陳心萍，胡春容，藍 夢，薛楚恩，張明歡，黃櫪嬌，何海燕，3，4，5，覃擁靈，3，4，5*

（1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 河池 546300；2.康泰生物制品股份有限公司，廣東 深圳 518000；3.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院 微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室，廣西 河池 546300；4.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院 廣西蠶桑生態(tài)學(xué)與智能化技術(shù)應(yīng)用重點實驗室，廣西 河池 546300；5.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院 廣西現(xiàn)代蠶桑絲綢協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 河池 546300）

生物防治技術(shù)是減少真菌及其毒素污染的最有前途和最有效的方法[1]，其中利用具有抑菌活性的微生物來抑制食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)原料生產(chǎn)和儲藏過程中微生物的污染，從源頭控制產(chǎn)毒微生物的增殖，是最大程度的減少真菌及毒素危害的有效途徑[2]。動物飼料中添加抗生素會給環(huán)境和人類健康帶來無法過量的危害，為了人類食品安全，我國《飼料和飼料添加劑管理條例》規(guī)定從2020年起飼料中全面禁止添加抗生素，尋找合適的抗生素替代品對飼料工業(yè)至關(guān)重要[3]。發(fā)酵飼料是指飼料原料中添加具有抑菌活性的微生物品種，飼料原料經(jīng)過微生物發(fā)酵處理后，可有效增加營養(yǎng)價值，發(fā)酵飼料中添加具有抑菌活性的微生物可以抑制動物腸道內(nèi)的有害微生物的繁殖與生產(chǎn)，起到替代抗生素的效果[4]。在飼料中添加具有抑菌活性的微生物菌種，可以提高動物免疫力，改善動物腸道菌群、促進動物生長[5-6]。

當(dāng)前可用于發(fā)酵飼料的微生物種類主要包括真菌和細(xì)菌兩類[7]。細(xì)菌是重要的工業(yè)用菌種，其中發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）也可用于發(fā)酵飼料[8-9]。酵母菌（yeast）屬于真菌，廣泛添加在動物飼料劑中[10]。芽孢桿菌（Bacillus）通過發(fā)酵可產(chǎn)生纖維素酶、脂肪酶和淀粉酶等酶活較高的酶，也被用于發(fā)酵飼料[11-12]。放線菌是生產(chǎn)抗生素的主要菌種，在飼料、醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用[13]。天然生物防腐劑在抑制食品微生物生長的同時，又不會影響食品的營養(yǎng)和品質(zhì)特性，防止化學(xué)防腐劑的污染，安全有效的延長食品的保質(zhì)期[14]。對天然生物防腐劑在食品中的應(yīng)用，也成為了研究熱點[15]。因此菌種的合理選擇是提高發(fā)酵效率的關(guān)鍵，也是發(fā)酵飼料品質(zhì)的前提與關(guān)鍵[16]。因此有必要篩選在飼料中添加的具有抑菌作用的菌株。

本研究開展對致病菌具有較好抑菌作用的菌株篩選工作，并通過形態(tài)特征及生理生化特征觀察，結(jié)合分子生物學(xué)對菌株進行鑒定。曲霉是飼料中常見的微生物污染物，本研究利用米曲霉（Aspergillus oryzae）作為指示菌種，利用單因素試驗及正交試驗設(shè)計優(yōu)化菌種產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件，旨在分離篩選出能在飼料中添加的具有抑菌作用的菌種，以替代抗生素在飼料中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 指示菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）：保存于河池學(xué)院微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基[17]（用于放線菌培養(yǎng)）：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g，pH值7.4～7.6，蒸餾水1000mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[19]（用于真菌培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[17]（用于細(xì)菌培養(yǎng)）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基[18]（用于大腸桿菌培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7。

發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：NaCl0.2g，葡萄糖1.0g，可溶性淀粉5.0 g，MgSO40.5 g，K2HPO40.5 g，玉米粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

察氏培養(yǎng)基[20]：0.05% MgSO4·7H2O、0.2% NaNO3、2%瓊脂粉、0.05%KCl、0.1%K2HPO4、3%蔗糖、0.01%FeSO4·7H2O、蒸餾水1 000 mL。

淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基[21]：（NH4）2SO42.0 g，CaCO33.0 g，K2HPO41.0 g，可溶性淀粉10.0 g，MgSO47H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

