范洪臣，茜琳，韓雪，唐慧，丁鈳凡

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱美華生物技術股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150076）

黏豆包是經過自然發(fā)酵而成的東北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，又稱黃豆包或豆包，由大黃米或江米與糯玉米按一定比例混合經自然發(fā)酵后，包裹紅豆餡蒸制而成的面制食品[1]。黏豆包發(fā)酵的主要菌為乳酸菌，部分乳酸菌因其具有益生功能近年來成為研究熱點。研究表明，乳酸菌存在于人體腸道，能維持腸道微生態(tài)平衡；因其代謝功能優(yōu)異，可起到降低血脂、膽固醇和降血壓的功效[2-3]。傳統(tǒng)黏豆包生產多以手工作坊為主，在其發(fā)酵過程中，來自原料自身或者外界的微生物發(fā)酵過程易受雜菌污染，從而影響傳統(tǒng)發(fā)酵食品的感官品質、風味和食用安全性，因此研究黏豆包發(fā)酵液中的核心菌株分離及其益生特性，可為黏豆包的營養(yǎng)功能研究提供理論支撐[4-5]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵食品一般不添加外源發(fā)酵劑，在當?shù)亟涀匀话l(fā)酵而成。近年來，為了提高發(fā)酵食品的品質和功能性，一些具有益生菌或益生元特性的發(fā)酵劑開始添加在發(fā)酵生產中，能起到改變人體腸道菌群、代謝增加機體免疫、消化吸收和抗氧化等益生特性。王祎然等[6]從貴州酸湯中分離出的6 株菌均具有良好的耐酸和耐膽鹽能力，可作為潛在的益生菌進行深入研究。鄭越等[7]對比6 株植物乳桿菌發(fā)現(xiàn)，其在耐強酸和耐膽鹽、模擬胃腸道耐受能力和抑菌能力的試驗中，均具有潛在益生特性。葉望娟等[8]研究乳源乳桿菌的益生特性發(fā)現(xiàn)，5 株乳桿菌對耐酸、耐膽鹽等有一定的耐受性以及對致病菌的抑制能力。目前對乳制品、肉制品、傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品源的乳酸菌進行益生性試驗的研究較多，而對谷物源乳酸菌進行的研究還較少。

本文對谷物自然發(fā)酵液中的乳酸菌進行傳統(tǒng)方法結合16S rRNA 分子鑒定，對篩選出的乳酸菌在耐酸、耐膽鹽、產酸、模擬人工胃腸液中的存活率、抗生素耐藥敏感性等方面進行試驗分析，以期為益生菌資源的研究和谷物源乳酸菌的開發(fā)利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黏豆包發(fā)酵液：黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)亞溝鎮(zhèn)農戶家庭谷物自然發(fā)酵液。

MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；次甲基酚綠：天津市光復精細化工研究所；豬膽鹽：北京鴻潤寶順科技有限公司；藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g）、胃蛋白酶（≥1 200 U/g）：生工生物工程（上海）股份有限公司；VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒：San Diego 公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-70A）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電子天平（BSA223S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫振蕩器（THZ-98AB）、生化培養(yǎng)箱（LRH-250）：上海一恒科學儀器有限公司；超級潔凈工作臺（DL-CJ-1ND1L）、低溫離心機（5970A）：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-IIA）：天津市泰斯特儀器有限公司；漩渦振蕩儀（Vortex-2）：長沙米淇儀器設備有限公司；紫外-可見分光光度計（759S）：上海元析儀器有限公司；pH 計（pH-20）：杭州杰源儀器科技有限公司；生物電泳圖像分析儀（JY04S-3C）、電泳系統(tǒng)（JY300C）：東莞霖輝電泳有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液中乳酸菌的分離純化

用無菌生理鹽水將黏豆包發(fā)酵液10 倍梯度稀釋，漩渦振蕩后取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋梯度0.1 mL 涂布在含有0.3%次甲基酚綠的MRS 培養(yǎng)基中，由低濃度到高濃度進行涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)48 h。待菌落長出后，挑取呈黃色或黃綠色的菌落，在含次甲基酚綠的MRS 培養(yǎng)基進行劃線，重復3～5 次直至得到純菌落。通過革蘭氏染色、鏡檢、過氧化氫酶試驗，選出無芽孢、過氧化氫酶陰性且革蘭氏染色陽性的菌株[9]。

