夏煥章, 翟 航

(沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院,遼寧 沈陽 110016)

微生物可以產(chǎn)生結構多樣、種類豐富的次級代謝產(chǎn)物,是天然藥物研發(fā)的寶庫,臨床上應用的微生物天然藥物主要來源于放線菌,這些物質(zhì)大多具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制、殺蟲等活性,廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)。隨著超級耐藥細菌的出現(xiàn)和腫瘤發(fā)生率的持續(xù)升高,深入挖掘微生物次級代謝產(chǎn)物,開發(fā)新作用機制和新結構母核的藥物前體變得越來越迫切。除此而外,為了降低藥物成本,高產(chǎn)菌株的構建是關鍵。本文從放線菌新結構挖掘和高產(chǎn)菌株構建兩個方面對近年來的研究進展進行介紹(圖1),為開發(fā)放線菌來源的新型藥物提供參考。

圖1 放線菌新結構挖掘和高產(chǎn)菌株構建的策略Fig.1 Strategies for new structure mining and high-yield strain construction of actinomycetes

1 從放線菌中挖掘新結構

放線菌是天然藥物的重要來源,有一半的抗菌藥物是放線菌來源的,在抗生素發(fā)現(xiàn)的黃金時代之后,主要以化學修飾的方式對已發(fā)現(xiàn)抗生素的毒性、耐藥性、物理化學特性等方面進行優(yōu)化,出現(xiàn)不斷迭代的現(xiàn)象,而從放線菌中分離有價值的新結構分子變得越來越難,因為按照傳統(tǒng)的篩菌模式分離得到的多是已發(fā)現(xiàn)的結構。拓展放線菌研究范圍,深入挖掘陸地和海洋來源的稀有放線菌,進一步優(yōu)化篩選方式對于先導化合物開發(fā)具有指導意義[1]。隨著放線菌基因組測序、基因組挖掘和基因編輯技術的成熟,激活大量未表達的沉默基因簇、異源表達實驗室條件下不生長微生物的基因簇、組合生物合成策略擴大非天然化合物庫、蛋白質(zhì)工程對關鍵酶改造等策略[2],對于從放線菌中挖掘新型結構具有重要意義。

1.1 挖掘稀有放線菌和優(yōu)化篩菌方式

自抗生素發(fā)現(xiàn)的黃金時代以來,陸生放線菌一直是抗生素發(fā)現(xiàn)的主要陣地。近年來從海洋中分離的稀有放線菌可以產(chǎn)生結構多樣的次級代謝產(chǎn)物,具有獨特的生物活性,成為抗生素發(fā)現(xiàn)的新資源。Subramani等[3]總結了海洋稀有放線菌產(chǎn)生的167種新的生物活性化合物,具有抗菌、抗腫瘤、抗蟲、抗瘧疾活性,其中小單孢菌屬是化學多樣性和獨特生物活性的最豐富來源。Chen等[4]總結了海洋放線菌分離得到的536個化合物,其中生物堿(37%)、多酮類(33%)和肽類(15%)占比最大,鏈霉菌屬(68%)、小單孢菌屬(6%)和諾卡菌屬(3%)是次級代謝物的主要生產(chǎn)者。除海洋來源的稀有放線菌,Zhang等[5]對陸生來源和海洋來源的稀有放線菌產(chǎn)生的新天然產(chǎn)物進行了總結,2006～2018年共報道515個新化合物,主要涉及大環(huán)內(nèi)酯類、聚酮類、蒽醌類、聯(lián)吡啶類、多烯類,這進一步證明稀有放線菌是新結構挖掘的寶貴資源,具有成藥潛力的新結構作為先導化合物被進一步研究,Gao等[6]從65 000株放線菌中篩選到一株稀有放線菌Nonomuraeasp. MJM5123,可以產(chǎn)生環(huán)肽類抗生素Ecumicin(圖2),它對結核分枝桿菌MIC為0.26 μg/mL,并且對利福平、鏈霉素、環(huán)絲氨酸耐受的結核分枝桿菌具有同等的抑菌效力,通過與ClpC1(Caseinolytic protein C1)作用發(fā)揮抑菌效果[7]。

