葉宗媛,許 雪,胡 娟

(合肥市第一人民醫(yī)院病理科,安徽 合肥 230061)

甲狀腺癌為頭頸部常見惡性腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)為甲狀腺癌主要病理類型,其相對懶惰特性使患者10年生存率超過90%,但是在發(fā)病早期較易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2-4]。研究[5-6]顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC患者腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的重要危險因素,因此研究者一直致力于盡早發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,并予以針對性干預(yù)治療,以改善患者預(yù)后。肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因作為RAF蛋白家族組成重要成員之一,被激活后可以磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK),進(jìn)而激活下游促有絲分裂信號細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,ERK),其突變是導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的重要原因之一[7]。研究[8]顯示,單一BRAF V600E基因突變出現(xiàn)在超過95%惡性腫瘤中,而PTC患者病灶中存在BRAF V600E基因突變,但是其是否與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)尚需要進(jìn)一步研究證實。生長分化因子15(Growth differentiation factor 15,GDF-15)是轉(zhuǎn)化生長因子家族重要組成成員之一,可能與惡性腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲關(guān)系密切,已被證實與多種惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切[9-10]?；诖?本研究探究BRAF V600F基因及GDF-15表達(dá)變化與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系,為后期PTC患者病情評估及預(yù)后改善提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年1月至2022年12月本院病理科確診的出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者60例為研究組,收集同期無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者53例為對照組。研究組中,男性29例,女性31例;年齡22～73歲,平均(42.13±14.74)歲。對照組中,男性13例,女性40例;年齡23～70歲,平均(47.00±12.07)歲。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn):患者病情依據(jù)甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南[11]及術(shù)后病理檢測確診;淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移依據(jù)淋巴結(jié)清掃術(shù)后病理予以證實;患者精神意識正常,可以配合研究中各項調(diào)查;患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他類型腫瘤者;其他病理類型甲狀腺癌者。研究進(jìn)行獲得患者知情同意,且符合《赫爾辛基宣言》中倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集:收集研究組患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理分型、包膜浸潤等臨床特征資料。

1.2.2 樣本收集:手術(shù)獲得樣本常規(guī)制片,行HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。在顯微鏡下標(biāo)記腫瘤病灶部位,選擇腫瘤部位進(jìn)行切片,盡可能避開鈣化及出血部位,切下蠟?zāi)?厚度5 μm)后轉(zhuǎn)移至潔凈離心管中待測。

1.2.3 BRAF V600E基因檢測:腫瘤組織中BRAF V600E基因突變情況采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行測定。收集石蠟組織采用DNA提取試劑盒[批號:20190625,天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。DNA純度及濃度采用紫外分光光度計進(jìn)行測定。DNA稀釋至5 μg/L后采用BRAF V600E基因突變檢測試劑盒(批號:20191019,廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行測定,所有步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀測定參數(shù):95 ℃條件下預(yù)變性處理10 min;95 ℃條件下退火處理15 s,60 ℃條件下延伸處理60 s,共進(jìn)行40個循環(huán)。獲得結(jié)果后依據(jù)Ct值大小判斷是否出現(xiàn)基因突變,若是Ct值≤35則表示出現(xiàn)基因突變。

1.2.4 GDF-15表達(dá)檢測:采用EnVision二步法試劑盒[批號:20190822,賽默飛世爾科技(中國)有限公司]進(jìn)行測定。石蠟切片脫蠟后采用抗原修復(fù)液修復(fù)15 min,雙氧水(0.3%)封閉3 min,一抗孵育后置于4 ℃環(huán)境中過夜。第2天棄去一抗并沖洗后滴加二抗,室溫環(huán)境下孵育30 min,隨后添加DAB室溫顯色5 min,蘇木素復(fù)染處理后應(yīng)用中性樹膠封閉。免疫組化結(jié)果由2位高年資高職稱醫(yī)師以雙盲法予以判定,隨機(jī)統(tǒng)計5個高倍鏡視野中100個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞占比,參照切片中陽性染色程度與陽性細(xì)胞數(shù)占比綜合評定染色結(jié)果[12],陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中有清晰淡黃色顆?；蛘咦睾稚w粒。陽性細(xì)胞占比計分:陽性細(xì)胞數(shù)占比<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別為0、1、2、3、4分。細(xì)胞染色程度計分:無陽性染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計分0、1、2、3分。兩項相乘后評分≥2分為陽性。

1.2.5 預(yù)后隨訪:所有患者均接受隨訪以評估預(yù)后,隨訪終末期為2023年1月30日或者患者病情進(jìn)展甚至死亡?；颊卟∏檫M(jìn)展甚至死亡為預(yù)后不良,否則為預(yù)后良好。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組患者BRAF V600E基因及GDF-15陽性表達(dá)差異;分析兩指標(biāo)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者臨床特征之間關(guān)系;分析兩指標(biāo)對PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值,以及兩指標(biāo)與PTC患者預(yù)后間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以[例(%)] 表示,行χ2檢驗;預(yù)測價值應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)行分析;預(yù)后應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)情況比較 見表1。研究組患者BRAF V600E基因突變率及GDF-15陽性表達(dá)率高于對照組(均P<0.05)。

2.2 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者臨床特征的關(guān)系 見表2。BRAF V600E基因突變、GDF-15陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤直徑、是否包膜侵犯有關(guān)(均P<0.05),而與患者性別、年齡、病灶類型無關(guān)(均P>0.05)。

