楊雅量，葛星月，李文武，竺仕林，姚明哲，唐乾利

（右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000）

隨著社會(huì)發(fā)展和生活水平的提高，糖尿病已成為全球十大死亡原因之一，而糖尿病潰瘍是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，大約四分之一的糖尿病患 者 會(huì) 發(fā) 生 難 愈 合 的 糖 尿 病 潰 瘍［1，2］，2022 年研究報(bào)道，全球糖尿病潰瘍患者5 年生存率僅為50.9%，10 年生存率僅為23.1%［3］，目前國(guó)際上的治療措施主要是在控制血糖基礎(chǔ)上通過(guò)傷口換藥、清創(chuàng)治療、傷口敷料、高壓氧等方法但療效不佳，許多糖尿病潰瘍患者最終被迫截肢治療［4］，可見(jiàn)糖尿病潰瘍?nèi)匀皇侵委熧M(fèi)用昂貴、周期長(zhǎng)、高截肢風(fēng)險(xiǎn)的臨床棘手問(wèn)題［5］，因此，迫切需要有效的治療藥物來(lái)恢復(fù)潰瘍正常愈合過(guò)程。

近年來(lái)，諸多研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍、燒傷等難愈性創(chuàng)面時(shí)，能顯著縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間、改善創(chuàng)面形態(tài)學(xué)的改變，減少瘢痕的形成，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量［6-8］，但其作用機(jī)制仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)新興學(xué)科，通過(guò)“疾病-基因-蛋白質(zhì)-藥物”的相互作用，可以系統(tǒng)、全面地觀察藥物對(duì)疾病的作用，從而揭示中醫(yī)藥與疾病之間的復(fù)雜關(guān)系［9］。這種研究方法具有整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)的整體理論相一致，是目前中藥復(fù)方藥理作用機(jī)制研究的主要方法之一［10］。分子對(duì)接是一種基于受體與藥物分子間相互作用的藥物研究方法，可以預(yù)測(cè)分子相互作用的結(jié)合模式和親和力大小，已成為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)［11］。本研究聯(lián)合利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探索濕潤(rùn)燒傷膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的作用機(jī)制，以期為濕潤(rùn)燒傷膏的開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

本研究所應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件具體信息見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件Tab 1 Database and Software

1.2 濕潤(rùn)燒傷膏活性成分及作用靶點(diǎn)獲取及篩選

濕潤(rùn)燒傷膏由黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏、地龍等五種藥材組成，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索黃連、罌粟殼、黃芩、黃柏的活性成分及作用靶點(diǎn)信息，以藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME）［12］為依據(jù)篩選，由于濕潤(rùn)燒傷膏為外用藥物，參照同類(lèi)研究文獻(xiàn)［13，14］，不將口服利用度（OB）列為篩選條件，依據(jù)類(lèi)藥性（DL）≥0.18 進(jìn)行篩選；數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)地龍成分和靶點(diǎn)記錄，通過(guò)查閱與地龍研究相關(guān)的文獻(xiàn)［15-19］匯總地龍活性成分和靶點(diǎn)信息，最后使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將查詢(xún)所得靶點(diǎn)名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化成geneSymbol。

1.3 糖尿病潰瘍靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb五大疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，以“diabetic ulcer”為關(guān)鍵詞搜索疾病靶點(diǎn)，經(jīng)合并去重后得到糖尿病潰瘍疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)的篩選

將1.2 中篩選得到的藥物活性成分靶點(diǎn)與1.3中篩選得到的疾病靶點(diǎn)輸入生物信息學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行匹配映射，并繪制韋恩圖，取其交集，獲得濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)輸入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建治療靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），設(shè)置蛋白種類(lèi)為人類(lèi)，最低相互作用閾值為中等，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，將結(jié)果保存為T(mén)SV 格式，應(yīng)用R語(yǔ)言軟件繪制靶點(diǎn)互作頻次柱狀圖。

1.6 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“濕潤(rùn)燒傷膏-靶點(diǎn)-糖尿病潰瘍”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，利用cyto-NCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)做拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析，并根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選核心成分以及靶點(diǎn)。

1.7 GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析

應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件對(duì)所獲濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，結(jié)果以柱狀圖和氣泡圖輸出。

1.8 關(guān)鍵化合物和核心蛋白分子對(duì)接

從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)將PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前4 的活性成分的3D 結(jié)構(gòu)下載下來(lái)，在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到靶點(diǎn)蛋白的PDBID，保存為pdb 格式，使用PyMOL 軟件對(duì)pdb 文件進(jìn)行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白分子去水、加氫、分離配體與受體等操作，最后應(yīng)用Autodock vina 進(jìn)行對(duì)接，通過(guò)結(jié)合能大小評(píng)價(jià)對(duì)接活性，并通過(guò)PyMOL可視化對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 濕潤(rùn)燒傷膏活性成分、靶點(diǎn)獲取及篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)及所設(shè)定的條件篩選共獲得濕潤(rùn)燒傷膏活性成分195 個(gè)，其中黃柏70 個(gè)，黃連31 個(gè)，黃芩72 個(gè)，罌粟殼18 個(gè)，地龍4 個(gè)；再將活性成分輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化名稱(chēng)，刪除重復(fù)項(xiàng)和UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)找不到名稱(chēng)的活性成分，最終獲得37 個(gè)潛在活性成分，選取12 個(gè)潛在活性成分展示見(jiàn)表2。再提取“RelatedTargets”模塊獲得100個(gè)濕潤(rùn)燒傷膏活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

