劉仕洋，王玉榮，李學(xué)思，管桂坤，劉 宇，李富強(qiáng)，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東 蘭陵 277731；4.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 周口 477262）

作為中國(guó)市場(chǎng)銷售量最高的白酒，濃香型白酒因其獨(dú)特的釀造工藝和醇厚的口感而享有良好的聲譽(yù)[1]。在濃香型白酒生產(chǎn)中，中高溫大曲是不可缺少的糖化發(fā)酵劑，是一個(gè)富含多酶、多菌和多物質(zhì)的微型資源庫(kù)，具有糖化發(fā)酵生香的作用[2]。大曲在制作過(guò)程中采用開(kāi)放式發(fā)酵，使其充分網(wǎng)羅了制曲周圍環(huán)境中的各種微生物，主要包括細(xì)菌和真菌[3]。在大曲發(fā)酵過(guò)程中，真菌能夠產(chǎn)酯、產(chǎn)酶和生香[4]，其中霉菌為大曲提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力以及多種有機(jī)酸等物質(zhì)[5]，而酵母菌為大曲提供發(fā)酵力，不僅主導(dǎo)了酒精的產(chǎn)生，而且產(chǎn)生大量風(fēng)味化合物[6]。楊少勇等[7]采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)湖北襄陽(yáng)地區(qū)中高溫大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)大曲真菌屬以嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為主。李靜心等[8]采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)安徽省北部地區(qū)大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)中高溫大曲真菌屬以Aspergillus、伊薩酵母屬（Issatchenkia）和覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）為主。吳樹(shù)坤等[9]采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)四川地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)大曲真菌屬以Thermomyces、Aspergillus、Thermoascus、絲衣霉屬（Byssochlamys）和節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）為主。由此可見(jiàn)，不同地域環(huán)境會(huì)對(duì)大曲內(nèi)部所含真菌的類群產(chǎn)生一定影響，因而增加中高溫大曲的采集來(lái)源并積極探索不同地區(qū)大曲真菌類群結(jié)構(gòu)的差異是極為必要的。

Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)因其具有通量高、成本低和一次運(yùn)行反應(yīng)能完成幾十萬(wàn)條至幾百萬(wàn)條核酸序列測(cè)定的特點(diǎn)[10]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于解析不同香型白酒大曲微生物群落結(jié)構(gòu)組成和動(dòng)態(tài)演替規(guī)律[11-12]，為多方位了解白酒大曲中微生物的多樣性及基因功能提供了技術(shù)支持。LIANG F等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，不同氣候條件和地理位置均會(huì)導(dǎo)致大曲內(nèi)部微生物類群產(chǎn)生一定差異，繼而影響白酒風(fēng)味品質(zhì)。因此，本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，繼而對(duì)2個(gè)地區(qū)中高溫大曲中的生物標(biāo)志物進(jìn)行甄別，以期為后續(xù)黃淮流域超級(jí)產(chǎn)區(qū)釀酒微生物資源的挖掘提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲：山東省臨沂市蘭陵縣（E117°41′～118°18′，N34°37′～35°06′）和河南省周口市鹿邑縣（E115°02′～115°37′，N33°43′～34°05′）2個(gè)某知名酒廠曲庫(kù)；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；5×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合物、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：上海桑尼生物科技有限公司；MiSeq高通量測(cè)序配套試劑：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；PE300 Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；Power Edge R930機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

于2021年7月從山東臨沂地區(qū)和河南周口地區(qū)分別采集中高溫大曲樣品13份和15份，所有大曲均以小麥為原材料，經(jīng)潤(rùn)糧、定型、入庫(kù)發(fā)酵、翻曲和貯存成熟等工藝制作而成。樣品采集時(shí)曲塊已經(jīng)在曲房成熟了約60 d，所采集的樣品無(wú)霉斑和異味且曲塊完整，樣品粉碎后封存于無(wú)菌自封袋中，置于-20 ℃低溫條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq高通量測(cè)序

按照試劑盒的操作步驟對(duì)中高溫大曲真菌菌群基因組DNA進(jìn)行提取，并使用分光光度法檢測(cè)其OD260nm值/OD280nm值。參照陳怡等[15]的方法使用引物ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增真菌ITS區(qū)基因序列，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 序列質(zhì)控及生物信息學(xué)分析

