申 瑾，夏瑤瑤，梁 楷，周景麗，閆裕峰*，趙慧姿，李 杰

（1.食醋發(fā)酵科學(xué)與工程山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030400；2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

老陳醋手工醋酸發(fā)酵工藝采用陶缸發(fā)酵，產(chǎn)品風(fēng)味好、營養(yǎng)豐富[1-2]，但其生產(chǎn)過程的控制主要依靠老師傅多年的經(jīng)驗(yàn)和直觀感覺，存在釀造過程難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)效率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺陷。在保證老陳醋優(yōu)良品質(zhì)的前提下，機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵工藝可實(shí)現(xiàn)老陳醋的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。老陳醋機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每日翻醅利用翻倒醅機(jī)代替手工翻醅和倒缸[3]。利用機(jī)械化設(shè)備對手工釀造工藝進(jìn)行升級可實(shí)現(xiàn)老陳醋的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，進(jìn)而提高山西食醋行業(yè)科技水平和市場競爭力，對于老陳醋手工釀造技藝非遺的傳承和弘揚(yáng)也具有重要意義。

食醋醋酸發(fā)酵過程中內(nèi)在特性的研究集中于微生物菌群、理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)的變化分析。于華等[4]對四川麩醋發(fā)酵過程中醋醅理化指標(biāo)及有機(jī)酸變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)酸、不揮發(fā)酸與總酸變化趨勢大致相同；氨基酸態(tài)氮含量呈先快后慢的上升趨勢；還原糖含量先升高后降低。從醋醅樣品中共檢測出8種有機(jī)酸，其中乙酸和乳酸為主體有機(jī)酸。KOU R等[5]通過Illumina Hiseq測序發(fā)現(xiàn)，山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是山西陳醋夏季發(fā)酵過程中的兩個(gè)主要類群，它們分別在乙酸發(fā)酵和酒精發(fā)酵階段占主導(dǎo)地位。鄭宇等[6]對中國手工固態(tài)發(fā)酵食醋主要特征風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙酸和乳酸是手工食醋中含量最高且風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的主體有機(jī)酸，其含量占總有機(jī)酸含量的80%以上。王超等[7]對鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，水分含量變化不顯著，還原糖呈先增后減趨勢，pH值和蛋白質(zhì)呈下降趨勢，總酸、氨基酸和銨鹽呈遞增趨勢。陳旭峰等[8]對山西老陳醋釀造過程中理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，醋酸發(fā)酵階段酸度和有機(jī)酸含量不斷增長，還原糖和氨基酸態(tài)氮的含量先上升后下降。目前，醋酸發(fā)酵不同翻醅方式對老陳醋品質(zhì)影響的研究報(bào)道尚鮮見。

本研究采用手工及機(jī)械翻醅方式，對老陳醋醋酸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、有機(jī)酸及香氣成分進(jìn)行跟蹤測定，比較兩種醋酸發(fā)酵翻醅方式對老陳醋品質(zhì)的影響，以期掌握老陳醋手工及機(jī)械翻醅方式下醋酸發(fā)酵的內(nèi)在特性和變化規(guī)律，為老陳醋醋酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 醋醅樣品

醋醅樣品：采集山西紫林醋業(yè)股份有限公司。老陳醋醋酸發(fā)酵手工翻醅方式采樣點(diǎn)（0、2 d、6 d、10 d）與機(jī)械翻醅方式采樣點(diǎn)（0、2 d、8 d、12 d、14 d）。機(jī)械翻醅發(fā)酵時(shí)間為14 d結(jié)束，手工翻醅為10 d結(jié)束。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸銅、亞甲基藍(lán)（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；酒石酸、乳酸、草酸、檸檬酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸（均為色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

STARTER 3100 pH計(jì)、AR124CN電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4型水浴鍋：常州榮華儀器制造有限公司；T3202分光光度計(jì)：太原市瑞佳科學(xué)器材有限公司；WGZ-800濁度計(jì)：上海昕瑞儀器儀表有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配紫外檢測器）、7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、7000D型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；FPJ1500翻醅機(jī)：溫州市伯泰機(jī)械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陳醋醋酸發(fā)酵翻醅方式

手工翻醅：老陳醋固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每日翻醅工人進(jìn)行手工翻醅和倒缸。

機(jī)械翻醅：老陳醋機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合，隨后接入含有大量生長于對數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每日翻醅利用翻醅機(jī)代替手工翻醅和倒缸。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

總酸、不揮發(fā)酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮、pH值：參照國標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》中的方法進(jìn)行測定[9]。

1.3.3 有機(jī)酸含量的測定

有機(jī)酸含量的測定采用高效液相色譜法[10]。

前處理方法：取2 mL待測樣品，加2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和2 mL 30%硫酸鋅溶液，用蒸餾水稀釋定容到25 mL，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，備用。

高效液相色譜條件：SinochromODS-BP色譜柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01 mmol/L KH2PO4（用磷酸調(diào)pH=2.7）∶甲醇=97∶3（V/V）；流速0.6mL/min；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