傳統(tǒng)的篩菌方式是基于抗菌活性的篩選,并不是靶點導向的,這使其在后續(xù)研究中面臨以下問題:①候選分子滲透性太差或者被細胞外排;②該化合物作用的靶點在哺乳動物中也存在,可能具有毒副作用。為了優(yōu)化傳統(tǒng)的篩選方式,基于靶點的全細胞篩選策略(Target-based Whole Cell Strategy)被用于放線菌新結構的挖掘,其原理是減弱靶點的蛋白表達量會提高該受試菌對抗菌分子的敏感度,如果干擾組(降低表達量)抑菌圈大于不干擾組(不降低表達量),那么該抗菌分子則為該靶點的候選抑制劑。脂肪酸的合成對于細菌生長至關重要,并且脂肪酸合成過程中的酶功能和酶結構在細菌和哺乳動物中不同,這使得脂肪酸合成過程中的酶如FabI、FabF/B、FabH成為重要的抗菌靶點。默克公司建立了基于靶點的全細胞篩選平臺,以FabH、FabF、FabB為靶點,從250 000個放線菌或真菌提取液中篩選到抗菌劑Phomallenic acids C[8]、Platensimycin[9]、Platencin[10]對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌均有優(yōu)異的抑制能力。沈奔團隊對Platensimycin和Platencin(圖2)的生物合成過程進行研究,二萜合酶PtmT3負責醚環(huán)的起源[11],PtmO5負責醚鍵的形成[12],PtmO1/3/6/8負責羥化、還原和氧化[13],為該類化合物結構優(yōu)化和產(chǎn)量提高奠定基礎。含有噻唑的肽類抗生素早在1954年已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有良好的抑菌活性,如微球菌素(Micrococcin)、硫鏈絲菌素(Thiostrepton)等,由于水溶性較差,所以這類化合物并未走向臨床,但是其獨特的作用模式和較強的抑制耐藥菌活性使其再次成為研究熱點,Zhang等[14]基于抗性的全細胞篩選設計了一種對噻唑霉素(Thiazomycin)敏感-耐藥株的雙板活性篩選方案用于篩選噻唑霉素類似物,該方案表現(xiàn)為敏感株抑菌圈大于耐藥株抑菌圈,并且非此作用機制的抗生素無這一差異,最后在ActinoplanesphilippinensisMA7347中篩選到新的噻唑骨架Philipimycin,結構鑒定發(fā)現(xiàn)含有糖基修飾,作為噻唑霉素衍生物被進一步研究。

1.2 激活沉默基因簇

隨著對放線菌基因組數(shù)據(jù)的深入分析后發(fā)現(xiàn),一個基因組中有大約30～50個基因簇,而90%的基因簇在實驗室條件下處于沉默狀態(tài)。因此,激活放線菌中沉默基因簇是挖掘新結構的有效手段。目前激活沉默基因簇主要分為兩個方面,發(fā)酵過程方面和基因簇方面。在發(fā)酵過程方面包括改變培養(yǎng)基組成、優(yōu)化培養(yǎng)條件、共培養(yǎng)、添加化學激發(fā)子等;在基因簇方面包括敲除或過表達全局性調(diào)控子、激活途徑特異性調(diào)控因子、替換目標基因簇的啟動子、異源表達整個基因簇等策略[15]。

