林雪萍 陳智鴻 滕 杰

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院腎內(nèi)科，福建廈門 361015

IgA 腎病是全球最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一[1]。50%的患者在診斷后25 年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。目前仍缺乏特異性和有效的治療策略。腎炎康復(fù)片已成為治療IgA 腎病的常見中藥制劑，具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎健脾、清解余毒等功效[3]，但腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的機(jī)制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)，通過分子對(duì)接分析驗(yàn)證，為腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腎炎康復(fù)片活性成分獲取及其基因靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索中藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（https://bidd.group/TCMID/index.html），以同時(shí)滿足口服吸收率≥30%和類藥性≥0.18 為條件對(duì)腎炎康復(fù)片的活性成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息進(jìn)行檢索，進(jìn)一步使用Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）擴(kuò)大檢索，篩選Probability ≥0.2 的靶基因。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范統(tǒng)一基因靶點(diǎn)名稱格式。

1.2 IgA腎病靶基因獲取

以“IgA nephropathy”為檢索關(guān)鍵詞，通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索IgA 腎病相關(guān)人類基因，GeneCards 和Disgenet篩選條件分別設(shè)置為Relevancescored ≥1.0、Score ≥0.1，將以上3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因合并匯總并去除重復(fù)基因。

1.3 獲取藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因

應(yīng)用Venny 2.1.0 線上作圖平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)腎炎康復(fù)片活性成分靶點(diǎn)基因與IgA 腎病相關(guān)人類基因進(jìn)行交集，篩選出共同靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將1.3 獲得的藥物疾病共同基因?qū)隨TRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，條件物種設(shè)置為“homosapiens”，相互作用閾值設(shè)置為最高置信度（highestconfidence）0.9，使用CytoScape 3.9.1 軟件作靶點(diǎn)間網(wǎng)絡(luò)分析，進(jìn)行可視化處理。

1.5 構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

使用CytoScape 3.9.1 軟件對(duì)腎炎康復(fù)片-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)作可視化展示，選取自由度（Degree）排名前十的藥物成分為主要活性成分。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape（https://metascape.org/）網(wǎng)絡(luò)在線平臺(tái)，條件物種設(shè)置為“homosapiens”，獲得生物學(xué)過程（biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組成（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）及KEGG 富集數(shù)據(jù)，剔除無關(guān)信號(hào)通路，利用bioinformatics 在線平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）作可視化展示。

1.7 構(gòu)建“主要活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

使用CytoScape 3.9.1 軟件構(gòu)建主要活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，分別選取Degree 值排名前五的藥物成分和基因靶點(diǎn)，推測(cè)為腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)。

1.8 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

分別從PuChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載有效成分化合物結(jié)構(gòu)和核靶點(diǎn)的蛋白分子結(jié)構(gòu)，使用Pymol 軟件去除水分子和小分子配體。經(jīng)MGLTools-1.5.7 添加極性氫和電荷后作為受體，以有效成分化合物作為配體，運(yùn)用AutoDock Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行對(duì)接，選取結(jié)合能較小的構(gòu)象為最優(yōu)構(gòu)象，使用Pymol 作可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 腎炎康復(fù)片和IgA腎病主要靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過檢索腎炎康復(fù)片化學(xué)成分，去除重復(fù)值，共有182 個(gè)活性成分，對(duì)其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中17 個(gè)活性成分缺失的靶點(diǎn)信息使用Swiss Target Prediction 擴(kuò)大檢索，去除重復(fù)值后，得到310 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)合并去除重復(fù)項(xiàng)后最終得到與IgA 腎病并聯(lián)最強(qiáng)的1190 個(gè)靶點(diǎn)基因。繪制韋恩圖，獲得共有靶點(diǎn)119 個(gè)（圖1）。

圖1 腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)和藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將119 個(gè)交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的數(shù)據(jù)運(yùn)用CytoScape 繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）和“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），藥物及活性成分用縮寫作為標(biāo)注，共有活性成分用字母A ～G 作為標(biāo)注，篩選出Degree 值排名前十的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、丹參酮IIA、柚皮素、花生四烯酸、金合歡素、異鼠李素（表1)。