Emerson培養(yǎng)基[22]：葡萄糖20 g，牛肉膏4.0 g，NaCl 2.5 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨4.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

氯化鈉、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、硫酸鎂、七水硫酸鎂、葡萄糖（均為分析純）、蛋白胨（生化試劑）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；酵母膏（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂（生化試劑）：上海潤捷化學(xué)制劑有限公司；七水硫酸鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；重鉻酸鉀（分析純）：汕頭市西隴化工有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京奧博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX51顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Infinite M200PRO全波長酶標(biāo)儀、PHS-3B型pH儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AvantiJE落地式離心機、Microfuge 20R高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；ZXSD-A1160生化培養(yǎng)箱、ZWY-2102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；JM-B5107電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司；G100M25 MSL-W1格蘭仕微波爐：廣東格蘭仕微波生活電器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集及預(yù)處理

土樣采集[23-24]：在廣西宜州的流河寨、會仙山、楓樹林等不同地點，采集離地面下5～15 cm處的土壤，每個不同地點分別采集3份土樣，共9份土樣。

土樣預(yù)處理：采集的土壤放于通風(fēng)處自然風(fēng)干，每份各100 g左右，放進烘箱120 ℃烘2 h，除去大部分雜菌[23-25]。

1.3.2 菌株分離與純化

稱取經(jīng)過預(yù)處理的土樣10 g放入三角瓶中，加90 mL無菌水，參照徐麓凱等[26]的方法，分別制成10-3～10-6的稀釋液。向高氏一號培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為50 μg/mL的K2Cr2O7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，取0.1 mL稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液，涂布高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，時間7 d，待長出菌后，對單菌落進行反復(fù)平板劃線純化得到單菌落。

1.3.3 菌株的篩選[26]

將指示菌金黃色葡萄球菌、米曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別涂布接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基上，28 ℃進行活化培養(yǎng)2 d。將純化好的菌株接在平板上，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d，待其生長好后，挑取7 mm×7 mm菌塊，接到帶有指示菌的平板上。于28 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，采用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小，抑菌圈直徑越大說明抑菌效果越強。

1.3.4 菌株的鑒定

（1）菌株形態(tài)學(xué)觀察

配制高氏一號培養(yǎng)基，經(jīng)過滅菌后，在無菌環(huán)境下倒平板，平板凝固后，每皿接種培養(yǎng)好的目的菌株，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，觀察菌株生長情況、革蘭氏染色情況以及菌株顯微形態(tài)[24，27-29]。

（2）生理生化鑒定

依據(jù)參考文獻[25-26]，完成吲哚試驗、V.P試驗、甲基紅試驗硫化氫產(chǎn)生試驗、淀粉水解試驗、接觸酶反應(yīng)、碳源利用試驗、明膠液化試驗。

（3）分子生物學(xué)鑒定[30]

菌體總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提?。盒迈r培養(yǎng)的菌絲加入液氮，在研缽中充分研磨變成粉末，總DNA的提取參照MICHAELSON L V等[31]的方法進行。以菌株Ls2的基因組總DNA為模板，使用通用引物進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列。PCR引物按WHITE T J等[32]報道設(shè)計，引物ITS1的序列：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，引物ITS4的序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR擴增體系為：10×ExTaqbuffer（TaKaRa Bio）5 μL，菌體總DNA2 ng，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）1 μL，20 μmol/L的ITS1引物和ITS4引物各0.5 μL，ExTaqTM聚合酶（TaKaRa Bio）2 μL，加去離子水補足至50 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR產(chǎn)物，對ITS基因片段測序，將測序結(jié)果登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站用GenBank數(shù)據(jù)庫基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較。檢索得到的同源性較高的序列，使用MEGA 5.0軟件鄰位連接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化[35]

（1）單因素試驗

設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為2.0%玉米粉、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵時間8 d、初始pH 7、裝液量100 mL/250 mL、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200 r/min，通過改變單一變量在不同發(fā)酵條件下培養(yǎng)，考察2.0%氮源（酵母膏、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨）、發(fā)酵時間（2d、5d、8d、11 d、14d）、發(fā)酵溫度（21℃、24℃、27℃、30℃、33 ℃）、初始pH（5、6、7、8、9）、裝液量（50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL）、轉(zhuǎn)速（160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min）等不同發(fā)酵條件下對米曲霉的抑菌圈直徑大小的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對試驗結(jié)果影響較大的因素，利用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1，設(shè)計3因素3水平的正交試驗L9（34）并進行數(shù)據(jù)分析，對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)與分析