金屬離子作為化學激發(fā)子常常被用于激活沉默基因簇,Shi等[16]從深海熱泉噴口處分離到Streptomycessp.WU20,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加金屬離子后產(chǎn)生了新化合物,具有抑制枯草芽胞桿菌的活性。Akhter等[17]以Streptomycespratensisstrain NA-ZhouS1為研究對象,在100 μmol/L氯化鎳激活下可以產(chǎn)生兩個新的芳香聚酮類抗生素Stremycin A/B,對銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度小于16 μg/mL。自然條件下放線菌產(chǎn)生抗生素是為了抑制周圍的微生物來爭奪更多的生存營養(yǎng),可以看成是其他微生物的誘導作用激發(fā)了放線菌的產(chǎn)抗能力,于是共培養(yǎng)其他微生物來模擬自然界的微生物相互作用也被用于激活沉默基因簇。Carlson等[18]考察了不同類型細菌激活鏈霉菌沉默基因簇Resistomycin的潛力,變形桿菌的產(chǎn)生率(65%)明顯高于厚壁菌門(5.9%)和放線菌門(9.1%)的菌株。Shin等[19]將芽胞桿菌與海洋鏈霉菌共培養(yǎng)后,分離得到一個新的環(huán)肽類化合物Dentigerumycin E,具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移的活性。

全局性調(diào)控因子在時機適宜時會調(diào)控多個基因簇的表達,對菌體生長發(fā)育、形態(tài)結構、次級代謝產(chǎn)物的形成均有影響,改變?nèi)中哉{(diào)控因子的表達量是激活沉默基因簇的常用策略。目前報道的全局性調(diào)控因子包括bld、nsdA、farR1、abrC、ScbR、adpA、crp等。Yushchuk等[20]以StreptomycescyanogenusS136為研究宿主,過表達adpA后激活了Lucensomycin基因簇的表達。Xu等[21]敲除Streptomycesansochromogenes中的adpA后發(fā)現(xiàn),Nikkomycin的合成被抑制,而Oviedomycin基因簇被激活。Ameruoso等[22]使用CRISPRi和CRISPRa技術對委內(nèi)瑞拉鏈霉菌內(nèi)源性調(diào)控網(wǎng)絡進行干擾,使用CRISPRi敲低jadR2并且使用CRISPRa激活結構基因,成功激活Jadomycin B的產(chǎn)生,通過可編程的工具包對調(diào)控網(wǎng)絡進行干擾可以有效地激活沉默基因簇。然而,通過全局性調(diào)控因子來激活沉默基因并不總是成功的,因為菌體內(nèi)調(diào)控是非常復雜的網(wǎng)絡式調(diào)節(jié),其細節(jié)需要進一步研究。如果將基因簇表達和基因簇調(diào)控分開,避開復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,將結構基因置于強啟動子下重構基因簇,或者直接在背景較為清晰的模式宿主中表達將是一種有效的手段,但大片段基因的克隆和操縱是技術瓶頸。轉化相關重組技術(Transformation-associated recombination,TAR)是利用釀酒酵母體內(nèi)高效的同源重組作用獲得大片段基因簇,這使得異源表達基因簇成為可能。Shao等[23]報道了一種即插即用的沉默簇表達工具,包括啟動子模塊、輔助模塊和結構基因模塊,在強啟動子作用下高效表達每個結構基因從而重構基因簇,在變鉛青鏈霉菌中成功激活了Spectinabilin的生產(chǎn)。Yamanaka等[24]對Saccharomonosporasp. CNQ-490基因組信息分析時發(fā)現(xiàn)一個和達托霉素合成基因高度相似的沉默的NRPS基因簇,利用TAR技術進行大片段克隆并刪除推測的負調(diào)控基因和非必須基因,然后在天藍色鏈霉菌中異源表達,成功獲得一個新的脂肽類化合物Taromycin A。由于細菌中的基因表達是成串的,所以激活沉默基因簇中多個結構基因可以看成激活沉默基因簇的多個操縱子,為了將強啟動子更容易地嵌入多個操縱子中,Montiel等[25]使用酵母同源重組、基于營養(yǎng)缺陷的酵母選擇系統(tǒng)和序列正交啟動子盒,開發(fā)了一個啟動子工程平臺,以四環(huán)素基因簇驗證該方法和天然活性簇效率相當,然后在異源宿主中激活了沉默簇Lzr的表達。Zhang等[26]使用CRISPR-Cas9敲入技術同時在5個鏈霉菌屬中敲入強啟動子,激活了S.viridochromogenes基因組中一個Ⅱ型PKS基因簇。

