陳艷,蔣星月,楊瓊,羅莎杰,謝曉芳,彭成*

1(成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,四川 成都,611137)2(西南地區(qū)特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都,611137) 3(成都中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,四川 成都,611137)

迷迭香酸(rosmarinic acid, RA),又稱酪薩維、肉桂醇甙、羅丹酚酸, 廣泛存在于唇形科、紫草科、傘形科等天然植物中。RA是咖啡酸和3,4-二羥基苯基乳酸縮合而成的多酚羥基化合物[1](分子結(jié)構(gòu)見圖1),2個(gè)芳香環(huán)上分別有2個(gè)羥基,使得其具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力[2],RA的抗氧化能力強(qiáng)于維生素E被普遍認(rèn)可。RA提取方式包括索氏提取、熱回流、浸漬、酶解法、超臨界流體萃取、超聲波/微波輔助提取等技術(shù)。工業(yè)化生產(chǎn)方式有植物愈傷組織培養(yǎng)、微生物發(fā)酵等。RA具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗神經(jīng)毒性、抗病毒、抗過敏、抗菌等多種生物活性,在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

圖1 迷迭香酸的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular formula of rosmarinic acid

綜合近幾年研究,本文對RA的來源、生產(chǎn)進(jìn)行了回顧,重點(diǎn)關(guān)注了愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)和微生物發(fā)酵生產(chǎn)等新型的生產(chǎn)途徑。并以抗氧化、抗癌、抗代謝性疾病和神經(jīng)保護(hù)為核心闡述了RA的生物活性機(jī)制,最后總結(jié)了RA的產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀,并對現(xiàn)有研究的不足及未來的發(fā)展方向進(jìn)行了討論。

1 RA的來源和生產(chǎn)

1.1 來源

RA分布于唇形科:香蜂花、夏枯草[3]、神香草[4]、牛至[5]、薄荷[6]、鼠尾草[7]、迷迭香[8]、丹參[9];紫草科:宿苞厚殼樹[10]、蒜味破布木[11]、牛舌草[12]、聚合草[13];傘形科:茴香[14]、歐洲變豆菜[15]、歐當(dāng)歸[16]、扁葉刺芹[17]植物中。此外,RA已從夾竹桃科(沙漠玫瑰)、角苔科(角苔)、烏毛蕨科(紅椿蕨)、菊科(藏掖花)、五加科(天胡荽)等植物中被分離[17-19]。除植物資源外,在蜂膠多酚中也發(fā)現(xiàn)了RA的存在[20]。迷迭香酸來源見圖2。

1.2 生產(chǎn)途徑

RA傳統(tǒng)的提取技術(shù)有水酶法、超臨界流體萃取、超聲波輔助等。近年來,以植物愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)和微生物發(fā)酵生產(chǎn)為代表的新型生產(chǎn)途徑也獲得更廣泛的關(guān)注。迷迭香酸各生產(chǎn)途徑的優(yōu)缺點(diǎn)對比見表1。

表1 迷迭香酸各生產(chǎn)途徑的優(yōu)缺點(diǎn)對比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of different production pathways of rosmarinic acid

水酶提取是一種高效且環(huán)保的提取方法,提取時(shí)間短,且不受有毒溶劑的污染。SU等[7]采用水酶法從鼠尾草中提取RA,發(fā)現(xiàn)纖維素酶的提取效率比蛋白酶更高,而2種酶混合使用可以更有效地破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,提取效率較單一酶更高。超臨界流體萃取也是一種較環(huán)保的提取方式,能選擇性地提取生物活性物質(zhì)。LEFEBVRE等[8]用超臨界流體萃取法發(fā)現(xiàn)RA的開始提取時(shí)間隨著改性劑用量的提高而縮短,說明可以利用時(shí)間差來生產(chǎn)不同的組分。此外,TUNGMUNNITHUM等[21]采用優(yōu)化后的超聲波輔助提取法提取彩葉草中的反式迷迭香酸(trans-RA),結(jié)果證明該方法在產(chǎn)量和提取時(shí)間方面有明顯優(yōu)勢。