1.3.2 乳酸菌鑒定

參考Si 等[10]的方法，經過革蘭氏染色為陽性和生理生化試驗的菌株進行DNA 提取，把提取的樣本DNA基因組作為擴增模板，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增時正反向引物分別為A27F和A1495R，正反向引物序列分別為5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA -3' 和5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。擴增后將產物用濃度為2%的電泳進行檢測，樣品質量合格后送檢，把測序得到的結果提交到美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進行BLAST 同源性分析并鑒定到種。

1.3.3 乳酸菌益生性能測定

1.3.3.1 乳酸菌耐酸性能的測定

參考Bartkiene 等[11]的方法，稍作修改，以鹽酸調節(jié)MRS 肉湯培養(yǎng)基初始pH 值至2.0、2.5 和3.0，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 h 后稀釋，對稀釋梯度為10-5、10-6和10-7的菌液進行活菌數(shù)計數(shù)，計算其存活率（W，%），公式如下。

式中：N1為酸處理后活菌數(shù)，CFU/mL；N0為酸處理前活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.3.2 乳酸菌耐鹽性能的測定

參考袁先鈴等[12]的方法，稍作修改，在MRS 肉湯培養(yǎng)基中分別以2%、4%、6%、8%和10%的濃度添加NaCl，以1%的接菌量接入乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定菌株活菌數(shù)，以MRS 肉湯液體培養(yǎng)基中不添加NaCl 作為空白對照。

1.3.3.3 乳酸菌耐膽鹽性能的測定

參照Damayanti 等[13]的方法，稍作修改，在100 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中添加0.3 g 的豬膽鹽，121 ℃滅菌15 min。將乳酸菌以1%的接菌量接入滅完菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后測定活菌數(shù)，將不添加豬膽鹽的培養(yǎng)基作為空白對照，參照1.3.3.1的公式計算其存活率。

1.3.3.4 乳酸菌的產酸能力

乳酸菌菌株活化3 次之后，按1%的接菌量接入MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，2 h 取1 次樣，利用pH 計測定pH 值。得到各個菌株在不同培養(yǎng)時間內產酸的pH 值[14]。

1.3.3.5 乳酸菌耐受模擬胃腸道環(huán)境試驗

參考崔美巖等[15]的方法，配制模擬人工胃液及腸液。取pH 值為3.0 的稀鹽酸，以0.01 g/mL 濃度加入胃蛋白酶，待混勻溶解之后，用0.22 μm 的微孔膜過濾除菌，完成人工胃液的配制。配制濃度為13.6 g/L 的KH2PO4溶液，加入0.01 g/mL 胰蛋白酶，待混勻溶解后，用0.22 μm 的微孔膜過濾除菌，完成人工腸液的配制。

乳酸菌人工胃液耐受性研究取活化過的乳酸菌菌株發(fā)酵液，4 500 r/min 條件下離心10 min 得到菌泥，磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2 次后重懸在模擬人工胃液中，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，在0 h 和3 h 時取模擬胃液，測定活菌數(shù)，參照1.3.3.1 的公式計算其存活率。

乳酸菌人工腸液耐受性研究取上述培養(yǎng)3 h 的模擬胃液，按2%的接種量接入人工腸液中，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，在0 h 和6 h 時取模擬腸液，測定活菌數(shù)，參照1.3.3.1 的公式計算其存活率。

1.3.3.6 乳酸菌抗生素敏感性研究

參考史梅莓等[16]的方法，采用藥敏紙片瓊脂擴散法測定乳酸菌對16 種抗生素的敏感性。將濃度為1×108CFU/mL 的乳酸菌發(fā)酵液吸取0.1 mL 涂布在MRS培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏紙片粘貼于涂布完菌液的平皿上，一個平皿中貼3 個相同的藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用電子游標卡尺測量表面抑菌圈直徑。測定結果以耐受（抑菌圈直徑≤15 mm），中等（抑菌圈直徑為15～21 mm）和敏感（抑菌圈直徑≥21 mm）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗均進行3 次重復，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics26 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，使用Origin 2019b 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與篩選