1.3 基因工程和組合生物合成

次級代謝產(chǎn)物的中間體因為含量低而難以分離得到,作為次級代謝產(chǎn)物的類似物可能具有更優(yōu)良的特性,在生物合成途徑解析的基礎上,利用基因工程策略可以大量積累次級代謝產(chǎn)物的中間體。Qi等[27]將匹馬霉素合成過程中的P450單加氧酶scnG失活后產(chǎn)生了3個匹馬霉素類似物:12-脫羧-12-甲基匹馬霉素(1)、4,5-脫氧-12-脫羧-12-甲基匹馬霉素(2)、3-羥基-4,5-脫氧-12-脫羧-12-甲基匹馬霉素(3)?；衔?具有更強的抗真菌活性且毒性降低了4.5倍。制霉菌素類似物NPP A1(Nystatin-likePseudonocardiapolyene A1)被鑒定為一種獨特的含有雙糖的四烯類抗真菌大環(huán)內(nèi)酯,由假諾卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)產(chǎn)生[28],其水溶性顯著增加,溶血活性降低。Kim等[29]通過定點突變失活了PKS模塊5中的烯基還原酶,產(chǎn)生了NPP B1,體外和體內(nèi)抗真菌活性和毒性研究表明,其對白色念珠菌表現(xiàn)出相當?shù)目拐婢钚?但毒性低于兩性霉素B,這表明NPP B1可能是一種很有前途的候選藥物。Su等[30]將Ecumicins生物合成基因簇中的ecuN敲除,生成C3位置未羥基化的EcuH16,該化合物具有更好的抗結核桿菌活性。

除了基因工程可以獲得新結構,組合生物合成策略也常用于擴展次級代謝產(chǎn)物多樣性,這與同源酶的底物寬泛性關系密切。聚酮類化合物的生物合成過程具有“裝配線”特征,利用組合生物合成策略將聚酮合成簇中的模塊或者結構域進行替換重組,有望合成新型的聚酮類化合物。Ruan等[31]將紅霉素基因簇Module 1中的AT domain用特異性識別丙二酰輔酶A的Hyg-AT2(rapamycin cluster)、Ven-AT(pikromycin cluster)、RAPS-AT14(rapamycin cluster)替換,得到C12丟失甲基的12-desmethyl-12-deoxyerythromycin A,將Module 2中的AT domain用特異性識別丙二酰輔酶A的AT替換,得到C10位丟失甲基的10-desmethylerythromycin A和10-desmethyl-12-deoxyerythromycin A。阿維菌素和米貝爾霉素作為殺蟲劑被廣泛用于農(nóng)業(yè),但仍然面臨耐藥問題和毒性問題,伊維菌素B1a是將阿維菌素B1a的C22,23位雙鍵還原得到,保持抗蟲活性的同時大大降低毒性。Zhang等[32]將阿維菌素合成簇中的aveDH2-KR2用米貝爾霉素合成簇中的milDH2-ER2-KR2替換,直接在阿維菌素產(chǎn)生菌中發(fā)酵生產(chǎn)伊維菌素,產(chǎn)量達(3 450±65) μg/mL。為了進一步獲得新的伊維菌素類似物,在上述菌株基礎上將加載模塊aveLAT-ACP替換為milLAT-ACP,獲得了兩個新的伊維菌素類似物,它們在C25位保持和米貝爾霉素一致的甲基取代,這兩個新化合物按照一定比例混合對抗秀麗隱桿線蟲活性比伊維菌素高4.5倍,比米貝爾霉素高2.5倍。糖基化修飾對于活性和物理化學特性至關重要,Malmierca等[33]將6種不同的脫氧糖合成基因導入Sipanmycins產(chǎn)生菌中,形成了6種新型Sipanmycins類似物,在失活L-谷氨酸合成酶后補加不同類型的 β-氨基酸期望定向替換天然的起始單元,添加3-氨基戊酸時獲得兩個新化合物,活性研究時發(fā)現(xiàn)有4個新化合物抗金黃色葡萄球菌活性提高,抗腫瘤活性相當或降低。