單因素試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016繪圖，正交試驗利用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1進行直觀分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

從廣西宜州的流河寨、會仙山、楓樹林等地方共采集9份土樣，通過平板法篩選出對4種指示菌具有明顯抑菌作用的3株菌，分別命名為Ls2、Hw3、Fh7，對這3株菌的抑菌作用進行測定，結(jié)果見表2。

由表2可知，3株菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，而對其他3種病原菌的抑制效果較強。其中菌株Ls2對4種指示菌的抑菌圈較大，其發(fā)酵上清液對米曲霉生成的抑菌圈直徑為30.12 mm，是3株菌中抑菌效果最好的，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有抑菌作用，抑菌直徑分別為23.92 mm，22.68 mm和18.13 mm，因此選擇菌株Ls2開展試驗，該菌株對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，對米曲霉的抑菌圈的直徑最大，因此后續(xù)選擇對米曲霉的抑菌圈直徑為評價指標(biāo)。

2.2 菌株Ls2鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

菌株Ls2在高氏一號培養(yǎng)基上觀察結(jié)果見圖1。由圖1可知，表面生長緊密，呈乳白色、菌落比較干燥、表面粗糙、邊緣整齊、微隆起，有色素產(chǎn)生。經(jīng)革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌。在光學(xué)顯微鏡下，菌體呈菌絲狀，氣生菌絲豐富，且不易斷裂。

圖1 菌株Ls2的菌落（a）和菌絲（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and mycelium (b) morphology of strain Ls2

2.2.2 菌株Ls2的生理生化試驗結(jié)果

菌株Ls2的生理生化試驗結(jié)果見表3。由表3可知，甲基紅試驗接觸酶實驗、明膠液化試驗結(jié)果為陽性，能夠利用麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉。吲哚試驗無紅色現(xiàn)象出現(xiàn)，菌株不能產(chǎn)生硫化氫和淀粉酶。根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生理生化試驗判斷該菌為鏈霉菌類的球孢類群[36]。

表3 菌株Ls2的生理生化鑒定及碳源利用結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical identification and carbon source utilization of strain Ls2

2.2.3 菌株Ls2的分子生物學(xué)鑒定

以菌株Ls2的基因組總DNA為模板，使用通用引物進行PCR擴增，得到約1 388 bp的PCR產(chǎn)物片段。將測序結(jié)果結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站BLAST比對，下載序列相近的菌種，通過Mega7軟件采用鄰近法構(gòu)建菌株Ls2的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2系統(tǒng)進化樹表明，菌株Ls2和青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）在處于同一分支，同源性為92%。依據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定，確定菌株Ls2為青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）。

圖2 基于ITS基因序列菌株Ls2的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Ls2 based on ITS gene sequence

2.3 菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 不同氮源對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

考察2%添加量的不同氮源對發(fā)酵液抑菌作用的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，以黃豆餅粉作為氮源時，菌株產(chǎn)對米曲霉的抑菌活性物質(zhì)最多，發(fā)酵效果最好，對米曲霉的抑菌圈直徑達到最大，為32.56 mm，玉米粉次之，蛋白胨和酵母膏抑菌作用較差。因此選擇最佳氮源為2%黃豆餅粉。

圖3 不同的氮源對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.2 不同發(fā)酵時間對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖4。由圖4可知，菌株Ls2第1天沒有抑菌活力，在發(fā)酵第2天開始具有抑菌活力，隨著發(fā)酵時間增加，抑菌能力逐步加強，發(fā)酵到第5天菌株抑菌能力最強，對米曲霉的抑菌圈直徑為33.12 mm。5 d后抑菌能力開始有較明顯的下降趨勢，在11 d后趨于平緩。培養(yǎng)時間長碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)消耗多，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏影響菌體生長，導(dǎo)致抑菌活性物質(zhì)減少。因此，最佳發(fā)酵時間為5 d。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.4 Effect of fermentation time on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.3 不同發(fā)酵溫度對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對菌株Ls2產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵溫度21～27 ℃時，會延長菌體發(fā)酵時間，菌種生長受到影響，嚴(yán)重影響到發(fā)酵的效率，從而對抑菌物質(zhì)的合成有一定的影響；隨發(fā)酵溫度增高，菌種生長逐漸變好，發(fā)酵溫度為30 ℃時，菌種生長良好，抑菌能力最強，抑菌圈直徑為31.08 mm；發(fā)酵溫度超過30 ℃時，會導(dǎo)致微生物體內(nèi)的酶失活，對菌種生長有不良影響，導(dǎo)致抑菌物質(zhì)合成的產(chǎn)量降低或改變其抑菌性能，隨著溫度的升高，抑菌能力明顯降低[37]。因此，最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.4 不同初始pH值對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

