王語陽，蘇拾香，覃宗帥，岑蘭英，黃秀權(quán)，黃桂香，徐 鍵，覃月秋

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，早期診斷困難，病死率高［1］。研究表明，細(xì)胞凋亡與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚不清楚［1］。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一個(gè)高度保守的核蛋白，屬于非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白。它于1973 年從小鼠胸腺染色質(zhì)中首次提取，并因其在凝膠電泳中的高流動(dòng)性而得名。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 在胰腺癌組織中表達(dá)水平升高，且已被證實(shí)通過增加細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)線粒體功能參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展［2-4］。通過抑制HMGB1 蛋白表達(dá)，可以促進(jìn)Bax 蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2 蛋 白 表 達(dá)，從 而 促 進(jìn) 胰 腺 癌 細(xì) 胞 的 凋 亡［5，6］。miR-129-5p 屬于一個(gè)保守的microRNA 家族，是與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和耐藥性等多種生物學(xué)過程的相關(guān)的小分子RNA［7-10］，研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中miR-129-5p 表達(dá)下調(diào)，且與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、預(yù)后相關(guān)［11，12］。生物信息學(xué)分析及文獻(xiàn)報(bào)道表明，miR-129-5p 與HMGB1 具有靶向調(diào)控關(guān)系［13］，但其對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響尚不明確，為此，本文擬探討miR-129-5p 調(diào)控HMGB1 表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用，為尋找新的胰腺癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990 購自澳睿賽生物技術(shù)（上海）有限公司。

1.1.2 主要試劑 特級(jí)胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司，DMEM、PBS、Bcl-2、10×SDSPAGE 電泳緩沖液、10×Tris-Glycine 轉(zhuǎn)膜緩沖液、PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，Hoechst 染色試劑盒、QuickBlock Western 快速封閉液、彩虹Marker 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RIPA 裂解液購自英文特生物技術(shù)（北京）有限公司，胰蛋白酶-EDTA 消化液、青鏈霉素混合液、20×TBST、PMSF、蛋白磷酸化酶抑制劑購自北京索萊寶科技有限公司，HMGB1、Caspase 3、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白（H+L）HRP、山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP 購自江蘇親科生物研究中心有限公司，質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 購自上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司，PVDF 膜購自美國Millpore 公司，opti-MEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司。超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自莫納（蘇州）生物科技有限公司，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。qRT-PCR 引物購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將胰腺癌SW1990 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清及雙抗）中，將其置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1990 細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000 試劑說明書進(jìn)行，以未處理的胰腺癌SW1990 細(xì)胞作為對(duì)照組（Control 組），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將mimics-NC（空載體）、miR-129-5p mimics、inhibitor-NC（空載體）、miR-129-5p inhibitor 分別轉(zhuǎn)染SW1990 細(xì)胞作為mimics-NC 組、miR-129-5p 過表達(dá)組（miR-129-5p mimics 組）、inhibitor-NC 組、miR-129-5p 低表達(dá)組（miR-129-5p inhibitor 組）。將各組待轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體和Lipofectamine3000 分別用OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基稀釋后靜置10 min，再將兩者混勻靜置10 min，加入各孔細(xì)胞中，在各孔中加入1.7 mL OPTI-MEM 無血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miR-129-5p 靶基因預(yù)測(cè) 通過在線靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Target genes（http：//www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)miR-129-5p 與HMGB1 的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建LT-h-HMGB1-3UTR-wt、LT-h-HMGB1-3UTR-mut 質(zhì)粒（漢恒上海），通過Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將LT-h-HMGB1-3UTR-wt 和LT-h-HMGB1-3UTR-mut 分別與miR-129-5p mimics 和miR-129-5p-NC 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè) 將各組細(xì)胞根據(jù)不同目的基因轉(zhuǎn)染24 h 后，用Trizol 提取各組細(xì)胞總RNA，使用諾唯贊miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，其中miR-129-5p 的內(nèi)參為U6，RT-qPCR 的反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 300 s，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用2-ΔΔCt法分析，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab 1 RT-qPCR primer sequences

