許 超，余曉斌*

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

隨著世界人口的迅速增長，人們對畜牧產(chǎn)品的需求也不斷增加，這就需要通過飼喂高精飼料來提高動物產(chǎn)量[1]，然而這容易導致動物代謝紊亂，進而產(chǎn)生疾病[2]。因此，有必要使用飼料添加劑來改善動物健康[3]。

在全球“禁抗”背景下，益生菌成為反芻動物營養(yǎng)學家和微生物學家關注的焦點。益生菌能夠改變瘤胃或后腸中的微生物種群，改變其發(fā)酵模式，并提高飼料消化率[4]。酵母作為常用的益生菌，含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等，營養(yǎng)成分十分豐富[5]。研究表明，補充酵母可以增加反芻動物的飼料攝入量和生長速度[6-7]以及改善肉奶品質(zhì)等[8-9]。丁洪濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加產(chǎn)朊假絲酵母可以提高奶牛瘤胃氨態(tài)氮和總揮發(fā)性脂肪酸含量，改善瘤胃發(fā)酵。MAAMOURI O等[11]在反芻動物飼料中添加釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）使育肥犢牛平均日質(zhì)量增加400 g，極大地改善了育肥犢牛的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率。酵母還能通過與乳酸產(chǎn)生菌（如牛鏈球菌）相互競爭發(fā)酵底物，減少乳酸的產(chǎn)生，同時刺激乳酸利用菌（如埃氏巨型球菌和反芻獸月形單胞菌）的生長[12-13]，降低乳酸的積累，從而穩(wěn)定瘤胃pH。此外，酵母還有提高免疫力[14]、改善繁殖性能[15]和清除瘤胃氧氣[16]等作用。薛帥帥等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加布拉氏酵母可以降低犢牛血清白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，增強機體免疫功能。VILLOT C等[18]研究發(fā)現(xiàn)，補充1×1010CFU/d的布拉氏酵母菌可將腹瀉率從69.1%降至50.0%。因此，合理利用酵母作為飼料添加劑，對反芻動物的提質(zhì)增效和健康養(yǎng)殖具有重要的現(xiàn)實意義[19]。

本研究通過對3株反芻酵母（編號分別為YL-1，YQ-1，F(xiàn)G-1）的耐乳酸、耐膽鹽和產(chǎn)氣性能進行比較，篩選出綜合性能最佳的菌株，并對篩選菌株進行鑒定。然后通過單因素試驗和響應面試驗，得到其最佳培養(yǎng)基配方和最適培養(yǎng)條件，以期為該菌株的微生態(tài)制品生產(chǎn)和工業(yè)化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種反芻酵母YL-1、AQ-1、FG-1（均已證實對反芻動物具有益生功能）：法國樂斯福公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20.0 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖74.0 g/L，玉米漿干粉52.0 g/L，MgSO41.1 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

乳酸、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、NaCl、CaCl2、MgSO4、MnSO4、NH4Cl、NaNO3、（NH4）2SO4（均為分析純）、魚粉蛋白胨（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂、牛膽鹽（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；玉米漿干粉（生化試劑）：南京全隆生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GR110DR高壓蒸汽滅菌鍋：美國致微儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技公司；Synergy H4酶標儀：美國BioTek公司；SPX-250-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；PHS-3C pH計：梅特勒-托利多國際股份有限公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與種子液制備

使用接種環(huán)從甘油管中蘸取少量菌液，在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，然后將平板置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取平板上的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，再從斜面取一環(huán)接種至YPD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后得到活化的種子液。

1.3.2 菌體生物量測定

菌體密度測定：取發(fā)酵后的菌液稀釋至合適倍數(shù)，并以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，使用酶標儀測定OD560nm值。

菌落數(shù)測定：取發(fā)酵后的菌液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布于固體YPD平板，培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.3.3 耐乳酸試驗

在滅菌后的YPD液體培養(yǎng)基中加入乳酸，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0，然后以4%接種量接入種子液，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣并測定其OD560nm值。

1.3.4 耐膽鹽試驗

將酵母種子液接種于膽鹽質(zhì)量分數(shù)分別為0、0.3%、0.6%、0.9%的YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)6 h，每隔2 h取樣，將樣品稀釋至合適倍數(shù)并涂布平板，30 ℃培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.3.5 產(chǎn)氣試驗

取種子液50 μL接入裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，倒置放入杜氏小管，以避免杜氏小管中產(chǎn)生氣泡，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察并記錄菌株的產(chǎn)氣情況。

