀葡萄酒期間溶解氧含量的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 不同貯藏容器陳釀葡萄酒溶解氧含量的變化Fig.1 Changes of dissolved oxygen contents in wine aged in different storage containers

由圖1可知，桂葡1號葡萄酒在陳釀的前期（60 d內(nèi)），3 種容器內(nèi)的溶解氧含量均急劇下降，玻璃瓶貯藏的葡萄酒中溶解氧下降最多，下降了76.43%；無釉陶缸中的溶解氧次之，下降了52.94%，橡木桶中葡萄酒溶解氧含量則下降了43.53%。葡萄酒中溶解氧在前期下降較快，其主要原因是新鮮的葡萄酒中含量較高含量的酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)極易和氧發(fā)生氧化反應(yīng)，從而使葡萄酒中溶解氧含量迅速下降。

貯藏期在75～180 d各處理組葡萄酒內(nèi)溶解氧含量保持相對穩(wěn)定，其中，橡木桶陳釀的葡萄酒溶解氧含量保持在0.33～0.38 mg/L，無釉陶缸處理為0.30～0.35 mg/L；玻璃瓶處理的溶解氧含量最低，為0.18～0.20 mg/L。在貯藏后期，葡萄酒中的可氧化物質(zhì)基本穩(wěn)定，其溶解氧的消耗較少，加之橡木桶和陶缸的透氣作用，使葡萄酒中的溶解氧含量維持在一個較低的動態(tài)平衡狀態(tài)。相反，由于玻璃瓶不具備透氣作用，其中的溶解氧一直處于一個較低的水平上。結(jié)果表明，無釉陶缸具有類似橡木桶的透氣性，其在陳釀葡萄酒的過程中，與橡木桶陳釀的酒樣具有相似的溶解氧含量。

2.2 無釉陶缸協(xié)同橡木處理對葡萄酒陳釀品質(zhì)的影響

2.2.1 無釉陶缸協(xié)同橡木處理對葡萄酒理化指標(biāo)的影響

不同陳釀處理1年對葡萄酒理化指標(biāo)的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，桂葡1號葡萄酒的總酸較高，在處理前為9.16 g/L，酸感較強。經(jīng)過陳釀后，不同處理的總酸均有顯著下降（P＜0.05），其中，無釉陶缸協(xié)同橡木片處理和橡木桶陳釀葡萄酒的總酸下降幅度較大，均減少了10%左右。表明在葡萄酒的陳釀過程中，其有機酸可能存在和醇類的酯化作用，并伴隨有機酸的降解，且橡木處理有助于有機酸的降解。在陳釀過程葡萄酒的酒精度、總糖略微下降，除沒有添加橡木片處理外，其余各處理間差異不顯著。各處理葡萄酒中總糖含量的顯著減少主要是糖和氨基酸發(fā)生了緩慢的美拉德反應(yīng)（P＜0.01或P＜0.05）；酒精度的顯著減少一方面是陶缸和橡木桶的透氣作用導(dǎo)致?lián)]發(fā)損失（P＜0.01或P＜0.05），另一方面是乙醇參與了酯化作用的結(jié)果。

表1 不同處理對葡萄酒理化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of different treatments on physicochemical indexes of wine

各個處理的葡萄酒中的總酚含量在貯藏12個月后均顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），其中沒有添加橡木片的處理總酚下降最多，由初始的1.49 g/L下降到1.03 g/L，下降了30.87%；而添加橡木片的處理和橡木桶陳釀的酒樣總酚含量下降幅度均比對照小，最高達(dá)到1.30 g/L以上，比對照處理的提高了26.21%，這是因為橡木片或橡木桶中的酚類物質(zhì)被浸提到葡萄酒中的緣故，其中0.4 g/L橡木片處理的總酚與橡木桶處理的差異不顯著（P＞0.05）。各個處理的游離花色苷和原花青素均顯著下降（P＜0.01或P＜0.05），陳釀12個月后，陶缸處理的游離花色苷保持率為77.00%～79.72%，保持率最高的是0.4 g/L橡木片處理；橡木桶處理的保持率為76.37%。陶缸協(xié)同橡木片處理的原花青素從處理前的2.05 g/L下降到1.58 g/L左右，而橡木桶處理的則下降到1.36 g/L。原花青素與游離花色苷是葡萄酒中的一大類多酚類化合物，其含量、種類、結(jié)構(gòu)及聚合度與葡萄酒的品質(zhì)密切相關(guān)，原花青素與游離花色苷對葡萄酒的顏色穩(wěn)定和葡萄酒味感起到重要作用。通過不同添加量的橡木片結(jié)合陶缸處理結(jié)果表明，無釉陶缸結(jié)合0.4 g/L中度熏烤的橡木片來陳釀葡萄酒，具有類似橡木桶的陳釀效果，其對陳釀葡萄酒的酒精度、總糖、總酸等主要品質(zhì)的影響較小，與橡木桶陳釀相比，能提高并豐富葡萄酒中多酚、花青素、花色苷的含量，這主要是因為陶缸的透氣性能稍弱于橡木桶，且添加的橡木片完全浸泡在酒體中，橡木片中的單寧等酚類物質(zhì)更容易浸出到酒體中，這些酚類物質(zhì)和花青素及花色苷等更容易形成穩(wěn)定的結(jié)合物。