根據(jù)CAI W等[16]的質(zhì)控條件對(duì)測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始序列進(jìn)行高質(zhì)量控制和篩選，基于QIIME（v1.9.2）平臺(tái)對(duì)保留序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析[17]。首先按照97%的相似度使用UCLUST劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[18]，繼而使用UCHIME去除嵌合體，然后基于UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU代表性序列進(jìn)行物種注釋[19]，最終計(jì)算樣品中真菌類群的α多樣性指數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)（Mann-Whitney）檢驗(yàn)和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）解析2個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群的差異。使用R軟件（v4.1.3）繪制小提琴圖、箱型圖、主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）圖。2個(gè)地區(qū)中高溫大曲間的生物標(biāo)志物通過(guò)線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）算法在Galaxy服務(wù)器的在線網(wǎng)頁(yè)（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群α多樣性比較分析

通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，從納入本研究的中高溫大曲樣品中共獲得1 409 343條高質(zhì)量ITS序列，平均每份樣品50 334條，經(jīng)97%相似度進(jìn)行聚類后共劃分得到3 520個(gè)OTU。2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群的α多樣性比較分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 兩個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品超1指數(shù)（a）和香農(nóng)指數(shù)（b）比較分析Fig.1 Comparative analysis of Chao 1 index (a) and Shannon index (b) of medium-high temperature Daqu in two region

由圖1a可知，臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品的平均超1指數(shù)分別為839和1 111，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，兩者真菌類群在超1指數(shù)上差異極顯著（P＜0.01）。由圖1b可知，臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品的平均香農(nóng)指數(shù)分別為0.90和0.85，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，兩者真菌類群在香農(nóng)指數(shù)上差異不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群豐富度極顯著低于周口地區(qū)（P＜0.01）。

2.2 兩個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品中共鑒定到11個(gè)門(mén)、25個(gè)綱、46個(gè)目、91個(gè)科和133個(gè)屬。本研究基于門(mén)和屬水平對(duì)2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果見(jiàn)圖2。將平均相對(duì)豐度≥1.00%的真菌門(mén)或?qū)俣x為優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)或?qū)佟?/p>

圖2 基于門(mén)和屬水平2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of fungal community structure of medium-high temperature Daqu in two regions at the phylum and genus levels

由圖2①～④可知，納入本研究的所有中高溫大曲樣品中共檢測(cè)到4個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）（57.16%）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）（22.84%）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）（18.42%）和接合菌門(mén)（Zygomycota）（1.22%）。在臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品中，Basidiomycota的平均相對(duì)豐度分別為31.70%和15.17%，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)兩者差異顯著（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，雖然2個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群在門(mén)水平上種類相似，但其相對(duì)豐度存在一定差異。

由圖2⑤～17○可知，納入本研究的所有中高溫大曲樣品中共檢測(cè)到13個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，分別為彎曲假絲酵母屬（Apiotrichum）（16.39%）、根霉屬（Rhizopus）（12.83%）、雙足囊菌屬（Dipodascus）（9.71%）、曲霉屬（Aspergillus）（9.21%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（8.69%）、季也蒙酵母屬（Meyerozyma）（8.18%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（5.61%）、畢赤酵母菌屬（Pichia）（4.37%）、根毛霉屬（Rhizomucor）（3.74%）、絲孢酵母屬（Trichosporon）（3.21%）、橫梗霉屬（Lichtheimia）（2.66%）、耶氏酵母屬（Yarrowia）（2.23%）和馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）（1.45%）。在臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品中，Thermomyces的平均相對(duì)豐度分別為13.56%和4.47%，Malassezia的平均相對(duì)豐度分別為2.93%和0.17%，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，兩者差異均顯著（P＜0.05）；Rhizopus的平均相對(duì)豐度分別為6.81%和18.04%，Pichia的平均相對(duì)豐度分別為7.93%和1.28%，Trichosporon的平均相對(duì)豐度分別為4.98%和1.66%，Meyerozyma的平均相對(duì)豐度分別為1.36%和14.09%，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，兩者差異均極顯著（P＜0.01）。

存在于28份中高溫大曲樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌屬在白酒釀造過(guò)程中對(duì)白酒風(fēng)味品質(zhì)的生成均具有積極作用。有研究報(bào)道，Thermomyces和Thermoascus具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等酶類的能力，對(duì)白酒產(chǎn)香具有促進(jìn)作用，且其具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能夠在白酒發(fā)酵過(guò)程中溫度較高的條件下保持穩(wěn)定的催化效率[20]。Aspergillus是大曲和糟醅中的重要微生物，能夠在酒醅發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生白酒呈香呈味的重要風(fēng)味物質(zhì)或者風(fēng)味前體物質(zhì)[9]。Apiotrichum、Pichia、Trichosporon和Yarrowia等酵母屬代謝可生成多種有機(jī)酸、高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，這些物質(zhì)參與白酒風(fēng)味物質(zhì)的合成并發(fā)揮著積極作用[21]。亦有研究指出，Trichosporon能夠在生成酒精的同時(shí)通過(guò)發(fā)酵還原糖生成多元醇，使白酒具備醇甜味[22]。CHEN B等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Rhizopus、Rhizomucor、Lichtheimia和Malassezia等霉菌屬可以代謝產(chǎn)生大量的高活性蛋白酶和葡糖淀粉酶，被視為大曲糖化降解動(dòng)力的主要來(lái)源。Rhizomucor具有糖化發(fā)酵能力，能形成大量乳酸，為發(fā)酵提供了酸性環(huán)境[24]。Dipodascus不僅是氨基酸生產(chǎn)者，還是潛在風(fēng)味貢獻(xiàn)者，該菌屬的代謝可促進(jìn)3-甲基丁酸、庚酸和2,3-丁二醇等風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[25]。