1.3.6 菌株分子生物學鑒定

通過上述性能比較選出綜合性能最佳的菌株進行分子生物學鑒定，并作為后續(xù)試驗菌株。使用基因組提取試劑盒提取菌株全基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），并以其作為模板，利用通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對其26S rDNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）Gen bank數(shù)據(jù)庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，比對結果用MEGA-X構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗

（1）碳源種類及最佳碳源添加量對菌株生長的影響

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜和乳糖替換YPD液體培養(yǎng)基中的碳源，保持培養(yǎng)基其他組分和含量不變，按4%的接種量接種種子液，在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h后測定菌液OD560nm值。篩選出最適碳源后，保持其他組分不變，將其添加量設為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L，進行搖瓶培養(yǎng)，測定菌液的OD560nm值，以確定最佳碳源添加量。

（2）氮源種類及最佳氮源添加量對菌株生長的影響

分別用20 g/L的胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母粉、玉米漿干粉、NaNO3、（NH4）2SO4和NH4Cl替換YPD液體培養(yǎng)基中的氮源，保持培養(yǎng)基其他組分和含量不變，培養(yǎng)條件和測定方法與碳源種類篩選試驗相同。篩選出最適氮源后，保持其他組分不變，將其添加量設為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L，搖瓶培養(yǎng)后測定菌液的OD560nm值，確定最佳氮源添加量。

（3）無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株生長的影響

分別向YPD液體培養(yǎng)基添加NaCl、CaCl2、K2HPO4、MgSO4和MnSO4，作為培養(yǎng)所需的無機鹽，添加量為1 g/L，培養(yǎng)基其他組分和含量保持不變，培養(yǎng)條件和測定方法與碳源種類篩選試驗相同。篩選出最適無機鹽后，將其添加量設為0、0.5 g/L、1.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L，保持其他組分不變，搖瓶培養(yǎng)后測定菌液的OD560nm值，確定最佳無機鹽添加量。

1.3.8 培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應面試驗[20]

根據(jù)單因素試驗結果，選取蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，并以OD560nm值（Y）作為響應值，采用Design Expert 12.0軟件設計3因素3水平Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗因素和水平見表1。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for medium formula optimization

1.3.9 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎，分別考察pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、培養(yǎng)溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）對菌液OD560nm值的影響。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

利用Design Expert 12.0設計Box-Behnken試驗，試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2022繪圖。所有試驗進行3次重復。

2 結果與分析

2.1 耐乳酸試驗

優(yōu)良的反芻酵母應能夠在反芻動物胃腸道極端環(huán)境下存活，并與乳酸產(chǎn)生菌競爭發(fā)酵底物，從而穩(wěn)定胃腸道pH及降低乳酸含量，因此需要對乳酸有較強耐受性。考察菌株的耐乳酸性，結果見圖1。由圖1可知，3株酵母在pH為3.0的條件下仍然能夠生長，說明3株酵母都有較強的耐乳酸能力，但菌株FG-1在pH為3.0時生長遲滯期明顯短于其余兩株酵母，說明菌株FG-1耐乳酸性能最優(yōu)。

圖1 菌株AQ-1（a）、YL-1（b）、FG-1（c）的耐乳酸試驗結果Fig.1 Results of lactic acid resistance tests for strains AQ-1(a), YL-1(b) and FG-1(c)

2.2 耐膽鹽試驗

反芻酵母需要在反芻動物胃腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用，因此必須對膽鹽等形成的高滲透壓環(huán)境有較強耐受能力。分別在膽鹽為0、0.3%、0.6%、0.9%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h、4 h、6 h，3株反芻酵母耐膽鹽試驗結果見圖2。由圖2可知，當膽鹽含量分別為0.3%和0.6%時，菌株AQ-1和YL-1的存活數(shù)與不含膽鹽相比，存活數(shù)無明顯下降，而菌株FG-1的存活數(shù)有明顯的下降；當膽鹽含量為0.9%時，3株酵母的存活數(shù)均呈下降趨勢；說明菌株AQ-1和YL-1能耐受0.6%的膽鹽含量，耐膽鹽效果較好，而菌株FG-1的膽鹽耐受力較差。

圖2 菌株AQ-1（a）、YL-1（b）、FG-1（c）耐膽鹽試驗結果Fig.2 Results of bile salt tolerance tests for strains AQ-1(a), YL-1(b) and FG-1(c)

