張 令,王 寧,許 楠,張曉彤,韓 鵬

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710061;2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;3.神木市醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 神木 719300;4.西安市鄠邑區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 西安 710300)

頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是常見的惡性腫瘤之一[1-2]。由于HNSCC生存率較低且總體預(yù)后相對較差,給患者帶來極大痛苦[3-4]。核苷酸剪切修復(fù)(Nucleotide excision repair,NER)通路在DNA修復(fù)中扮演重要角色,其功能多樣化[5-7]。既往研究[8-10]發(fā)現(xiàn),30多個基因參與NER通路來修復(fù)損傷DNA,NER通路可以修復(fù)受紫外線輻射損傷的DNA。一些化學(xué)物質(zhì)(如煙草燃燒過程產(chǎn)生的苯并芘)可以與DNA內(nèi)核苷酸殘余的堿基成分發(fā)生反應(yīng)進而生成一種塊狀加合物,該物質(zhì)會導(dǎo)致正常的DNA螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲。NER通路在去除這些加合物的過程中發(fā)揮重要作用,可修復(fù)約70%由環(huán)境因素引起的DNA損傷[11-13]。

既往研究[14-17]表明,NER基因mRNA和蛋白表達水平降低分別與HNSCC的易感性增加有關(guān),但單一轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的NER通路標志物在預(yù)測HNSCC發(fā)病風(fēng)險上具有一定的局限性。目前,將兩種NER表型相結(jié)合來預(yù)測HNSCC發(fā)病風(fēng)險的研究較少。因此,本研究探討NER基因9個核心mRNA和蛋白的表達水平對HNSCC發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2015年1月至2021年12月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的HNSCC患者98例為病例組,另選取18歲及以上健康人群95例為對照組。本研究僅選取中國漢族人群作為研究對象。病例納入標準:新診斷為HNSCC;年齡≥18歲;未接受過手術(shù)治療(除診斷性穿刺術(shù));未患過其他腫瘤;病理診斷為口腔、咽部(除外鼻咽部)及喉部的SCC。排除標準:年齡<18歲;不愿提供相應(yīng)血液標本;中途退出研究;接受過任何化療或放療。本研究通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批,所有入選研究對象均被告知相關(guān)風(fēng)險并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 TRIzol法提取RNA:從血液標本中提取淋巴細胞,將淋巴細胞棄培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液清洗細胞培養(yǎng)板/瓶。每孔加入TRIzol試劑1 ml,裂解細胞,置入1.5 ml EP管中,震蕩60 s,并在室溫下放置13 min。在4 ℃下將裂解液離心15 min,離心后樣品分層,吸取上層RNA。取上清液至清潔的EP管中,離心13 min,棄上清液,可見沉于管底的RNA。取1 ml 75%乙醇加入沉淀中,離心13 min,棄除上清液。將EP管倒置于濾紙上5 min,測定OD值。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并置于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 熒光定量PCR檢測NER基因mRNA表達:每個擴增反應(yīng)在引物和Master混合物的體系中進行,95 ℃ 5 min,變性15 s,40 ℃循環(huán),60 ℃退火/延伸。以18S為內(nèi)參,通過ΔCt值計算9個NER基因的表達水平,ΔCt值越小表示mRNA表達水平越高。所有NER基因mRNA及18S rRNA引物由美國Applied Biosystems公司提供。

1.2.3 反相蛋白微陣列(RPPA)實驗:通過Aushon 2470點樣儀將裂解物置于載玻片上,將含有抗原的樣品放置3份。每個載玻片用一抗和偶聯(lián)的二抗進行檢測,將檢測芯片與每個抗體在室溫下孵育。使用Dako Cytomation-Catalyzed系統(tǒng)擴增信號,然后通過DAB比色反應(yīng)顯現(xiàn)信號。使用Array-Pro Analyzer軟件對芯片上的信號進行掃描和分析,以確定光電強度,隨后將其通過Logistic回歸的R包進行處理。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較 病例組年齡25～72歲,平均(55.22±12.45)歲。對照組年齡23～74歲,平均(55.48±14.27)歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.617,P=0.638)。病例組71.64%和對照組76.25%為男性,病例組28.36%和對照組23.75%為女性,兩組性別構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.214,P=0.271)。與對照組比較,病例組吸煙占比較高(58.23%與65.16%,χ2=52.245,P=0.028)。與對照組比較,病例組飲酒人群比例相對較多,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(66.31%與68.17%,χ2=45.653,P=0.105)。

2.2 兩組患者NER基因mRNA和蛋白質(zhì)表達水平比較 見表1。與對照組比較,病例組XPA mRNA和蛋白表達降低,XPB mRNA表達降低(均P<0.05)。

表1 兩組患者NER基因mRNA和蛋白質(zhì)表達水平比較

2.3 HNSCC發(fā)生影響因素Logistic回歸分析 見表2。根據(jù)對照組的中位水平將病例組NER mRNA和蛋白劃分為高、低表達水平。以XPA蛋白(≥0.206=0,<0.206=1)、XPA mRNA(>19.85=0,≤19.85=1)、XPB蛋白(≥0.582=0,<0.582=1)、XPB mRNA(>19.34=0,≤19.34=1)為自變量,以是否發(fā)生HNSCC(否=0,是=1)為因變量行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示XPA mRNA≤19.85和XPA蛋白<0.206是HNSCC發(fā)生的獨立危險因素(均P<0.05)。