除此之外，枝孢菌屬（Cladosporium）、羅薩氏菌屬（Rasamsonia）、單孢酵母屬（Kazachstania）、念珠菌屬（Candida）和鐮刀菌屬（Fusarium）在周口地區(qū)中高溫大曲樣品中的平均相對(duì)豐度僅為0.46%、0.01%，0.01%、0.36%和0.61%，而這些菌屬在臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品中為優(yōu)勢(shì)真菌屬，平均相對(duì)豐度分別為1.54%、1.33%、1.32%、1.14%和1.06%。皮狀絲孢酵母屬（Cutaneotrichosporon）雖為周口地區(qū)中高溫大曲樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，平均相對(duì)豐度為1.27%，但其在臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品中的平均相對(duì)豐度僅為0.01%。由此可見(jiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群在屬水平上存在明顯差異。

2.3 兩個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群β多樣性比較分析

基于門(mén)和屬水平研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群組成結(jié)構(gòu)存在一定的差異。為進(jìn)一步展示其群落之間物種組成異同，基于UniFrac距離進(jìn)行PCoA，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于加權(quán)（a）和非加權(quán)（b）UniFrac距離2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群PCoA結(jié)果Fig.3 PCoA results of fungal community based on weighted (a) and unweighted (b) UniFrac distance of medium-high temperature Daqu in two regions

由圖3可知，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品中真菌類群結(jié)構(gòu)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26]。由圖3a可知，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品間雖存在明顯的重疊現(xiàn)象，但亦具有一定的分離趨勢(shì)。由圖3b可知，臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品均分布于X軸正方向，周口地區(qū)中高溫大曲樣品均分布于X軸負(fù)方向，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品間存在明顯的分離現(xiàn)象。經(jīng)MANOVA分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)差異極顯著（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品間真菌類群在整體上存在明顯差異。

2.4 兩個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群差異菌群分析

線性判別分析常用于揭示不同環(huán)境下兩個(gè)或兩個(gè)以上類群間的差異物種特征[27]。為進(jìn)一步明確2個(gè)地區(qū)中高溫大曲真菌類群結(jié)構(gòu)的差異，本研究采用LDA閾值評(píng)分4.0進(jìn)行線性判別分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群線性判別分析結(jié)果Fig.4 Linear discriminant analysis effect size results of fungal community of medium-high temperature Daqu in two regions

由圖4可知，在納入本研究的中高溫大曲樣品中共鑒定出13個(gè)相對(duì)豐度差異顯著的真菌類群（P＜0.05）。其中對(duì)臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品影響顯著的真菌類群有3個(gè)，均各有1個(gè)分別體現(xiàn)在門(mén)、綱和科水平；對(duì)周口地區(qū)中高溫大曲樣品影響顯著的有10個(gè)，各有1個(gè)、1個(gè)、4個(gè)和4個(gè)，分別體現(xiàn)在綱、目、科和屬水平。由圖4亦可知，Dipodascus、Meyerozyma、Rhizopus和Thermoascus這4個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬在周口地區(qū)中高溫大曲樣品中富集，而沒(méi)有真菌屬在臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品中富集。由此可見(jiàn)，在屬水平上，Dipodascus、Meyerozyma、Rhizopus和Thermoascus可作為造成臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品中真菌類群結(jié)構(gòu)差異的主要菌群。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臨沂和周口地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。相較于周口地區(qū)中高溫大曲樣品，臨沂地區(qū)中高溫大曲樣品真菌類群豐富度明顯偏低，其中真菌類群Thermomyces、Malassezia、Pichia和Trichosporon平均相對(duì)豐度明顯偏高，Rhizopus和Meyerozyma平均相對(duì)豐度明顯偏低，且Dipodascus、Meyerozyma、Rhizopus和Thermoascus為造成2個(gè)地區(qū)大曲中真菌類群結(jié)構(gòu)差異的主要菌群。