因產(chǎn)量高效優(yōu)勢,植物愈傷組織培養(yǎng)和微生物發(fā)酵生產(chǎn)RA的新型途徑受到更多的關(guān)注。應(yīng)用植物愈傷組織培養(yǎng)獲得酚酸體外生產(chǎn)細(xì)胞系,MODARRES等[22]發(fā)現(xiàn)高蔗糖水平能促進(jìn)RA的積累,在50 g/L蔗糖培養(yǎng)基中RA的產(chǎn)量最高。ABBASI等[23]研究了以皺皮香茶菜誘導(dǎo)愈傷組織,生產(chǎn)富含酚酸的生物活性提取物,為該生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用于抗氧化和抗衰化妝品制備提供依據(jù)。除此之外,MAHSA等[24]通過選擇最佳酶變體、增加途徑基因的基因拷貝數(shù)以及通過芳香氨基酸途徑改善前體供應(yīng),優(yōu)化菌株,而后在以葡萄糖為唯一碳源的礦物培養(yǎng)基上,利用酵母菌產(chǎn)生了高達(dá)(5.93±0.06) mg/L的RA,該研究顯示了應(yīng)用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)RA的工藝可行性。ZHOU等[25]構(gòu)建了菌株YRA113-15B,該菌株在搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生了208 mg/L RA,這是迄今為止報(bào)道的工程微生物細(xì)胞的最高迷迭香酸價(jià),這項(xiàng)工作為RA的發(fā)酵生產(chǎn)提供了一個(gè)有前景的平臺(tái)。

2 生物活性

2.1 抗氧化

RA是一種強(qiáng)抗氧化劑[26],DPPH法、ABTS法和CUPRAC法測定RA的抗氧化活性IC50分別為(1.21±0.06)、(1.70±0.07)、(1.21±0.01) μg/mL[27]。其抗氧化機(jī)制可分為減少氧化應(yīng)激[28]、降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平[29]、調(diào)節(jié)相關(guān)酶水平[30]3個(gè)方面。RA的抗氧化機(jī)制如圖3。

圖3 迷迭香酸的抗氧化機(jī)制Fig.3 Antioxidant mechanism of rosmarinic acid注:一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK);活性氧(reactive oxygen species, ROS);迷迭香酸 (rosmarinic acid, RA);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD);酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH);谷胱甘肽(L-glutathione, GSH); 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP);帕金森病(parkinson disease, PD);丙二醛(malonaldehyde, MDA);脂肪組織源干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs);缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH);天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT); Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1, Keap1);核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2, Nrf2); 特異巨噬細(xì)胞武裝因子(specific macrophage arming factor, sMaf);抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements, ARE)。

RA可以有效地降低ROS水平,減少因ROS損傷。GHORBANI等[33]針對RA能否提高脂肪組織源干細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)條件下的存活率進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)RA可降低大鼠ROS水平,有助于保護(hù)ASCs移植到缺血器官后的存活。H2O2和DPPH自由基是ROS的重要來源。ALDOGHACHI等[26]用DPPH法、H2O2清除法和氧化還原法測試RA的抗氧化能力,RA對DPPH自由基的清除能力大于95%(100 μg/mL),對H2O2的清除能力大于87.83%(100 μg/mL),顯示出RA對抑制ROS水平具有較好的作用。FENG等[34]評估RA在17 ℃液態(tài)保存過程中對豬精子抗氧化能力的影響,40 μmol/L RA處理可激活一磷酸腺苷激活的蛋白激酶的磷酸化,從而改善由ROS引起的氧化損傷,進(jìn)而有效提高液態(tài)保存條件下豬精子的抗氧化能力。

2.2 抗癌

研究表明RA具有抗癌活性,包括白血病、結(jié)腸直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌和肺小細(xì)胞癌等癌癥[36]。RA的抗癌機(jī)制包括:抑制相關(guān)信號(hào)通路;抑制癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散;抑制細(xì)胞侵襲和遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。RA的抗癌機(jī)制作用圖見圖4。