根據(jù)分離得到的菌株進行菌落形態(tài)及鏡檢菌落形狀等篩選出46 株乳酸菌疑似菌株，剔除形態(tài)較為相似的菌株，初步分離出22 株疑似乳酸菌。

2.2 乳酸菌的鑒定結果

對從谷物發(fā)酵液中分離出來的22 株菌進行PCR擴增，部分乳酸菌PCR 產物檢測結果如圖1所示。

圖1 部分乳酸菌PCR 產物檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of selected lactic acid bacteria

圖1 結果顯示，瓊脂糖凝膠電泳條帶明亮清晰，分子量皆在1 500 bp 左右，符合測序要求。

將初步分離出的22 株疑似乳酸菌，采用16S rRNA序列分析法和同源性分析后并鑒定到種，結果如表1所示。

表1 乳酸菌16S rRNA 序列同源性對比結果Table 1 Comparison of 16S rRNA homology of lactic acid bacteria

由表1 可知，22 株乳酸菌經過16S rRNA 測定后，有1 株菌同源性達100%，其余同源性達98%以上。這些菌分別為1 株棒狀乳桿菌（Lactobacilluscoryniformis）、1 株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、1 株短桿菌（Levilactobacillusbrevis）、1 株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentans）、1 株清酒乳桿菌（Latilactobacillussakei）和1 株曲氏乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）。陶東婭等[17]在對黑龍江地區(qū)4 個不同縣的黏豆包酸面團研究中發(fā)現(xiàn)了7 個不同的菌種，分別為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、羅伊氏乳桿菌（Lactococcusreuteri）、食竇魏斯氏菌（Weissellacibaria）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、短乳桿菌（Levilactobacillusbrevis）和融合魏斯氏菌（Weissellaconfusa），與本文結果比較有2 株相同菌株，也有不同菌株，可能原因是采樣地點的不同造成了菌株不同，也說明了黏豆包發(fā)酵菌的多樣性。

2.3 乳酸菌益生性評價

2.3.1 乳酸菌耐酸性能

微生物生長環(huán)境中pH 值會影響其生長代謝，且大部分人胃液pH 值在1.5～3.0，益生菌在人體腸道內存活并增殖，必須具備一定的耐酸能力[18]。將6 株乳酸菌進行初步篩選后進行耐酸能力的測定，結果如圖2所示。

圖2 乳酸菌耐酸能力測試Fig.2 Acid resistance of lactic acid bacteria

如圖2所示，6 株乳酸菌在酸性環(huán)境下仍具有存活率，說明其具有較強耐酸性。但不同菌株在酸性環(huán)境中存活率不同。如pH 值為2.0 時，菌株HSDF8 存活率最高，為21%；pH 值為2.5 時，菌株HSDF12 存活率最高，為43%；pH 值為3.0 時，由于酸性環(huán)境相對削弱，各菌株進入環(huán)境后能迅速適應，但各菌株耐酸性差異較大，其中菌株HSDF3 的存活率為100%，說明該菌對酸性環(huán)境具有抗逆性能和增殖生長。劉宏宇等[19]對5 株乳酸菌的耐酸性進行研究發(fā)現(xiàn)，在pH 值為3.0 時，菌株GL-2、FC-2 的存活率達100%，本文試驗結果與之相似。

2.3.2 乳酸菌耐鹽性能

乳酸菌耐鹽性能測試結果如表2所示。

表2 乳酸菌耐鹽能力測試Table 2 Salt tolerance of lactic acid bacteria

如表2所示，6 株乳酸菌的生長情況取決于NaCl在MRS 肉湯中的含量。隨著NaCl 含量的增加，各個菌株的活菌數(shù)有不同程度的下降。當MRS 肉湯中NaCl含量為2%時，各菌株的生長不容易受到抑制，其中菌株HSDF3 的活菌數(shù)變化最小，從1.37×109CFU/mL 下降到了1.30×109CFU/mL，當MRS 肉湯中NaCl 含量提高到8%和10%時，各菌株的活菌數(shù)變化很大，而菌株HSDF9 的耐鹽效果最好，在NaCl 含量10%的MRS 肉湯中仍可存活，活菌數(shù)可達8.93×106CFU/mL。林松洋等[20]也曾提到高濃度鹽在乳酸菌的發(fā)酵過程中因改變細胞外界滲透壓，使菌體細胞體積變小，從而使乳酸菌的胞內生理代謝活動紊亂或者死亡，本試驗與其結果相符合。