定性與定量分析：將乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸7種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋成不同濃度混合溶液后進(jìn)行色譜分離，各有機(jī)酸的出峰保留時(shí)間用于有機(jī)酸的定性分析。以色譜峰面積對各標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸分析，各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.997 2～0.999 3，按照各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算醋樣中有機(jī)酸的含量。

1.3.4 香氣成分的測定

香氣成分的測定采用頂空固相微萃?。╤eadspace solidphase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]。

前處理方法：先將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口于250 ℃老化至無雜峰，將6 mL醋樣放入15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入1.5 g固體氯化鈉，加蓋。放入40 ℃恒溫水浴中，將SPME萃取頭通過瓶蓋插入到樣品中的頂空部分，推出纖維頭，頂空吸附40 min，隨后抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜儀的氣相色譜進(jìn)樣口，推出纖維頭，于250 ℃解吸3 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣（He），流量0.9 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min升溫至90 ℃，保持2.5 min，以10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min，以3 ℃/min升溫至220 ℃，再以40 ℃/min升溫至270 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍33～450 amu。

定性與定量分析：香氣成分的定性以美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）17譜庫和人工圖譜解析共同確定，選取匹配度＞70%的化合物為有效香氣成分。各香氣成分的定量采用峰面積歸一化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 老陳醋不同翻醅方式醋酸發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 總酸含量和pH值

醋醅總酸的變化主要是醋醅中乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸、丁酸、己酸等含量的改變引起的，是評價(jià)醋酸發(fā)酵過程的決定性指標(biāo)[14]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程總酸含量和pH的變化見圖1。

圖1 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程總酸含量和pH的變化Fig.1 Changes of total acid contents and pH during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

由圖1可知，手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程醋醅的總酸均呈上升趨勢，手工翻醅總酸上升更快，但前2 d平均增長速度最快，這可能是前期的醋醅適宜產(chǎn)酸微生物的生長繁殖及代謝，進(jìn)而有機(jī)酸大量生成，使總酸含量迅速升高；醋酸發(fā)酵2 d之后，手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵總酸繼續(xù)上升，而機(jī)械翻醅總酸上升速度較手工翻醅慢；到發(fā)酵后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機(jī)酸的積累，使釀造環(huán)境處于高酸度、低營養(yǎng)狀態(tài)，導(dǎo)致醋酸菌、乳酸菌等產(chǎn)酸菌代謝緩慢，總酸含量增長速度減緩。隨著總酸含量的增加，pH值逐漸降低，但變化幅度很小，pH均只下降了0.3。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程pH值始終維持在3.7～4.0之間，說明兩種工藝在醋酸發(fā)酵過程中形成了一個(gè)緩沖體系，pH值始終處于動(dòng)態(tài)平衡，這與于華等[4]的研究結(jié)果一致。整體來看，與手工相比，機(jī)械翻醅降低了人力勞動(dòng)，總酸含量較低于手工翻醅，pH值變化不大。

2.1.2 不揮發(fā)酸含量的變化

不揮發(fā)酸是形成老陳醋風(fēng)味的基本骨架[15]。老陳醋中含有豐富的不揮發(fā)酸，如乳酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸等，不揮發(fā)酸可緩沖乙酸的刺激性，使食醋酸味柔和醇厚[16-17]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程不揮發(fā)酸含量的變化見圖2。由圖2可知，手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程醋醅的不揮發(fā)酸均呈現(xiàn)先增加再趨于平穩(wěn)的變化趨勢。發(fā)酵前2 d醋醅的不揮發(fā)酸急劇增加，可能是發(fā)酵初期醋醅接火后醋醅并未整體翻動(dòng)，大部分醋醅處于厭氧狀態(tài)，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。醋酸發(fā)酵2 d之后，不揮發(fā)酸基本趨于穩(wěn)定，而機(jī)械翻醅不揮發(fā)酸含量有下降趨勢，到發(fā)酵結(jié)束手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程醋醅的不揮發(fā)酸基本一致。不揮發(fā)酸含量的下降可能是由于有機(jī)酸與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)造成的，也可能是由于醋酸菌大量繁殖，乳酸被分解所致。

圖2 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程不揮發(fā)酸含量的變化Fig.2 Changes of non-volatile acid contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.1.3 氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮是食醋重要的組成部分，反映食醋中氨基酸及小肽總體水平，其含量的高低影響著食醋的質(zhì)量等級和整體風(fēng)味[18-19]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖3。由圖3可知，手工和機(jī)械工藝醋酸發(fā)酵過程中醋醅的氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢，發(fā)酵前期增長速度快，發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮的增長幅度變緩。發(fā)酵前2 d氨基酸態(tài)氮的含量急劇增加，機(jī)械翻醅速度高于手工翻醅速度，可能是發(fā)酵前期微生物代謝產(chǎn)生大量酶類，原料中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解成多肽，多肽又經(jīng)肽酶作用形成氨基酸，也可能與酒精發(fā)酵結(jié)束酒醪中酵母的自溶及酒醪中酸性蛋白酶的水解有關(guān)[20]。醋酸發(fā)酵2 d之后，氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢。發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮增長幅度變緩，可能是醋酸發(fā)酵后期醋醅總酸的增加影響了蛋白酶的活性。