1.4 拓展關鍵酶的底物譜

聚酮類化合物具有類似的碳骨架合成過程,?；D移酶(Acyltransferase,AT)、酮合酶(Ketosynthase,KS)、?；d體蛋白(Acyl carrier protein,ACP)負責在聚酮鏈合成中添加延伸單元,組合的酮還原酶(Ketoreductase,KR)、脫氫酶(Dehydratase,DH)、烯還原酶(Enoylreductase,ER)、甲基轉移酶(Methyltransferase,MT)負責改變酮基氧化態(tài),硫酯酶(Thioesterase,TE)負責釋放和環(huán)化聚酮骨架,經(jīng)過糖基修飾后得到結構多樣的聚酮類化合物,所以聚酮結構多樣性與AT識別底物多樣性、β -酮基氧化態(tài)、聚酮鏈長度、后修飾過程等因素關系密切[34]。一般情況下AT只識別丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A,如果可以擴展?；D移酶的底物譜將有望合成新型的聚酮骨架,但是AT蛋白質(zhì)工程仍然面臨機制不清楚的問題,Li等[35]解析SpnD-AT晶體結構,通過點突變對底物識別殘基Q150/Y278/S280進行研究,并且對紅霉素合成過程中的Ery-AT6進行改造,得到突變體Y278G/S280G對戊炔基丙二酰輔酶A、庚烯基丙二酰輔酶A和芐基丙二酰輔酶A識別能力增強,這為拓展聚酮骨架獲得新型聚酮化合物提供參考。TE負責聚酮鏈的釋放和骨架環(huán)化,而對非天然底物不進行環(huán)化,Koch等[36]對Pikromycin PKS中的硫酯酶進行結構分析,獲得突變體TES148C可以識別天然底物的異構體C11-OH(S),產(chǎn)生苦霉素異構體,這為拓展硫酯酶底物譜獲得新聚酮結構提供參考。

2 提高放線菌的產(chǎn)抗能力

從自然界分離得到的菌株生產(chǎn)活性物質(zhì)的能力一般不高,這不僅無法滿足工業(yè)需求,而且會增加分離純化的成本,所以,在新結構挖掘的基礎上提高該宿主菌產(chǎn)抗能力成為首要任務。傳統(tǒng)的誘變-篩選育種過程費時費力,若結合新技術對誘變過程和篩選過程進行優(yōu)化則可大大提高效率,再對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過程進行優(yōu)化可以顯著提高產(chǎn)抗水平。在分子層面,使用基因工程和代謝工程策略對菌株的初級代謝和次級代謝過程進行改造成為構建高產(chǎn)菌株的有效手段,這主要包括改變調(diào)控因子的表達量,增加前體供應,減少競爭途徑的分流,提高限速酶的酶量和酶活、基因簇重構和異源表達,進一步將上述策略組合最大限度地激發(fā)宿主的產(chǎn)量能力。