2.2.2 無釉陶缸協(xié)同橡木處理對葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

香氣是評判葡萄酒品質(zhì)和陳釀效果的重要評價指標(biāo)之一。無釉陶缸（添加0.4 g/L橡木片）及橡木桶2種方式陳釀12個月后葡萄酒酒樣的揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖見圖2。結(jié)合峰面積歸一化法計算各香氣成分的相對含量，結(jié)果見圖3。

圖2 陶缸結(jié)合橡木片和橡木桶陳釀葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile flavor components in wine aged in pottery jar with oak chips and oak barrel analysis by GC-MS

圖3 陶缸結(jié)合橡木片（A）及橡木桶（B）陳釀葡萄酒主要香氣成分及相對含量Fig.3 Main aroma components and relative contents of wine aged in pottery jar with oak chips (A) and oak barrel (B)

酯、醇、酸、烯、酮等是葡萄酒香氣的主要呈香物質(zhì)，它們的含量、感覺閾值及其相互作用共同構(gòu)成葡萄酒獨特的香氣，決定著葡萄酒的風(fēng)味和典型性。由圖3A可知，經(jīng)3次重復(fù)試驗組（t1、t2、t3），從陶缸協(xié)同橡木片陳釀的葡萄酒中共檢測出揮發(fā)性成分104種，其中酯類物質(zhì)38種，總相對含量為40.56%；高級醇類物質(zhì)21種，總相對含量23.45%。

由圖3B可知，經(jīng)3次重復(fù)試驗組（x1、x2、x3），從橡木桶陳釀的葡萄酒中，共檢測出揮發(fā)性成分110種，其中酯類物質(zhì)42種，總相對含量40.96%；高級醇類物質(zhì)27種，總相對含量30.21%。

無釉陶缸陳釀和橡木桶陳釀的葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的對比分析，發(fā)現(xiàn)二者相同的揮發(fā)性成分達(dá)64種，相對含量分別占各自總含量的97.26%和97.86%，其中具有典型香氣特征的酯類物質(zhì)相同的有24種，包括2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、丁二酸二乙酯、琥珀酸乙酯等，表明二者香氣特征相似。

2.3 無釉陶缸協(xié)同橡木處理葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的正交偏最小二乘-判別分析

基于無釉陶缸協(xié)同橡木處理葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的OPLS-DA，結(jié)果見圖5。由圖5可知，葡萄酒經(jīng)橡木桶和無釉陶缸協(xié)同橡木片的陳釀后明顯區(qū)別于新酒（陳釀前），其分布在不同的區(qū)域，且分離較遠(yuǎn)；而橡木桶陳釀與無釉陶缸協(xié)同橡木片陳釀的葡萄酒的主要香氣物質(zhì)分布在同一區(qū)域，且有交叉混合，進一步表明二者有著相似的香氣特征。

圖5 基于主要香氣物質(zhì)的正交偏最小二乘-判別分析Fig.5 Orthogonal partial least squares discrimination analysis based on main aromatic substances

3 結(jié)論

在本研究中，以不透氣的玻璃容器為對照，研究無釉陶缸和橡木桶陳釀葡萄酒過程中酒體中溶解氧的變化，結(jié)果表明，葡萄酒在陳釀的前期，陳釀容器內(nèi)的溶解氧含量均急劇下降，后期較為穩(wěn)定。無釉陶缸陳釀葡萄酒的溶解氧含量變化規(guī)律與橡木桶類似，其穩(wěn)定期溶解氧含量維持在0.30～0.35 mg/L，與橡木桶差異不顯著。無釉陶缸結(jié)合0.4 g/L中度熏烤的橡木片來陳釀葡萄酒，具有類似橡木桶的陳釀效果，其對陳釀葡萄酒的酒精度、總糖、總酸等主要品質(zhì)的影響較小，與橡木桶陳釀相比，能提高并豐富葡萄酒中多酚、花青素、花色苷的含量。無釉陶缸陳釀和橡木桶陳釀的葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的對比分析，發(fā)現(xiàn)二者相同的揮發(fā)性成分多達(dá)有64種，相對含量分別占各自總含量的97.26%和97.86%，其中具有典型香氣特征的酯類物質(zhì)相同的有24種，表明二者有著相似的香氣特征。OPLS-DA結(jié)果表明，經(jīng)橡木桶和無釉陶缸協(xié)同橡木片的陳釀后葡萄酒差異不大，但明顯區(qū)別于新酒。無釉陶缸結(jié)合不定型橡木片對葡萄酒的陳釀是可行的，具有實際應(yīng)用前景。