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h 后各組SW1990 細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，加人100 μL RIPA Lysis Buffer（含PMSF、蛋白磷酸化酶抑制劑），置于冰上充分裂解后置于高速低溫離心機(jī)中12 000 r/min 離心20 min，取上清液置于新的EP 管中，按BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。用12.5% SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，90 min，置于冰上250 mA 恒 流轉(zhuǎn)膜1 h 轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF 膜 上，Quick-Block Western 封閉液封閉1 h。TBST 洗膜3 次后，分別加入稀釋后的兔抗人HMGB1 抗體（1∶1 000）、兔抗人Caspase3 抗體（1∶1 000）、鼠抗人Bcl-2 抗體（1∶1 000）、兔抗人β-actin 抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，再用稀釋后羊抗兔IgG-HRP（1∶6 000）、羊抗鼠IgG-HRP（1∶6 000）二抗室溫孵育2 h。按照ECL顯影試劑盒說明，用美國伯樂公司凝膠掃描分析系統(tǒng)檢測(cè)和成像，用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 Hoechst 染色 將對(duì)數(shù)期SW1990 細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔種于6 孔板中，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸盡培養(yǎng)液，PBS 洗3 遍，加入0.5 mL 固定液，固定10 min。去固定液，置于搖床上用PBS 洗兩遍，吸盡液體。置于搖床上加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，避光孵育5 min。棄染色液，用PBS 洗兩遍，吸盡液體。用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡并拍照記錄，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后多組計(jì)量資料間的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p 與HMGB1 存在靶向互作的關(guān)系

靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Target genes 結(jié)果顯示，miR-129-5p 與HMGB1 的3'-UTR 結(jié)構(gòu)域有結(jié)合區(qū)域，見圖1。

圖1 miR-129-5p 與HMGB1-3' UTR 靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖Fig 1 The binding diagram of miR-129-5p and HMGB1-3'UTR target site

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-129-5p 與HMGB1 的 靶向關(guān)系

轉(zhuǎn)染野生型HMGB1 基因表達(dá)載體WTHMGB1 后，與NC mimics 對(duì)照組相比，miR-129-5p-3' UTR-WT 的luciferase 的 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào)（t=29.39，P＜0.001），而轉(zhuǎn)染突變型HMGB1 基因表達(dá)載體MUT-HMGB1 后，與NC mimics 對(duì)照組相比，miR-129-5p-3' UTR-MUT 的luciferase 的 表 達(dá)差異不顯著（t=0.61，P=0.57＞0.05）?？梢姡琺iR-129-5p 可以靶向調(diào)控HMGB1 的表達(dá)，見圖2。

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-129-5p 靶向結(jié)合HMGB1Fig 2 Double-luciferase experiment to verify the targeted binding of mir-129-5p to HMGB1

2.3 各組細(xì)胞中miR-129-5p 的表達(dá)水平

qRT-PCR 結(jié)果顯示（表2），miR-129-5p mimics組miR-129-5p 表達(dá)水平較mimics-NC 組、Control 組表達(dá)水平顯著上調(diào)（均P＜0.001），miR-129-5p inhibitor 組miR-129-5p 表達(dá)水平較inhibitor-NC 組、Control 組表達(dá)水平顯著下調(diào)（均P＜0.05）。Mimics-NC 組、Control 組、inhibitor-NC 組miR-129-5p mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3。

表2 qRT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞miR- 129-5p 的相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 2 The relative expression of miR-129-5p in each group detected by qRT-PCR（±s）

注：a：與Control 組相比，P＜0.05；b：與Control 組相比，P＜0.001；c：與mimics-NC 組相比，P＜0.001；d：與inhibitor-NC 組相比，P＜0.05。

miR-129-5p 1.66±0.14bc 0.96±0.04 0.99±0.22 1.02±0.24 0.65±0.02ad組別miR-129-5p mimics 組mimics-NC 組Control 組inhibitor-NC 組miR-129-5p inhibitor 組