表2 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值 見表3。ROC曲線分析顯示,BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)對PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有一定的預(yù)測價值,兩項聯(lián)合的預(yù)測價值更高(均P<0.05)。

表3 BRAF V600E基因突變及GDF-15陽性表達(dá)對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

2.4 BRAF V600E基因及GDF-15表達(dá)與PTC患者預(yù)后間的關(guān)系 見圖1。60例PTC患者中,失訪2例,余58例患者隨訪時間為11～35個月,中位隨訪時間為19.3個月。隨訪期間6例患者死亡,19例患者病情進(jìn)展,即預(yù)后不良患者25例,預(yù)后良好患者33例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示,BRAF V600E基因突變患者累積無進(jìn)展生存率低于BRAF V600E基因未突變患者(Log-Rank χ2=10.555,P<0.05),GDF-15陽性表達(dá)患者累積無進(jìn)展生存率低于GDF-15陰性表達(dá)患者(Log-Rank χ2=9.213,P<0.05)。

3 討 論

BRAF突變多發(fā)生于外顯子11與15,其突變類型主要為T1799A突變,嘌呤嘧啶取代處于1799位點位置的胸腺嘧啶,導(dǎo)致對應(yīng)蛋白質(zhì)中600位點中賴氨酸被谷氨酸替代而發(fā)生BRAF V600E突變[13-14]。本研究結(jié)果顯示,研究組患者BRAF V600E基因突變率較對照組高,表明PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與BRAF V600E基因突變有關(guān)。分析認(rèn)為,BRAF V600E基因突變導(dǎo)致BRAF基因結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,無需RAS基因作用即可不斷激活MAPK/ERK,導(dǎo)致PTC患者病情進(jìn)一步惡化而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15-17]。研究[18]顯示,PTC患者BRAF V600E突變率相對較高,其高侵?jǐn)_性生物學(xué)行為是導(dǎo)致患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加的主要原因,因此該研究將BRAF V600E突變作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨立預(yù)測因子,以便為患者手術(shù)淋巴結(jié)清掃提供合適參考依據(jù)。本研究中,BRAF V600E基因預(yù)測患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.642,顯示BRAF V600E基因突變用于預(yù)測PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定價值,間接證明BRAF V600E基因突變與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

Zhou等[18]研究顯示,當(dāng)PTC患者腫瘤直徑≥5 mm時,BRAF V600E突變陽性患者的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著升高,顯示BRAF V600E突變是中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的獨立危險因素,與本研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn),BRAF V600E基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤直徑、是否包膜侵犯有關(guān),顯示BRAF V600E基因突變可能與患者臨床特征關(guān)系密切,參與了PTC發(fā)生、進(jìn)展過程,但是其具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究予以證實。國外研究[19]顯示,野生型BRAF淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的死亡風(fēng)險沒有增加,但具有BRAF突變的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者死亡風(fēng)險相對較高,與本研究中不同BRAF V600E基因突變情況患者累積無進(jìn)展生存率分析結(jié)果一致。

GDF-15在炎癥、缺氧以及腫瘤發(fā)生等病理過程中經(jīng)由多種途徑影響細(xì)胞免疫應(yīng)答過程。此外,其還可以在腫瘤發(fā)生早期抑制腫瘤細(xì)胞生長,在晚期促進(jìn)腫瘤生長[20-21]。研究[22-23]顯示,結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌患者體內(nèi)血清GDF-15水平明顯上升,參與了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種惡性生理學(xué)過程。本研究結(jié)果顯示,相對于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC患者,存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者GDF-15陽性表達(dá)率較高,顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者體內(nèi)GDF-15表達(dá)有關(guān),這可能與GDF-15導(dǎo)致原癌基因受體絡(luò)氨酸酶激活從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與進(jìn)展有關(guān)[24]。國外研究[25]認(rèn)為,腫瘤患者體內(nèi)GDF-15促癌或者抑癌作用主要由細(xì)胞所處環(huán)境及狀態(tài)決定,正常情況下其可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,而腫瘤發(fā)生晚期其表達(dá)則會促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞形成、對治療敏感性降低及免疫逃逸發(fā)生。倪志強(qiáng)等[26]研究顯示,GDF-17在轉(zhuǎn)移病灶中高表達(dá),且與腫瘤直徑、臨床分期等臨床特征關(guān)系密切,與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,GDF-15陽性表達(dá)患者累積無進(jìn)展生存率顯著低于GDF-15陰性表達(dá)患者,顯示GDF-15表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系密切,GDF-15表達(dá)陽性患者腫瘤直徑大,患者病情嚴(yán)重,預(yù)后不良風(fēng)險相對較高。Kang等[27]研究顯示,GDF-15高表達(dá)所致腫瘤侵襲性是患者預(yù)后不良的主要原因,認(rèn)為GDF-15是一種線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)甲狀腺癌腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的有絲分裂因子,GDF-15誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化因子3激活決定了甲狀腺癌病情進(jìn)展,可能是導(dǎo)致患者預(yù)后不良主要原因。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),BRAF V600E基因突變聯(lián)合GDF-15陽性表達(dá)預(yù)測PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.719,高于兩項指標(biāo)的預(yù)測價值,提示兩者可能在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用,但是其具體作用機(jī)制尚需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實,

綜上所述,PTC患者BRAF V600E基因及GDF-15表達(dá)變化與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切,均可能參與了PTC病情發(fā)生及進(jìn)展過程,可以作為患者病情評估及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。