2.3 產(chǎn)氣試驗

作為反芻酵母，應具備產(chǎn)氣量小的特點，因其產(chǎn)氣量大則會在反芻動物進食后引起腹脹，如瘤胃膨氣等[21]。3株酵母的產(chǎn)氣結果見表2。由表2可知，3株菌株均在發(fā)酵8 h后開始產(chǎn)氣，其中以菌株AQ-1產(chǎn)氣能力最強，發(fā)酵14 h產(chǎn)氣量便充滿整個杜氏小管，菌株YL-1產(chǎn)氣能力次之，于發(fā)酵16 h后產(chǎn)氣量充滿杜氏小管，菌株FG-1產(chǎn)氣能力最弱，于發(fā)酵18 h后產(chǎn)氣量充滿杜氏小管。說明菌株FG-1適宜作為反芻酵母飼喂反芻動物，而菌株AQ-1產(chǎn)氣能力過強，不適宜飼喂反芻動物。

表2 菌株產(chǎn)氣試驗結果Table 2 Results of gas production tests of strains

2.4 菌株分子生物學鑒定

經(jīng)上述性能比較，3株菌株耐乳酸性能都比較優(yōu)秀，但菌株FG-1膽鹽耐受力較差，菌株AQ-1產(chǎn)氣能力過強，綜合性能最佳的為菌株YL-1。對菌株YL-1進行分子生物學鑒定，利用PCR技術擴增26S rDNA，經(jīng)上海生工測序，測序結果在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，將比對結果用MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株YL-1與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MT420738聚于一個分支，親緣關系最近，在Genbank中比對的相似度也最高，相似度為100%，因此鑒定菌株YL-1為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 基于26S rDNA基因序列菌株YL-1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YL-1 based on 26S rDNA gene sequence

2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗結果

2.5.1 碳源種類及最佳碳源添加量對菌株YL-1生長的影響有機碳源是構成培養(yǎng)基的主要成分，對于一切異源微生物，碳源又兼做能源，是菌體生長存活必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)之一[22]。碳源種類及最佳碳源添加量對菌株YL-1生長的影響見圖4。由圖4a可知，當以麥芽糖作為碳源時，菌株YL-1的OD560nm值最高，蔗糖次之，這表明菌株YL-1對麥芽糖的利用效率最好，但由于麥芽糖價格昂貴，考慮到經(jīng)濟因素，最終選擇蔗糖作為最適碳源。由圖4b可知，當蔗糖添加量低于70 g/L時，菌體密度隨蔗糖添加量增加而增加；當蔗糖添加量高于70 g/L時，菌體生長受到抑制；當蔗糖添加量為70 g/L時，OD560nm值最高。因此，確定最適的蔗糖添加量為70 g/L。

圖4 碳源種類（a）及蔗糖添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.4 Effects of carbon source types (a) and sucrose addition (b)on the growth of strain YL-1

2.5.2 氮源種類及最佳氮源添加量對菌株YL-1生長的影響

微生物生長和產(chǎn)物合成都需要利用氮源，主要用于氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等和含氮代謝產(chǎn)物的合成[23]。不同氮源及最佳氮源添加量對菌株YL-1生長的影響見圖5。由圖5a可知，有機氮源的效果明顯好于無機氮源，其中以玉米漿干粉的作用效果最佳。玉米漿干粉成本低廉，且富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等[24]，可以作為酵母繁殖所需的氮源。因此，選擇其作為培養(yǎng)基的最適氮源。由圖5b可知，隨著玉米漿干粉添加量的增加，菌株YL-1的OD560nm值呈先升高后降低的趨勢，當玉米漿干粉添加量為50 g/L時，菌株YL-1的OD560nm值最高，為4.10。因此，確定玉米漿干粉的最適添加量為50 g/L。

圖5 氮源種類（a）及玉米漿干粉添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.5 Effects of nitrogen source types (a) and corn steep power addition (b) on the growth of strain YL-1

2.5.3 無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株YL-1生長的影響

微生物的生長除了需要碳源、氮源外，還需要部分無機鹽。無機鹽的用量雖然很少，但因為其具有多種生理功能，對微生物的生長有重要影響[25]。無機鹽種類及最佳無機鹽添加量對菌株YL-1生長的影響見圖6。由圖6a可知，MgSO4作為無機鹽對菌株YL-1的菌體生長影響顯著，明顯優(yōu)于其他無機鹽，而其他種類無機鹽處理與空白對照相比，對菌株YL-1的生長均有不同程度的抑制作用。因此，選擇MgSO4作為最適無機鹽。由圖6b可知，當MgSO4添加量為1 g/L時，菌株YL-1的菌體密度最高。當繼續(xù)增加MgSO4添加量，菌體密度開始緩慢下降。因此，確定MgSO4的最適添加量為1 g/L。

圖6 無機鹽種類（a）及MgSO4添加量（b）對菌株YL-1生長的影響Fig.6 Effects of inorganic salt types (a) and MgSO4 addition (b)on the growth of strain YL-1