2.1 誘變育種和發(fā)酵優(yōu)化策略

通過誘變育種篩選高產(chǎn)菌株雖然面臨工作量大、耗時耗力等問題,但仍然是提高放線菌產(chǎn)抗能力的有效策略。除了傳統(tǒng)的物理誘變(紫外線、X射線)和化學誘變(亞硝基胍、甲基磺酸乙酯)外,常壓室溫等離子體技術(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)在微生物誘變育種中的應用越來越廣泛。依據(jù)產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)(紫外吸收、易反應基團)或生物性質(zhì)(抗菌活性)建立高通量篩選方法是優(yōu)化篩選過程的關鍵,培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過程優(yōu)化被用于進一步提高目標化合物產(chǎn)量。Streptomyceshygroscopicus可以生產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯類化合物FK520,具有良好免疫抑制活性,Yu等[37]以S.hygroscopicusATCC 14891為出發(fā)菌株,通過ARTP誘變篩選到高產(chǎn)菌株SFK-36,結合響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基使FK520產(chǎn)量從373 mg/L提高到1 588 mg/L。隨后,以SFK-36為出發(fā)菌株,將紫外線誘變與鏈霉素抗性篩選相結合[38],篩選到菌株SFK-6-33,使FK520產(chǎn)量從1 588 mg/L提高到2 432 mg/L。Yu等[39]開發(fā)了一種利用鏈霉素抗性預篩選(8 g/mL)和24孔板微孔板讀數(shù)器(臺盼藍分光光度法)重篩選策略的高通量篩選方法,通過六輪ARTP誘變,篩選到一株高產(chǎn)新霉素的突變株Sf6-2,效價為(7 780±110) U/mL,優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后效價增加到(10 849±141) U/mL。

2.2 基因工程和代謝工程策略

2.2.1 調(diào)控因子 Smanski等[40]鑒定了Platensimycin和Platencin的生物合成基因簇,敲除負調(diào)控子ptmR1后產(chǎn)量提高100倍,二者產(chǎn)量分別為(323±29) mg/L和(255±30) mg/L。StreptomycesrimosusM527可以生產(chǎn)多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素龜裂霉素(Rimocidin),可有效防治多種植物真菌病害。Liao等[41]敲除該菌中的全局性調(diào)控因子nsdA,龜裂霉素產(chǎn)量提高46%,結構基因的轉錄水平均上調(diào),并且菌絲分化速度加快。米貝爾霉素因具有良好的殺蟲活性被用于農(nóng)業(yè),Streptomyceshygroscopicus發(fā)酵產(chǎn)生Milbemycin A3/A4和5-oxo-Milbemycin A3/A4,后者是米貝爾霉素化學修飾的重要前體,Wei等[42]發(fā)現(xiàn)milR2是5-oxo-Milbemycin A3/A4生產(chǎn)的正調(diào)控因子,敲除milR2后5-oxo-Milbemycin A3/A4的生成減少了39%,過表達milR2后5-oxo-Milbemycin A3/A4的生成增加了34%。Streptomycesavermitilis產(chǎn)生的阿維菌素也是一種重要的殺蟲劑,Liu等[43]發(fā)現(xiàn)TerR家族的aveT是阿維菌素生物合成的正調(diào)控因子,通過激活簇內(nèi)的avrR、抑制轉膜外排蛋白aveM來促進阿維菌素的生成,進一步在阿維菌素工業(yè)菌株A-178中過表達aveT,產(chǎn)量提高22%;敲除aveM,產(chǎn)量提高42%(11 400 mg/L)。

2.2.2 前體供應和競爭路徑 宿主積累前體物質(zhì)的能力影響宿主產(chǎn)抗能力,前體物質(zhì)主要是從單糖、脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)轉化而來,通過前體喂養(yǎng)、操縱前體合成中的限速酶、改變前體競爭途徑的流向是增加前體供應的常用手段。乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A是聚酮類化合物的重要前體,Yu等[38]在StreptomyceshygroscopicusSFK-6-33基礎上過表達內(nèi)源性巴豆酰輔酶A羧化酶FkbS增加乙基丙二酰輔酶A,過表達乙酰輔酶A羧化酶ACCase來增加丙二酰輔酶A,使FK520產(chǎn)量從2 432 mg/L進一步提高到3 511 mg/L。支鏈脂肪酸降解后可以產(chǎn)生大量乙酰輔酶A前體,支鏈α-酮酸脫氫酶(Branched chain α-keto acid dehydrogenase,BCDH)和乙酰輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase,ACDH)可以將亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸轉化為乙酰輔酶A前體,并在聚酮合成過程中受到脂肪酸合成路徑(FAS)的競爭,為了降低FAS競爭路徑的關鍵酶KASIII的表達量,Yi等[44]將KASIII啟動子替換為弱啟動子PSCO1214,過表達BCDH和ACDH,Pikromycin產(chǎn)量提高1.3倍,三羧酸循環(huán)中的琥珀酸輔酶A在甲基丙二酰輔酶A變位酶(Methylmalonyl-CoA mutase, MCM)轉化下生成甲基丙二酰輔酶A,將BCDH和MCM同時過表達,Pikromycin產(chǎn)量提高2.3倍。