表2 HNSCC發(fā)生影響因素Logistic回歸分析

2.4 NER基因mRNA和蛋白表達對HNSCC發(fā)生的預(yù)測價值 見表3。單獨XPA蛋白、XPA mRNA以及兩者聯(lián)合預(yù)測HNSCC發(fā)生的AUC分別為0.637、0.592、0.674。兩者聯(lián)合的AUC大于單獨XPA蛋白的AUC和單獨XPA mRNA的AUC(P=0.016、0.001)。

表3 NER基因mRNA和蛋白表達對HNSCC發(fā)生的預(yù)測價值

3 討 論

既往研究[15,17]證實,NER基因mRNA或蛋白表達水平降低分別與HNSCC易感性增加有關(guān)。由于NER通路中單一表型對HNSCC風(fēng)險預(yù)測的效能有限,因此我們將NER基因蛋白和mRNA的表達水平聯(lián)合作為一個新的水平來預(yù)測HNSCC的發(fā)病風(fēng)險。 本研究結(jié)果顯示,NER基因蛋白和mRNA聯(lián)合比單獨一種表型更有效地預(yù)測HNSCC的風(fēng)險。

國外研究[17]發(fā)現(xiàn),HNSCC風(fēng)險的增加與XPD、XPF、XPA和XPC蛋白表達水平的降低間存在相關(guān)性,因沒有合適的DDB1和XPB抗體,因此無法進行相關(guān)檢測。由于中國漢族人群中HNSCC的組成與非西班牙裔白種人有很大不同,本研究檢測了中國漢族人群中9種核心NER基因蛋白的表達水平并驗證了與HNSCC發(fā)病風(fēng)險間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)XPA mRNA和蛋白表達降低與HNSCC發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)。以上結(jié)果進一步支持NER通路的翻譯水平改變可能導(dǎo)致HNSCC的發(fā)病風(fēng)險增加,與轉(zhuǎn)錄水平相比,NER通路的翻譯水平對NER修復(fù)能力有直接影響這一觀點。既往對轉(zhuǎn)錄水平的研究[15]表明,在中國漢族人群中XPB mRNA表達水平的降低與HNSCC風(fēng)險增加有關(guān)。然而,在本研究中,在翻譯水平上未發(fā)現(xiàn)HNSCC與XPB的相關(guān)性。造成這種差異的原因可能是目前的研究樣本量不夠大。而且,NER基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平可能不直接相關(guān)。雖然NER基因的mRNA最終被翻譯成NER蛋白,但轉(zhuǎn)錄和翻譯過程可能遠不止是簡單的線性相關(guān),其進一步機制可能是順式作用和反式作用過程構(gòu)造了一系列系統(tǒng),促進或抑制從一定拷貝數(shù)的mRNA分子合成蛋白質(zhì),而翻譯水平更直接地參與NER修復(fù)過程[17]。

組成XPA蛋白的結(jié)構(gòu)域包括能夠與轉(zhuǎn)錄因子ⅡH肽1(GTF2H1)相互作用的C端結(jié)構(gòu)域,與RNA聚合酶Ⅰ亞基和ERCC1結(jié)合位點的N端結(jié)構(gòu)域以及負責DNA結(jié)合的中心結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域功能的變異可能導(dǎo)致NER過程異常,進而增加癌癥的易感性[18-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在漢族人群中HNSCC的易感性增加與XPA mRNA和蛋白表達水平降低有關(guān)。目前的結(jié)果與既往研究的非西班牙裔白人關(guān)于HNSCC風(fēng)險研究一致,表明XPA可能是兩個種族中HNSCC普遍的生物標志物。

雖然對NER mRNA表達水平的檢測易進行,但PCR檢測結(jié)果可能會因不同的細胞階段而波動。因此,從轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)來預(yù)測HNSCC的風(fēng)險可能是不穩(wěn)定的,需要另一個試驗來證實PCR試驗的結(jié)果。RPPA法是一種快速、經(jīng)濟、高效的檢測NER蛋白表達水平的方法[17]。既往研究在非西班牙裔白種人中,采用ROC曲線評估了NER蛋白對HNSCC發(fā)病風(fēng)險預(yù)測的效能,發(fā)現(xiàn)與未包含XPB和XPA表達水平相比,包含XPB和XPA表達水平的AUC顯著改善[17]。本研究發(fā)現(xiàn),與僅包含NER蛋白或mRNA的表達水平相比, 兩者聯(lián)合能顯著提高AUC。這些結(jié)果進一步表明,結(jié)合NER通路的兩種表型可以顯著提HNSCC風(fēng)險預(yù)測的有效性。

綜上所述,XPA mRNA和蛋白表達水平是HNSCC發(fā)生的影響因素,兩者聯(lián)合對HNSCC發(fā)生的預(yù)測價值高于單獨預(yù)測。