MMP中的MMP-2和MMP-9與腫瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲密切相關(guān)。RA能減少侵襲相關(guān)因子MMPs的表達(dá),并通過抑制癌細(xì)胞的PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡。AN等[36]用Matrigel?侵襲試驗(yàn)測試了RA對肝癌細(xì)胞侵襲的影響,通過Western blot檢測MMP-2和MMP-9的表達(dá),結(jié)果顯示RA能顯著降低HepG2細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9的水平,減少癌細(xì)胞的侵襲和遷移。PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞發(fā)生的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)RA(100、200、400 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞能顯著抑制PI3K、p-Akt和NF-κB的蛋白表達(dá)。RA顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究顯示RA劑量依賴性地抑制胰腺癌細(xì)胞的腫瘤生長,增加miR-506的表達(dá),同時(shí)抑制來自異種移植裸鼠的解剖腫瘤組織中MMP2/16和Ki-67的表達(dá)[37]。

表皮生長因子受體是一種位于細(xì)胞表面可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的糖蛋白,RA可以通過減少H2O2水平和抑制表皮生長因子受體的活性來降低癌癥相關(guān)細(xì)胞因子水平。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是全球六大最常見的癌癥類型之一。WAER等[38]研究得出RA/藍(lán)光通過減少表皮生長因子受體活性和H2O2的產(chǎn)生,從而有效抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。此外,RA能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞凋亡相關(guān)抑制蛋白的表達(dá)水平。AN等[36]研究了RA對HepG2細(xì)胞生長、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用,RA有效減少細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá),增加促凋亡蛋白Bax和裂解的caspase-3的表達(dá),以劑量依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞增殖。

2.3 抗代謝性疾病

RA能夠調(diào)節(jié)脂肪代謝紊亂,對糖尿病以及與肥胖相關(guān)的疾病的治療有積極的作用,在抗代謝疾病方面發(fā)揮著重要作用。

慢性炎癥和過量脂質(zhì)積累是肥胖及其相關(guān)代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志,RA可通過調(diào)節(jié)NRF2信號(hào)的變化來抑制炎癥,并通過促進(jìn)AMPK和乙酰-CoA羧化酶的激活來抑制脂肪酸的合成和增強(qiáng)脂肪酸的氧化,進(jìn)而緩解因脂質(zhì)過量積累導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂,可用于治療非酒精性脂肪性肝炎[39]。VASILEVA等[40]研究發(fā)現(xiàn)RA能促進(jìn)Simpson-Golabi-Behmel綜合征細(xì)胞的抗脂肪和抗炎活性,從而預(yù)防人類脂肪細(xì)胞的炎癥和過度的脂肪堆積。

高血糖和氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)是造成糖尿病血管病變的氧化應(yīng)激和炎癥過程的關(guān)鍵誘因。在高血糖條件下,oxLDL通過p38-FOXO1-TXNIP途徑促進(jìn)NLRP3炎癥體的激活,最終導(dǎo)致NLRP3炎癥體介導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂。NYANDWI等[41]研究發(fā)現(xiàn)RA通過下調(diào)p38-FOXO1-TXNIP途徑和抑制炎癥體的激活來抑制糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮功能障礙,揭示了RA對糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮功能障礙產(chǎn)生保護(hù)作用,并推測RA可作為糖尿病和心血管疾病的天然預(yù)防劑或治療劑。季莉莉等[42]研究表明,夏枯草水提物(RA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～20%)可以緩解血視網(wǎng)膜屏障損傷導(dǎo)致的伊文氏藍(lán)滲漏,抑制NF-κB信號(hào)通路和抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活來緩解視網(wǎng)膜的炎性損傷,即具有改善糖尿病視網(wǎng)膜病的藥效活性。

2.4 神經(jīng)保護(hù)