初始pH值對菌株Ls2產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，如果發(fā)酵液初始pH值＞7，發(fā)酵液整體的內(nèi)環(huán)境呈堿性，降低了菌株Ls2對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及利用率，pH值過大或過小，生產(chǎn)的抑菌物質(zhì)越少，導(dǎo)致菌體多種酶的活性降低，從而影響菌體的生長狀況，導(dǎo)致產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)降低[37]。當(dāng)pH為7時菌種生長良好，所產(chǎn)發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑最大，達到32.13 mm。因此，發(fā)酵液最佳初始pH值為7。

圖6 初始pH值對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.6 Effect of initial pH on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.5 不同裝液量對Ls2菌株發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

不同裝液量對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖7。由圖7可知，隨著裝液量的增加，抑菌圈直徑呈先上升后下降的趨勢，裝液量少時營養(yǎng)物質(zhì)不足，將影響菌種生長及抑菌物質(zhì)合成。當(dāng)裝液量為125 mL/250 mL時，菌種將獲得較充足氧氣及生長飼料，菌種生長良好，所產(chǎn)發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑為32.74 mm，如果裝液量超過125 mL/250 mL，導(dǎo)致氧氣供給不足，將影響菌種生長及抑菌物質(zhì)合成。因此，最佳裝液量為125 mL/250 mL。

圖7 裝液量對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.7 Effect of liquid loading volume on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.6 不同轉(zhuǎn)速對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

不同轉(zhuǎn)速對菌株Ls2發(fā)酵產(chǎn)抑菌抑菌物質(zhì)的影響見圖8。由圖8可知，抑菌圈隨著轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，轉(zhuǎn)速為220r/min時，提供氧氣較充足，菌株Ls2生長良好，發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑為32.65 mm。如果轉(zhuǎn)速低于220 r/min，轉(zhuǎn)速慢，供氧不足，將影響菌種生長及抑菌物質(zhì)合成。如果轉(zhuǎn)速高于220 r/min，過快轉(zhuǎn)速導(dǎo)致菌種破裂死亡，將影響菌種生長及抑菌物質(zhì)合成。因此，菌株Ls2培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖8 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.8 Effect of rotating speed on bacteriostasis of fermentation broth

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇影響結(jié)果比較大的發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH（C）為試驗因素，設(shè)置（D）為空白，以抑菌圈直徑為評價指標(biāo)開展正交試驗，試驗結(jié)果及方差分析分別見表4和表5。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表5 正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，RA＞RC＞RB，可以看出影響菌株發(fā)酵的3個因素中，對發(fā)酵影響的順序為發(fā)酵時間＞初始pH＞發(fā)酵溫度。A3B3C2為最優(yōu)發(fā)酵組合，即發(fā)酵時間為8 d，發(fā)酵溫度為33 ℃，初始pH為7在此條件下，發(fā)酵液抑菌圈直徑由優(yōu)化前的30.12 mm擴大到38.82 mm。

由表5可知，3個因素中發(fā)酵時間對抑菌效果的影響顯著（P＜0.05）。其余兩個因素對抑菌效果的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本文對宜州的流河寨采集的9份土樣進行篩選分離，分離篩選得到3株對4種病原菌的有抑制效果的菌株，分別命名為Ls2、Hw3、Fh7，3株菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，而對其他3種病原菌的抑制效果較強，其中菌株Ls2對4種指示菌的抑菌圈較大。經(jīng)過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性觀察以及分子生物學(xué)鑒定，鑒定菌株Ls2為青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基添加2%黃豆餅粉，發(fā)酵時間8 d，初始pH7，發(fā)酵溫度33 ℃，裝液量125 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min。在此發(fā)酵條件下，菌株Ls2對米曲霉的抑菌圈直徑為38.82 mm，青藍鏈霉菌Ls2對一些致病菌具有較好抑菌效果，具有添加生產(chǎn)發(fā)酵飼料的潛能。