2.4 過表達(dá)及抑制miR-129-5p 表達(dá)對(duì)HMGB1、Bcl-2、Caspase 3 表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示（表3），與mimics-NC 組及Control 組相比較，miR-129-5p mimics 組HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.01），Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.05）；與inhibitor-NC 組及Control 組相比較，miR-129-5p inhibitor 組HMGB1 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05），Bcl-2 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）；miR-129-5p mimics 組Caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于mimics-NC 組（P＜0.01）及Control 組（P＜0.05）；miR-129-5p inhibitor 組Caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于inhibitor-NC組（P＜0.01）及Control 組（P＜0.001）。mimics-NC組、Control 組、inhibitor-NC 組HMGB1、Bcl-2、Caspase 3 蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），結(jié)果提示：過表達(dá)miR-129-5p 可以抑制HMGB1 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)SW1990 細(xì)胞凋亡，抑制miR-129-5p 可以使HMGB1 蛋白表達(dá)增加，抑制SW1990 細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖4 各組對(duì)胰腺癌SW1990 細(xì)胞HMGB1 蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4 The effects of each group on the expression of HMGB1 protein and apoptosis-related protein in pancreatic cancer SW1990 cells

表3 各組對(duì)胰腺癌SW1990 細(xì)胞HMGB1 蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab 3 The effects of each group on the expression of HMGB1 protein and apoptosis-related protein in pancreatic cancer SW1990 cells（±s）

表3 各組對(duì)胰腺癌SW1990 細(xì)胞HMGB1 蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab 3 The effects of each group on the expression of HMGB1 protein and apoptosis-related protein in pancreatic cancer SW1990 cells（±s）

注：a：與Control 組相比，P＜0.05；b：與Control 組相比，P＜0.01；c：與Control 組相比，P＜0.001；d：與mimics-NC 組相比，P＜0.05；e：與mimics-NC 組相比，P＜0.01；f：與inhibitor-NC 組相比，P＜0.05；g：與inhibitor-NC 組相比，P＜0.01。

Caspase 3 1.18±0.05ae 0.91±0.09 1 0.91±0.10 0.62±0.08cg組別miR-129-5p mimics 組mimics-NC 組Control 組inhibitor-NC 組miR-129-5p inhibitor 組HMGB1 0.66±0.20be 0.94±0.03 1 1.02±0.10 1.26±0.06af Bcl2 0.52±0.19ad 0.96±0.05 1 1.04±0.14 1.45±0.12af

2.5 miR-129-5p 靶 向HMGB1 對(duì)SW1990 細(xì) 胞 凋亡的影響

Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，與mimics-NC組、Control 組 相 比，miR-129-5p mimics 組SW1990細(xì)胞數(shù)目明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞核破碎及染色質(zhì)聚集程度增加，呈現(xiàn)較強(qiáng)藍(lán)色熒光，見圖5A；與inhibitor-NC 組、Control 組相比，miR-129-5p inhibitor 組，SW1990 細(xì)胞數(shù)目明顯增加，凋亡細(xì)胞減少，細(xì)胞核飽滿，胞漿豐富，呈均勻的淡藍(lán)色熒光，見圖5E；mimics-NC 組、Control 組、inhibitor-NC 組細(xì)胞核飽滿，胞漿豐富，呈均勻的淡藍(lán)色熒光，組間熒光無明顯差異，見圖5B～D。

3 討論

PC 病死率高，是與癌癥相關(guān)的死亡的第七大病因［14］。PC 的高病死率與其早期診斷困難和高轉(zhuǎn)移率有關(guān)。近年來，PC 發(fā)病率不斷上升，雖然其5 年總生存率從20 世紀(jì)70 年代的3%上升到2020 年的9%，但在所有癌癥中，PC 患者預(yù)后最差［14］。我國國家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，PC 的發(fā)病率已經(jīng)上升至第9位，死亡率位列第6位［15］。PC 發(fā)病機(jī)制的研究，對(duì)提高疾病的早期診斷率，降低病死率具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 在PC 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［6］。