RA可以通過抑制過量谷氨酸的釋放來防止神經(jīng)因興奮性毒性受到損傷,并能通過調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激等非淀粉樣蛋白生成途徑來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì),然而,過量的谷氨酸釋放會(huì)導(dǎo)致興奮性毒性。WANG等[43]發(fā)現(xiàn)RA能夠激活大腦皮層突觸體內(nèi)的γ-氨基丁酸A型受體,減少鈣內(nèi)流,并通過鈣調(diào)素依賴性激酶II/突觸素I途徑抑制谷氨酸的釋放。MOHAMMADMEHDI等[44]建立了大鼠腦室注射脂多糖的神經(jīng)炎癥模型,觀察了RA對炎性細(xì)胞因子、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響,結(jié)果表明RA以劑量依賴的方式恢復(fù)了氧化-抗氧化平衡,并防止了海馬和前額皮層中促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生。

RA通過改善認(rèn)知功能障礙在治療神經(jīng)性疾病中發(fā)揮顯著作用。乙醇可引起認(rèn)知障礙,RA能夠以劑量依賴的方式預(yù)防乙醇引起的氧化損傷、記憶缺陷和認(rèn)知功能障礙[45]。RA也可改善因阿爾茨海默病引起的認(rèn)知功能障礙。MIRZA等[46]建立Aβ1-42誘導(dǎo)的小鼠阿爾茨海默病模型,結(jié)果表明RA對Aβ1-42所致小鼠空間記憶和再認(rèn)記憶障礙及焦慮改變均有保護(hù)作用。LI等[47]研究了RA是否能影響缺氧/缺血(hypoxia/ischeamic,H/I)損傷引起的白質(zhì)纖維和認(rèn)知障礙的變化,發(fā)現(xiàn)RA通過改善胼胝體的再髓鞘化,從而緩解了H/I損傷后的認(rèn)知功能障礙如運(yùn)動(dòng)、焦慮行為、學(xué)習(xí)和空間記憶障礙等[47]。

2.5 其他

除此之外,RA還具有抗病毒、抗菌、抗衰老、抗抑郁、抗炎以及抗過敏[48]等功能活性。

3 迷迭香酸在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 功能性食品原料

RA具有抗氧化、抗炎等多種生物活性,在功能食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。RA是王老吉涼茶和中國傳統(tǒng)茶飲羅布麻[1]中的主要功能成分之一,與茶飲的抗衰老、抗氧化活性密切相關(guān)。LC-MS分析顯示, 迷迭香提取物主要含沒食子兒茶素和RA,并且RA精油和其提取物安全有益,可作為飲料行業(yè)的保健成分[49]。野生百里香提取物中主要酚類化合物為RA,主要揮發(fā)性化合物為香芹酚,該提取物安全可靠,能用于生產(chǎn)功能性食品[50]。高村亮宏等[51]發(fā)明了以RA衍生物或其鹽用于制造預(yù)防或改善膀胱過度活動(dòng)癥的食品。一種降尿酸保健品以迷迭香提取物、蒲公英提取物、百合提取物和牡丹根提取物為功效原料,具有顯著的降尿酸效果,且不會(huì)造成肝腎損傷[52]。仲米存等[53]以迷迭香、鼠尾草等為原料制備了一種具有抗焦慮作用的食品,能供輕、中度抑郁人群日常食用。一種以核桃粉、迷迭香、廣沙仁等為成分的功能食品,能緩解疲勞、恢復(fù)體力及提高人體工作效率[54]。

3.2 食品保鮮劑

迷迭香提取物中富含RA,RA具有抗氧化、抗菌活性,在食品的貯存、加工、運(yùn)輸中作保鮮劑。周詩雨等[55]發(fā)明了一種含有RA的復(fù)合抑菌增強(qiáng)劑,能有效抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌,在冷鮮豬肉中補(bǔ)充此抑菌增強(qiáng)劑能實(shí)現(xiàn)預(yù)防、減輕、延緩食品腐敗所帶來的相關(guān)問題。他們還發(fā)明了一種含RA的復(fù)合抗氧化增強(qiáng)劑,能保持豬肉的色澤和鮮度且不產(chǎn)生腐敗氣味[56]。陳以新[57]發(fā)明了一種具有抗菌、抗氧化作用的復(fù)合保鮮劑,以明膠、海藻酸鈉、RA等為原料,對蘑菇的保鮮效果好。鼠尾草提取物和迷迭香提取物具有協(xié)同作用,能應(yīng)用于保鮮劑制備[58]。黃毅[59]發(fā)明了一種添加了RA和美洲花椒素的保鮮劑,具有較好的穩(wěn)定性并能顯著延長食品保質(zhì)期。