2.2.3 限速酶的酶量和酶活 在多步的生物合成過程中,某一步生化反應可能受到終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物抑制、簇內(nèi)簇外調(diào)控等因素而成為次級代謝產(chǎn)物合成中的限速步驟,有目的地增加限速酶的含量或者提高限速酶的活性有望提高發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵水平。在紅霉素A合成的兩條途徑中,若Eryk先對C12位羥基化,然后EryG在C3″-OH進行甲基化會產(chǎn)生中間體紅霉素C,若先進行甲基化再進行羥基化會產(chǎn)生中間體紅霉素B,二者生物活性低且副作用大,是紅霉素A分離純化中的主要雜質(zhì),Chen等[45]通過調(diào)節(jié)羥化酶EryK和甲基轉移酶EryG的酶量,幾乎完全消除了紅霉素B和C的生成,并將紅霉素A的產(chǎn)量提高了25%。糖肽類抗生素(Chloroeremomycin)A82846是半合成抗生素奧利萬星的關鍵前體,主要由AmycolatopsisorientalisSIPI18099發(fā)酵生產(chǎn),而A82846A(63.6%)和A82846C(12%)是發(fā)酵過程中的主要雜質(zhì),3個化合物的差異在于含有氯原子的數(shù)目不同,A82846的氯原子含量最多,鹵化酶活性不足可能是雜質(zhì)積累的主要原因,過表達鹵化酶chal并增加其拷貝數(shù)[46],雜質(zhì)A82846A(22.5%)和A82846C(1%)均大幅減少,A82846B成為主成分(831 mg/L),含量提高23%。Li等[47]在構建多殺菌素異源表達菌株時,產(chǎn)生了一半的多殺菌素B(N端單甲基)雜質(zhì),過表達甲基轉移酶SpnS后雜質(zhì)幾乎不再產(chǎn)生,進一步過表達限速酶SpnP來加強SpnS的產(chǎn)物消耗,使多殺菌素A產(chǎn)量提高5.3倍(5 800 μg/L),雜質(zhì)減少90%。Zhang等[48]將甲基轉移酶EgtD、裂解酶EgtE和亞砜合酶TncEgt1在大腸埃希菌中表達,可以產(chǎn)生70 mg/L的麥角硫因?；邴溄橇蛎阜纸恹溄橇蛞虍a(chǎn)生有紫外吸收的羧酸衍生物原理建立了高通量篩選方法,對TNcEgt1和EgtD進行定向進化以提高酶活,最優(yōu)突變體MD4產(chǎn)生290 mg/L的麥角硫因,在5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵過程優(yōu)化后產(chǎn)量可達到5.4 g/L。

2.2.4 異源表達和基因簇重構 除了用上述策略對天然宿主改造外,將感興趣的基因簇在遺傳背景清晰、基因操作成熟的模式宿主中表達是挖掘新結構、研究生物合成途徑、生成更多次級代謝產(chǎn)物的常用策略,而大片段克隆技術是實現(xiàn)上述過程的基礎。從BAC衍生的pStreptoBAC載體被用于克隆達托霉素基因簇[49],使用已表征的基因探針在玫瑰孢鏈霉菌基因組文庫中釣取到128 kb的達托霉素基因簇,鑒定了3個關鍵的合成基因,并在變鉛青鏈霉菌中成功表達。通過限制性酶切位點將大片段連接到含有穿梭和表達元件的載體上效率較低,體內(nèi)同源重組被用于大片段質(zhì)粒的構建,如在大腸埃希菌中RecET介導的線-環(huán)同源重組(Linear and Circular Homologous Recombination,LCHR),Jones等[50]利用該技術將鏈霉菌穿梭和表達元件pIB139AF2通過融合和重組兩步安裝到含有FK506完整基因簇的pBAC-FK506骨架上,并在S.albusJ1074宿主中成功整合。Song等[51]重構了多殺菌素合成基因簇,將23個結構基因分為7個操縱子,分別置于組成型強啟動子下,將其在白色鏈霉菌中異源表達,相比于異源表達原始基因簇,重構多殺菌素基因簇后產(chǎn)量提高了328倍,達到1 116 μg/L。