2.3.3 乳酸菌耐膽鹽性能

乳酸菌對人體胃腸道中膽鹽的耐受能力是測定其益生性能的重要指標[21]。乳酸菌耐膽鹽性能如表3所示。

表3 乳酸菌耐膽鹽能力測試Table 3 Bile salt tolerance of lactic acid bacteria

表3 結果顯示，菌株HSDF12 在0.3%膽鹽濃度的MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h 之后的存活率最高，為7.171%，說明該菌株耐膽鹽能力較強，有利于其在宿主腸道中的定植。6 株菌株中，HSDF4、HSDF8、HSDF15的耐膽鹽存活率最低，不到1%。

2.3.4 乳酸菌產酸能力

乳酸菌在人體腸道中可以通過產酸來降低腸道中的pH 值，起到抑制病原性細菌生長繁殖的作用。因此，乳酸菌的益生性能評價中，產酸能力也是重要指標之一[22]。乳酸菌產酸能力見圖3。

圖3 乳酸菌pH 值動態(tài)變化曲線Fig.3 Time courses of pH of lactic acid bacteria broth

如圖3所示，6 株乳酸菌從接種完到4 h 之間，pH值變化不明顯，說明菌株的生長緩慢，生理狀態(tài)延滯；4～12 h，菌液的pH 值變化明顯，菌株生長進入對數(shù)生長期，此期間細胞代謝活躍，生長速度加快，細胞繁殖力強；從第12 小時開始pH 值變化變慢，菌株生長開始穩(wěn)定。其中在發(fā)酵的第24 小時，隨著菌株的生長，有機酸含量變多，pH 值隨之降低，菌株HSDF3 的pH值從0 h 的6.60 降到了3.91，為產酸最多的菌株。

2.3.5 乳酸菌耐受模擬胃腸道測定

對胃腸液有一定耐受能力的乳酸菌，能夠在胃腸道存活，具有發(fā)揮益生功能的潛力[15]。乳酸菌耐受模擬人體胃腸液耐受性結果如圖4、圖5所示。

圖4 模擬人體胃液中的乳酸菌生長情況Fig.4 Growth of lactic acid bacteria in simulated human gastric fluid

圖5 模擬人體腸液中的乳酸菌生長情況Fig.5 Growth of lactic acid bacteria in simulated human intestinal fluid

如圖4所示，在模擬胃液中，經過3 h 的胃液培養(yǎng)之后除了菌株HSDF3 的活菌數(shù)變化較小，其余5 株菌株的變化很明顯，其中菌株HSDF9 的活菌數(shù)下降最多，從最初的4.28×109CFU/mL 下降到了8.7×108CFU/mL，菌株HSDF3 的存活率最高，達到82.91%，其次為菌株HSDF12，達到53.2%，其余4 株菌株表現(xiàn)出不耐受胃液環(huán)境，存活率不到50%。Argyri 等[23]通過對來源于橄欖發(fā)酵食物的乳酸菌在耐模擬胃液試驗中發(fā)現(xiàn)，不同的乳酸菌對酸的耐受性也不同，本文試驗結果與之相似。

模擬人體腸液中乳酸菌的生長情況見圖5。

如圖5所示，經過6 h 的模擬腸液培養(yǎng)之后，6 株菌株的活菌數(shù)量都有明顯的變化趨勢，其中菌株HSDF4 的活菌數(shù)降低最多，從最初的1.46×106CFU/mL減小到0.4×106CFU/mL，6 株菌株中HSDF12 表現(xiàn)出很強的腸液耐受性，存活率最高，達到93.42%，其次為菌株HSDF8、HSDF9，存活率達到75.75%、73.72%。其余3 株表現(xiàn)出不耐受腸液環(huán)境，存活率不到50%。6 株菌株有一定的存活率，說明乳酸菌菌株對腸液有一定的耐受能力，有發(fā)揮益生功能的潛力。

2.3.6 乳酸菌耐藥抗生素結果

益生菌因具有轉移抗生素抗性基因至致病菌中的潛在可能性，抗生素敏感試驗作為益生菌安全性評價的重要指標加以考慮[24]。對6 株菌株進行耐藥性試驗，試驗選用16 種抗生素藥敏紙片，參照臨床與實驗室標準協(xié)會修訂的標準，來測量抑菌圈直徑并進行測定[25]，結果見表4、圖6。