圖3 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.1.4 還原糖含量的變化

食醋中的還原糖主要是葡萄糖和麥芽糖，原料糖化、酒化后，殘余的糖大部分被醋酸菌所利用，余下的小部分保留在最后的食醋產(chǎn)品中，起到調(diào)節(jié)食醋風(fēng)味的作用[21-22]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程還原糖含量的變化見圖4。由圖4可知，手工和機(jī)械工藝醋酸發(fā)酵過程中還原糖含量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。醋酸發(fā)酵過程是一個(gè)以醋酸菌發(fā)酵為主，多菌種共同參與的過程，發(fā)酵前期醋酸菌還未成為優(yōu)勢菌，麩皮等輔料中的淀粉被分解為還原糖，因此發(fā)酵初期前2 d還原糖含量呈現(xiàn)上升趨勢；醋酸發(fā)酵2 d之后，還原糖含量整體呈下降趨勢。當(dāng)醋酸菌成為發(fā)酵的優(yōu)勢菌種后，醋酸菌大量繁殖，葡萄糖作為醋酸菌的碳源而被利用，因此后期還原糖呈現(xiàn)下降趨勢。

圖4 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains

2.2 老陳醋不同翻醅方式醋酸發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

兩種翻醅方式下7種有機(jī)酸含量測定結(jié)果分別見表1與表2。

表1 手工翻醅醋酸發(fā)酵過程有機(jī)酸含量的變化Table 1 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

表2 機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程有機(jī)酸含量的變化Table 2 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by mechanical turning fermented grains

由表1和表2可知，兩種翻醅方式醋酸發(fā)酵過程中的主體有機(jī)酸均為乙酸和乳酸，其含量在總有機(jī)酸中所占比例高達(dá)85%以上。乳酸是主要的非揮發(fā)性酸，可以減輕醋的刺激性味道并改善風(fēng)味[23-24]，所以醋酸和乳酸的比例對食醋風(fēng)味品質(zhì)很重要[25]。隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，兩種操作方式醋醅中的乙酸均呈上升趨勢，乳酸均呈下降趨勢，醋酸發(fā)酵結(jié)束后兩種操作方式醋醅中，手工翻醅乙酸和乳酸含量在總有機(jī)酸中所占比例為93%，機(jī)械翻醅乙酸和乳酸含量在總有機(jī)酸中所占比例約為92%；兩種操作方式醋酸發(fā)酵過程琥珀酸呈下降趨勢。手工翻醅過程中，甲酸基本呈上升趨勢而機(jī)械翻醅變化趨勢正好相反，α-酮戊二酸呈下降趨勢，檸檬酸呈上升趨勢而機(jī)械翻醅變化趨勢正好相反。

2.3 老陳醋不同翻醅方式醋酸發(fā)酵過程中香氣成分的變化

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程中的香氣成分進(jìn)行檢測，結(jié)果分別見表3與表4。由表3可知，手工翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出33種香氣成分，包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環(huán)類和7種其他類。由表4可知，機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出35種香氣成分，包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環(huán)類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段的香氣成分均以醇類、酸類、酯類為主。兩種操作方式醋酸發(fā)酵初期醇類均為主體香氣成分，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醇類物質(zhì)的含量大幅降低；兩種操作方式的酸類物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)上升趨勢，醋酸發(fā)酵結(jié)束后酸類物質(zhì)成為主體香氣成分，手工翻醅的酸類物質(zhì)相對占比高于機(jī)械翻醅。兩種操作方式的酯類物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)上升趨勢，醋酸發(fā)酵結(jié)束后手工操作方式的酯類物質(zhì)相對占比低于機(jī)械操作方式。

表3 手工翻醅醋酸發(fā)酵過程香氣成分的變化Table 3 Changes of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

表4 機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程香氣成分的變化Table 4 Change of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains

3 結(jié)論

本研究對老陳醋手工與機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)、有機(jī)酸及香氣成分進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，兩種操作方式在醋酸發(fā)酵過程中總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢，pH值的變化幅度很小，始終維持在3.7～4.0之間，還原糖呈先上升后下降的趨勢；乳酸和乙酸為醋酸發(fā)酵過程中的主體有機(jī)酸，二者占有機(jī)酸總量的85%以上，在醋酸發(fā)酵過程中兩種操作方式的乙酸均呈上升趨勢，乳酸均呈下降趨勢，其他5種有機(jī)酸的變化趨勢有一定的差異，兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段檢測出的香氣成分總數(shù)相差不大，但種類有一定的差異。手工翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出33種香氣成分，包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環(huán)類和7種其他類。機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出35種香氣成分，包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環(huán)類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段香氣成分的組成均以酸類、醇類、酯類為主，機(jī)械翻醅醋醅風(fēng)味較優(yōu)于手工翻醅。