2.2.5 多策略的組合 將上述提及的多種策略進行組合搭配可以最大限度地激發(fā)放線菌產(chǎn)抗能力。Li等[52]以轉錄組數(shù)據(jù)為依據(jù),過表達正調(diào)控因子TetR1、過表達簇中的限速酶、減弱糖原合成路徑、增強糖原磷酸化路徑來提供更多的前體物質(zhì)G-1-P,使阿卡波糖產(chǎn)量從1.74 g/L提高到2.92 g/L,在發(fā)酵罐中分批補加葡萄糖和麥芽糖,阿卡波糖產(chǎn)量可以達到8.04 g/L。米卡芬凈作為棘白菌素類抗真菌劑被廣泛用于治療侵襲性真菌感染,FR901379是米卡芬凈化學合成的原料,Men等[53]表達限速酶McfF和McfH來優(yōu)化FR901379的生物合成途徑,消除不需要的副產(chǎn)物,過表達轉錄激活因子McfJ,FR901379的產(chǎn)量從0.3 g/L提高到1.3 g/L,共表達mcfJ、mcfF和mcfH后進一步在5 L發(fā)酵罐中優(yōu)化分批補料條件,FR901379的產(chǎn)量達到4.0 g/L。為了提高FK506的發(fā)酵水平,Wu等[54]基于基因組測序和分析,刪除了假定的競爭途徑、重構FK506生物合成基因簇、增加前體供應,使FK506產(chǎn)量從140.3 mg/L增加到603 mg/L,對其發(fā)酵過程進一步優(yōu)化后,在15 L發(fā)酵罐中FK506產(chǎn)量可達830.3 mg/L。

3 展 望

放線菌次級代謝產(chǎn)物在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等領域具有廣闊的應用價值,從批準上市的抗菌藥物來看,放線菌仍然是產(chǎn)生結構新穎、效果顯著的藥物分子的主力軍。在耐藥菌廣泛存在,新型細菌、新型病毒不斷出現(xiàn)的大背景下,開發(fā)新藥和提高產(chǎn)量是放線菌藥物資源開發(fā)的兩大主要目標。深入挖掘稀有放線菌資源、優(yōu)化傳統(tǒng)的篩菌模式是放線菌新藥資源開發(fā)的方面之一,在分子水平對次級代謝產(chǎn)物合成的基因簇進行研究具有重要意義。在提高放線菌產(chǎn)抗能力策略中,在傳統(tǒng)誘變育種的基礎上取長補短,建立靈敏高效的篩選方法并結合抗性篩選是提高產(chǎn)量的有效策略。在闡明生物合成途徑的基礎上通過基因工程和代謝工程來組合多種高產(chǎn)策略,如增加或降低調(diào)控子的表達、增加前體供應、減少競爭途徑、增加限速酶的酶量和酶活是構建高產(chǎn)菌株的一般策略,但這仍然是基于次級代謝產(chǎn)物生物合成過程有限的知識之上。近年來,DNA測序和合成成本的下降,基因組學、轉錄組學、蛋白質(zhì)組學的出現(xiàn),生物信息學的快速發(fā)展,基因編輯技術的不斷更新為我們更深入地了解菌體復雜的代謝網(wǎng)絡奠定了基礎,這對于放線菌新藥開發(fā)和產(chǎn)量提高具有重要的意義。