表1 腎炎康復(fù)片中Degree值排名前10的主要活性成分

圖2 腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 腎炎康復(fù)片與IgA 腎病藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO功能分析和KEEG信號(hào)通路富集

將119 個(gè)基因進(jìn)行BP、CC 和MF 富集，BP 排名前三的條目為細(xì)胞遷移正性調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)，CC 排名前三的條目為膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔，MF 排名前三的條目為細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（圖4）。KEEG 信號(hào)通路富集結(jié)果顯示腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/Akt）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路排名靠前（圖5）。

圖4 腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的潛在作用靶點(diǎn)的GO 分析

2.4 主要活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

結(jié)合KEEG 信號(hào)通路富集結(jié)果，選取2.2 中10種主要活性成分，運(yùn)用CytoScape 繪制主要活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)（圖6）。Degree 值排名前五的主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇，Degree 值排名前五的靶點(diǎn)基因?yàn)锽 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2 gene，BCL2）、前列腺素過氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTSG2）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、胱天蛋白酶3（caspase3，CASP3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT1），推測(cè)為腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

選取Degree 值排名前五的主要成分化合物和核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接（表2）。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能大部分都＜-5 kcal/mol，與核心靶點(diǎn)具有較高結(jié)合能力。其中豆甾醇與BCL2 和MAPK1、β-谷甾醇與MAPK1和CASP3 結(jié)合最優(yōu)（結(jié)合能均＜-7 kcal/mol），對(duì)上述4 對(duì)分子對(duì)接構(gòu)象作可視化展示（圖7）。

表2 關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能以及氫鍵個(gè)數(shù)

圖7 腎炎康復(fù)片關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)分子對(duì)接構(gòu)象圖示意圖

3 討論

中醫(yī)將IgA 腎病歸于“腎風(fēng)、尿血、尿濁、水腫、腰痛、虛勞”等范疇[4]。腎炎康復(fù)片的中藥配伍遵循“益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎健脾、清解余毒”[5]，是治療IgA 腎病的中醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病機(jī)制。

分析獲得腎炎康復(fù)片與IgA 腎病高度相關(guān)的119 個(gè)交集靶點(diǎn)。通過PPI 功能網(wǎng)，篩選出排名前十的主要活性成分。同時(shí)GO 和KEGG 富集顯示腎炎康復(fù)片可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療IgA 腎病。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等是腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的主要活性成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎等作用[6]，可抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）等促炎因子的表達(dá)，調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路改善腎臟炎癥損傷及腎間質(zhì)纖維化[7]。β-谷甾醇具有抗氧化作用[8]。木犀草素可抑制腎小球基底膜增生[9]。山柰酚可減輕內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[10]。豆甾醇可發(fā)揮抗炎作用[11]。KEGG 富集結(jié)果顯示涉及TNF、PI3K/Akt、IL-17、MAPK、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路。結(jié)合KEFG 信號(hào)通路富集結(jié)果及腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的主要活性成分進(jìn)一步拓?fù)浞治龅玫疥P(guān)鍵靶基因?yàn)锽CL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，推測(cè)為腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的核心靶點(diǎn)。BCL2 是可抑制細(xì)胞凋亡[12]。PTSG2 可被TNF-α、IL-1β 誘導(dǎo)引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。MAPK 是促進(jìn)纖維化的重要信號(hào)通路[14]。CASP3 編碼的Caspase-3 在急性腎損傷中發(fā)揮重要作用[15]。AKT1 通過調(diào)控細(xì)胞凋亡及自噬，參與IgA 腎病的調(diào)控[16]。將關(guān)鍵靶基因與腎炎康復(fù)片治療IgA 腎病的藥物活性成分進(jìn)行分子對(duì)接均具有良好的結(jié)合能力。

綜上所述，腎炎康復(fù)片可能通過槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等多種成分，作用于BCL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，調(diào)控TNF、 PI3K-Akt、IL-17、細(xì)胞衰老和MAPK 等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬等途徑，延緩IgA 腎病進(jìn)展。