表4 乳酸菌耐藥性試驗Table 4 Drug resistance of lactic acid bacteria

通過表4 和圖6 可以看出，菌株HSDF4 對CA（羧芐西林）敏感，對4 種抗生素表現(xiàn)中度耐藥性，對11 種抗生素表現(xiàn)耐藥。菌株HSDF8 對PG（青霉素）、CA（羧芐西林）敏感，對5 種抗生素表現(xiàn)中度耐藥性，對9 種抗生素表現(xiàn)耐藥。菌株HSDF3 對PI（哌拉西林）、CZ（頭孢唑啉）敏感，對7 種抗生素有中度藥敏性，對7 種抗生素表現(xiàn)耐藥。菌株HSDF9 對MI（米諾環(huán)素）表現(xiàn)敏感，對4 種抗生素表現(xiàn)中度藥敏性，對11 種抗生素表現(xiàn)耐受。菌株HSDF15 對8 種抗生素敏感，分別為AK（丁胺卡那）、TE（四環(huán)素）、CA（羧芐西林）、CE（頭孢氨芐）、MI（米諾環(huán)素）、CZ（頭孢唑啉）、AM（氨芐西林）、RA（頭孢拉定），對5 種抗生素表現(xiàn)中度耐藥性，對3 種抗生素表現(xiàn)耐藥。菌株HSDF12 對CA（羧芐西林）、CX（頭孢呋辛）、CF（頭孢哌酮）表示敏感，對2 種抗生素表示中度藥敏性，對11 種抗生素表示耐受。乳酸菌產生的氨基糖苷類鈍化酶能使氨基糖苷類抗生素滅活，所以6 株菌株都對GM（慶大霉素）表示耐藥性[26]。綜上所述，6 株菌株對12 種抗生素具有敏感性。

3 結論

從黑龍江省哈爾濱市阿城地區(qū)農家自然發(fā)酵黏豆包發(fā)酵液中共分離篩選出22 株性能優(yōu)良的乳酸菌，經形態(tài)學分析并結合16S rRNA 分子鑒定為6 株，分別為1 株棒狀乳桿菌（Lactobacilluscoryniformis）、1 株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、1 株短桿菌（Levi-lactobacillusbrevis）、1 株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentans）、1 株清酒乳桿菌（Latilactobacillussakei）和1 株曲氏乳桿菌（Lactobacilluscurvatus），并對其進行益生性能評價試驗。結果表明：不同菌株在酸性環(huán)境中存活率不同，如pH2.0 時，菌株HSDF8 存活率最高，為21%；pH2.5 時，菌株HSDF12 存活率最高，為43%；pH3.0 時，菌株HSDF3 的存活率為100%。隨著鹽含量的增加，各個菌株的活菌數(shù)以不同程度明顯下降。當MRS 肉湯中鹽含量為2%時，各菌株的生長能力影響不大，當MRS 肉湯中鹽含量提高到8%和10%時，乳酸菌的生長明顯受到干擾，而菌株HSDF9 的耐鹽效果最好，在鹽含量10%的MRS 肉湯中仍可存活，活菌數(shù)可達8.93×106CFU/mL。通過耐膽鹽試驗得知，菌株HSDF12 在0.3%膽鹽濃度的MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h 之后的存活率最高，為7.171%。HSDF4、HSDF8、HSDF15 的耐膽鹽存活率最低，不到1%。經過3 h 的模擬胃液培養(yǎng)之后，菌株HSDF3 的存活率最高，達到82.91%，其次為菌株HSDF12，達到53.2%，其余4 株菌株表現(xiàn)出不耐受胃液環(huán)境，存活率不到50%。經過6 h的模擬腸液培養(yǎng)之后，6 株菌株中HSDF12 表現(xiàn)出很強的腸液耐受性，存活率最高，達到93.42%，有3 株表現(xiàn)出不耐受腸液環(huán)境，存活率不到50%。由此可知，HSDF12 在模擬胃腸液中的存活率為最佳?？股厮幟粼囼炛?，6 株菌株對常見的羧芐西林、青霉素、頭孢唑啉、頭孢氨芐、頭孢拉定等12 種抗生素均敏感，對人體健康不存在影響。本研究所篩選的谷物源乳酸菌菌株為其進一步應用于開發(fā)新型健康食品奠定了基礎。