表2 濕潤(rùn)燒傷膏潛在活性成分基本信息Tab 2 Information of potential active ingredients of moist exposed burn ointment

2.2 糖尿病潰瘍靶點(diǎn)篩選

通 過(guò) DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb 五大數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“diabetic ulcer”，分別獲得12、5 383、163、20、8 個(gè)疾病靶點(diǎn)，共5 586個(gè)疾病靶點(diǎn)，去重后剩余5 527 個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)篩選

將100 個(gè)濕潤(rùn)燒傷膏靶點(diǎn)與5 527 個(gè)糖尿病潰瘍的靶點(diǎn)輸入生物信息學(xué)和進(jìn)化基因組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行匹配映射，并繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1，兩者取其交集，獲得濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍潛在靶點(diǎn)77 個(gè)。

圖1 藥物與糖尿病潰瘍交集靶點(diǎn)Venn 圖Fig 1 Venn diagram of drug-DU intersected targets

2.4 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，共形成節(jié)點(diǎn)77 個(gè)，邊數(shù)424 條，見(jiàn)圖2。應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件繪制靶點(diǎn)互作頻次柱狀圖，見(jiàn)圖3，將STRING 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，借助cytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治霁@得核心富集靶點(diǎn)：主要涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、TP53 基 因（tumor protein p53， TP53）、髓細(xì)胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene， MYC）、熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）90AA1，表明這些靶點(diǎn)可能是濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4（節(jié)點(diǎn)顏色深度、節(jié)點(diǎn)大小與度值大小成正比）。

圖2 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 2 PPI network of potential targets of MEBO in treatment of DU

圖3 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)互作頻次圖Fig 3 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

圖4 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 4 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

2.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

在Cytoscape3.8.2 軟件中輸入濕潤(rùn)燒傷膏活性成分名稱(chēng)和濕潤(rùn)燒傷膏潛在治療糖尿病潰瘍靶點(diǎn)名稱(chēng)，繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5；結(jié)果顯示，濕潤(rùn)燒傷膏中的刺槐素（acacetin、MOL001689）、漢黃芩素（wogonin、MOL000173）、槲皮素（quercetin、MOL000098），吳茱萸次堿（rutaecarpine、MOL002662）這幾種活性成分可能在糖尿病潰瘍的治療上發(fā)揮主要作用。

2.6 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析

應(yīng)用R 語(yǔ)言軟件對(duì)治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG富集分析。其中生物過(guò)程（biological process， BP）339 條、分子功能（molecular function， MF）54 條及細(xì)胞成分（cell component， CC）73 條，BP 主要包括離子轉(zhuǎn)運(yùn)、管徑調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管生成等生物學(xué)過(guò)程；MF 主要包括G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等功能；CC主要包括細(xì)胞周期蛋白、蛋白激酶復(fù)合物、突觸后膜內(nèi)在成分等，選取排名前24 位作柱狀圖（圖6）；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)主要富集于丙型肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K）-蛋 白 激 酶B（protein kinase B， PKB/Akt）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of Advanced Glycation Endproducts， RAGE）等信號(hào)通路中，選取排名前30 位作氣泡圖（圖7），綜上顯示濕潤(rùn)燒傷膏可能通過(guò)調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過(guò)程、多條信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合。

圖7 濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍交集靶點(diǎn)KEGG 富集通路氣泡圖Fig 7 KEGG enrichment bubble diagram of intersection target of MEBO in the treatment of DU

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索核心靶點(diǎn)并下載其3D 結(jié)構(gòu)；通過(guò)Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載濕潤(rùn)燒傷膏活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，具體信息見(jiàn)表3。利用AutoDock Vina 和PyMOL 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，一般認(rèn)為最低結(jié)合能低于-5.0 kJ/mol 則說(shuō)明兩者結(jié)合活性良好［20］。本研究發(fā)現(xiàn)4 個(gè)活性成分與3 個(gè)靶點(diǎn)蛋白對(duì)接最低結(jié)合能均低于-5.0 kJ/mol，具體得分見(jiàn)圖8；并且分子對(duì)接示意圖（圖9）顯示：各靶點(diǎn)與各活性成分是通過(guò)氫鍵能分子間作用力相結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明活性成分與靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合能力，吳茱萸次堿與TNF 結(jié)合能最低，其可能是濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍最有效的活性成分。

圖8 分子對(duì)接最低結(jié)合能熱圖Fig 8 Heat map of molecular docking minimum binding energy

圖9 部分活性化合物與核心靶蛋白分子對(duì)接結(jié)果Fig 9 Molecular docking diagram of some active compounds with core target proteins