3.3 食品添加劑和調(diào)味劑

根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》,迷迭香提取物被批準(zhǔn)為食品添加劑。富含RA的香蜂花提取物具有成為食品的天然添加劑的潛力,可為烘焙產(chǎn)品提供有利的功能特性[60]。左汶駿等[61]發(fā)明了一種添加了RA的甜辣醬,酸辣可口并具有開胃作用。

4 小結(jié)和討論

目前,RA的研究涉及面廣泛,主要包括3個(gè)方面。a)RA的綠色高效生產(chǎn)方式:水酶法在傳統(tǒng)酶解法上進(jìn)行了改進(jìn);超臨界流體萃取法提取率高并且對環(huán)境友好;超聲波輔助提取法耗時(shí)短;植物愈傷組織生產(chǎn)RA高效;微生物發(fā)酵為工業(yè)化生產(chǎn)RA提供了新思路。b)RA生物活性機(jī)制:RA能抑制氧化應(yīng)激并提高抗氧化能力;RA通過抑制癌細(xì)胞增殖擴(kuò)散和侵襲遷移以及EMT、抑制癌癥相關(guān)信號(hào)通路的激活、下調(diào)凋亡抑制蛋白的表達(dá)同時(shí)上調(diào)凋亡蛋白的表達(dá)來發(fā)揮對多種癌癥的治療作用;RA具有抗炎活性,能改善脂肪代謝,并能預(yù)防治療糖尿病和心血管疾病;RA還能通過改善認(rèn)知障礙和炎癥及氧化-抗氧化平衡發(fā)揮對神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)作用。c)RA的產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀:RA在食品領(lǐng)域主要被用于功能性食品原料、食品保鮮劑、食品添加劑及調(diào)味劑。

但RA研究的局限性仍然存在,RA的未來研究可以針對培養(yǎng)以下三點(diǎn)展開:

a)開發(fā)新型提取技術(shù)。BARDOT等[62]報(bào)道了一種新技術(shù)ipowder?應(yīng)用于香蜂花中RA的提取,研究發(fā)現(xiàn)ipowder?提取的RA含量高,抗氧化活性強(qiáng),這項(xiàng)技術(shù)能在保留植物化合物的完整性的同時(shí)使一些活性成分更容易獲得。其次,微生物的發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量高,能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),選育生產(chǎn)RA的高效菌株也是提高RA產(chǎn)量的途徑之一。將誘導(dǎo)子(茉莉酸甲酯、水楊酸、多壁碳納米管)[63]用于處理植物對RA的生物合成途徑提供了參考。

b)動(dòng)物研究模型多樣化。RA生物活性的研究模型較為單一,未來可以利用斑馬魚或兔等模型開展研究,為RA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

c)提高RA的生物利用度。RA的生物利用度較低,可通過制備RA衍生物、聯(lián)合其他活性成分使用來提高其利用率。例如,CARDULLO等[64]報(bào)道了RA衍生物酰胺1～10,衍生物具有比RA更優(yōu)越的α-葡萄糖苷酶抑制活性,比抗糖尿病藥物阿卡波糖更有效,并被證明是有效的抗氧化劑。百里醌、香芹酚、百里酚、RA的組合具有協(xié)同作用[65],可以將這些活性成分聯(lián)合使用。此外,BANKOLE等[66]將迷迭香多酚封裝在一種脂質(zhì)體中,使得其物理化學(xué)及生物性能最佳。此外,將RA進(jìn)行磷酸化、乙?；?、羧甲基化、硫酸化等修飾處理,研究其是否會(huì)產(chǎn)生新的生物活性,或某一生物活性是否能得到提高,這為RA的生物活性研究提供了新思路。