HMGB 蛋白家族成員長(zhǎng)度小于30 kDa，包括HMGB1、2、3、4。它們可以以結(jié)構(gòu)依賴的方式與DNA 結(jié) 合，而 不 受 特 定 序 列 的 影 響［16］。其 中，HMGB1 通路參與增殖、炎癥反應(yīng)、凋亡、腫瘤耐藥等多種生理過程［2，6，16-18］。HMGB1 是一個(gè)高度保守的核蛋白，屬于非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 在結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌或黑素瘤等大多數(shù)類型的腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為相關(guān)［19，20］。其中細(xì)胞凋亡與PC 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡是一種進(jìn)化保守的調(diào)控細(xì)胞死亡形式，通常涉及半胱氨酸-天冬氨酸 蛋白 酶 家 族caspases［14］。Caspases 家族 在 凋 亡過程中扮演著十分重要的角色，而Caspase 3 作為凋亡執(zhí)行蛋白在細(xì)胞凋亡過程中作用尤為突出。此外，Bcl-2 基因家族在PC 抑制細(xì)胞凋亡也中起著重要的作用［21］。研究表明HMGB1 在PC 組織中表達(dá)水平上調(diào)，且已被證實(shí)參與調(diào)控PC 細(xì)胞的增殖、凋亡［4］。抑制HMGB1 的表達(dá)可以促進(jìn)Caspase 3、Bax 的表達(dá)，抑制Bcl-2 的表達(dá)，從而促進(jìn)PC 細(xì)胞凋亡［22，23］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control 組、mimics-NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics 后，PC 細(xì)胞SW1990 的HMGB1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase 3 蛋白的表達(dá)水平顯著增高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞凋亡水平增加，這與前人的研究結(jié)果一致。

miRNA 與PC 的病理過程的關(guān)系，是近年來在國內(nèi)外研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。許多研究證明，miRNA對(duì)PC 的增殖、凋亡、自噬等許多分子生物學(xué)過程都存在調(diào)控作用［24，25］，但機(jī)制尚未闡明。miR-129-5p屬于microRNA 家族的一員，研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中miR-129-5p 均為低表達(dá)，過表達(dá)miR-129-5p 可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞侵襲、遷移和降低腫瘤細(xì)胞耐藥性［7-10］。在PC 中，已證實(shí)miR-129-5p 的表達(dá)下調(diào)并與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程相關(guān)［11，12，26-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control 組、mimics-NC組比較，過表達(dá)miR-129-5p 后，Caspase 3 蛋白表達(dá)水平顯著增高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞凋亡增加，與Control 組、inhibitor-NC 組比較，抑制miR-129-5p 后，Caspase 3 蛋白表達(dá)水平顯著下降，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯增高，細(xì)胞凋亡減少，這與前人的研究相一致。

目前PC 細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p、HMGB1 均參與了PC 細(xì)胞凋亡［4，11］，但兩者 關(guān) 系 尚 不明確。有研究報(bào) 道，miR-129-5p 可以靶向結(jié)合HMGB1，下調(diào)HMGB1 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的凋亡、抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖［22，29］。本 文通 過 生 物信 息 學(xué) 發(fā) 現(xiàn)miR-129-5p 和HMGB1 存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 可以靶向調(diào)控HMGB1 的表達(dá)。

為明確miR-129-5p 能否通過HMGB1 調(diào)控細(xì)胞凋亡，本研究通過miR-129-5p mimics、miR-129-5p inhibitor 分別上調(diào)和下調(diào)miR-129-5p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-129-5p 表達(dá)后，HMGB1 及Bcl-2 蛋白表達(dá)減少，Caspase 3 蛋白表達(dá)增加，Hoechst 染色顯示凋亡細(xì)胞數(shù)增加，呈現(xiàn)較強(qiáng)藍(lán)色熒光；下調(diào)miR-129-5p 表 達(dá) 后，HMGB1 及Bcl-2 蛋 白 表達(dá)增加，Caspase 3 蛋白表達(dá)減少，Hoechst 染色顯示凋亡細(xì)胞減少，呈均勻的淡藍(lán)色熒光。結(jié)果提示miR-129-5p 可以靶向HMGB1 調(diào)控凋亡相關(guān)基因Caspase 3 和Bcl-2 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-129-5p 通過抑制HMGB1 的表達(dá)促進(jìn)PC 細(xì)胞凋亡，而下調(diào)miR-129-5p 表達(dá)促進(jìn)HMGB1 的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)SW1990 細(xì)胞的凋亡起到抑制作用。因此，miR-129-5p 可能是PC 細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，為探索miR-129-5p 的抗腫瘤作用機(jī)制提供了新思路。