表3 靶點(diǎn)蛋白與活性成分信息Tab 3 Information of target protein and active ingredient

3 討論

糖尿病潰瘍歸屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“脫疽”范疇?！鹅`樞·癰疽》曰：“發(fā)于足趾，名脫癰，其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斬之，不則死矣［21］?！贝瞬∮蓙?lái)已久，目前仍很難找到有效的治療手段。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療糖尿病潰瘍方面體現(xiàn)出經(jīng)濟(jì)有效的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，典型代表藥物濕潤(rùn)燒傷膏能明顯改變糖尿病潰瘍的病理炎癥反應(yīng)狀態(tài)，促進(jìn)血管新生，加快肉芽組織和上皮細(xì)胞的生成，明顯縮短愈合時(shí)間［22-26］，但其作用機(jī)制仍不明確。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的作用機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型，分析發(fā)現(xiàn)濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的核心活性成分可能為刺槐素、漢黃芩素、槲皮素、吳茱萸次堿。研究表明刺槐素具有抗炎作用，可通過(guò)減少組織中的TNF-α 和IL-1β 的釋放，抑制活性氧的產(chǎn)生，減輕組織水腫，加快組織修復(fù)［27］。而漢黃芩素可通過(guò)IL-6/STAT3、PI3K/Akt通路發(fā)揮抗炎作用［28］，亦可通過(guò)減少胞內(nèi)活性氧水平，降低胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子κB 活性，進(jìn)而減弱巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［29］。槲皮素可增加白介素10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2 表型極化來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，從而加速糖尿病潰瘍的愈合［30，31］。吳茱萸次堿具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，吳茱萸次堿通過(guò)減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的黏附，進(jìn)而改善縫隙連接細(xì)胞間通訊，保護(hù)血管內(nèi)皮［32］，促進(jìn)組織修復(fù)。

通過(guò)Cytoscape3.8.2 軟件中cytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治龊蚏 語(yǔ)言KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，交集基 因 主 要 涉 及 TNF、TP53、HSP90AA1 和PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號(hào)通路，提示濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍可能通過(guò)調(diào)控這些關(guān)鍵基因及信號(hào)通路發(fā)揮作用。TNF 是一種促炎因子，刺激單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-1β 和IL-6 等炎癥因子，此外TNF 可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性，導(dǎo)致NO 誘導(dǎo)的血管舒張減少，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，影響愈合過(guò)程［33］，已有研究證實(shí)濕潤(rùn)燒傷膏能夠通過(guò)降低IL-6、TNF-α 等因子表達(dá)，從 而 改 善 創(chuàng) 面 炎 癥 反 應(yīng)，促 進(jìn) 愈 合［34，35］。PI3K-Akt 信號(hào)通路可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，研究證實(shí)濕潤(rùn)燒傷膏可通過(guò)激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞自噬水平，抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖，從而加快大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合， 以上既往研究結(jié)果與本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)一致，表明TNF 和PI3K-Akt 信號(hào)通路是濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的主要作用靶點(diǎn)［36，37］。目前已知TP53 能抑制糖酵解并參與氧化應(yīng)激，TP53 基因多態(tài)性標(biāo)志物Pro72Arg 與多種糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)［38］，T2DM 患者的血清TP53 水平顯著升高［39］，結(jié)合本次分析結(jié)果推測(cè)TP53 可能在糖尿病等代謝性疾病中發(fā)揮重要作用。AGE-RAGE 信號(hào)通路則是糖尿病潰瘍愈合過(guò)程的重要通路，在高血糖狀態(tài)下，組織基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)蓄積大量晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs），AGE 與其配體RAGE 結(jié)合后產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織持續(xù)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，延遲潰瘍愈合［40，41］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在AGE 修飾的牛血清白蛋白存在的情況下，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)失去其增殖和遷移能力［42］，并且在傷口中發(fā)現(xiàn)AGE 及其配體RAGE 的表達(dá)水平增加及AGE-RAGE 結(jié)合會(huì)抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖［43］，表明AGE-RAGE 信號(hào)通路與糖尿病潰瘍愈合密切相關(guān)，另外分子對(duì)接結(jié)果也顯示：槲皮素、吳茱萸次堿等活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、TP53、HSP90AA1 的結(jié)合活性良好，表明濕潤(rùn)燒傷膏可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程在糖尿病潰瘍中發(fā)揮治療作用。

綜上所述，濕潤(rùn)燒傷膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路進(jìn)行作用的復(fù)雜過(guò)程，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接初步闡明了其治療過(guò)程可能涉及TNF、TP53、HSP90AA1 等核心靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信號(hào)通路發(fā)揮促愈合作用，為濕潤(rùn)燒傷膏治療糖尿病潰瘍的進(jìn)一步研究提供了思路，但其作用機(jī)制和療效還需在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

楊雅量：文章的構(gòu)思、論文的撰寫(xiě)；竺仕林：數(shù)據(jù)收集；姚明哲：數(shù)據(jù)整理；葛星月、李文武：論文的可行性分析、修訂；唐乾利：文章的質(zhì)量控制與審查，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。