2.6 培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應面試驗

2.6.1 響應面優(yōu)化試驗設計及結果分析

以蔗糖添加量（A）、玉米漿干粉添加量（B）和MgSO4添加量（C）為考察因素，以OD560nm值（Y）為響應值，利用Design Expert 12.0軟件進行響應面優(yōu)化設計，試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4。

表3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for medium formula optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

根據(jù)表3中的試驗結果，通過Design Expert 12.0軟件進行回歸擬合分析，得到培養(yǎng)基配方的二次多項回歸方程為

由表4結果可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著；失擬項的P值＞0.05，不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.981 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.957 6，均＞0.9，說明該模型擬合程度較好，可用于分析試驗結果。由回歸模型和方差分析可知，一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

2.6.2 響應面試驗結果驗證

蔗糖、玉米漿干粉和MgSO4添加量3個因素之間交互作用對菌株YL-1生長影響的響應面及等高線見圖7。

圖7 各因素間交互作用對菌株YL-1生長影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the growth of strain YL-1

由圖7可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明方程存在最大值。由Design Expert12.0軟件對回歸方程求解，得到菌體密度最大時培養(yǎng)基最佳組合為：蔗糖添加量74.31 g/L，玉米漿干粉添加量52.38 g/L，MgSO4添加量1.12 g/L，此時菌體密度OD560nm值預測值為8.150?？紤]到實際操作的可行性，將培養(yǎng)基組分調(diào)整為蔗糖添加量74.0 g/L，玉米漿干粉添加量52.0 g/L，MgSO4添加量1.1 g/L。在此條件下，進行3組平行驗證試驗，得到菌株YL-1的OD560nm值實際值為8.117±0.054，與預測值相差不大，說明該模型可用于預測YL-1菌體密度的變化。

2.7 菌株YL-1培養(yǎng)條件優(yōu)化

初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量對菌株YL-1生長的影響見圖8。

圖8 初始pH值（a）、培養(yǎng)溫度（b）和接種量（c）對菌株YL-1生長的影響Fig.8 Effects of initial pH value (a), culture temperature (b) and inoculum (c) on the growth of strain YL-1

微生物在生長過程中都有最適pH范圍，而對于許多酵母菌而言，其最適生長pH為4.5～6.5。若pH值過高或過低，均會對酵母菌的增殖產(chǎn)生不利影響[26]。

由圖8a可知，當初始pH值在4.0～5.5范圍內(nèi)時，菌體密度隨pH升高而增大；當初始pH值為5.5時，菌株YL-1的OD560nm值最大為8.25；當初始pH值＞5.5時，菌體密度隨pH升高而降低。因此確定最適初始pH值為5.5。溫度的變化會導致微生物生長和繁殖速度產(chǎn)生巨大變化。由圖8b可知，隨發(fā)酵溫度升高，菌株YL-1的OD560nm值呈先升高后下降的趨勢，在28 ℃時達到最大值，說明菌株YL-1的最適生長溫度為28 ℃。合適的接種量能夠提高發(fā)酵速度，從而縮短發(fā)酵周期，同時也有助于節(jié)約成本。由圖8c可知，當接種量為8%時，菌株YL-1的OD560nm值可達8.63，之后隨接種量增大菌體密度開始降低，說明菌株YL-1最佳接種量為8%。綜上所述，菌株YL-1的最適培養(yǎng)條件為初始pH值5.5，培養(yǎng)溫度28 ℃，接種量8%，在此最適條件下進行培養(yǎng)，菌株YL-1的OD560nm值可達8.835，活菌數(shù)為3.58×108CFU/mL，分別是初始培養(yǎng)條件下的2.38倍和2.20倍。

3 結論

本研究對3株反芻酵母的耐乳酸、耐膽鹽、產(chǎn)氣性能進行了比較，選出了綜合性能最佳的菌株YL-1，經(jīng)分子生物學鑒定為一株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。通過單因素試驗和響應面試驗得到菌株YL-1的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖74.0 g/L，玉米漿干粉52.0 g/L，MgSO41.1 g/L。最適培養(yǎng)條件為初始pH值5.5，培養(yǎng)溫度28 ℃，接種量8%。在此優(yōu)化條件下，菌株YL-1活菌數(shù)可達3.58×108CFU/mL，提高至未優(yōu)化前活菌數(shù)的2.20倍。優(yōu)化后的培養(yǎng)基采用蔗糖為主要碳源，并且采用廉價的玉米漿干粉作為氮源，培養(yǎng)基配方簡單，易得且成本較低，為后續(xù)反芻酵母YL-1的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎。