王伯韜,張華月,崔樹茂,翟齊嘯,張?zhí)烀?/p>

1(華熙生物科技股份有限公司,山東 濟南,250101)2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是少數(shù)能夠在人體胃部生存的細菌之一。作為一種致病菌,Hp的存在與慢性胃炎、消化性胃潰瘍等多種胃腸道疾病密切相關[1-3]。研究表明,根除Hp能夠顯著緩解Hp陽性患者的胃部疾病負擔[4]。Hp有著極高的傳染率及感染率。在全球范圍內,Hp的感染率超過了50%,而我國Hp的感染率高達55.8%,高于全球總體水平[5]。有研究表明,Hp感染能夠促進胃癌的發(fā)生與發(fā)展[6],因此,世界衛(wèi)生組織在2010年將Hp歸類為Ⅰ類致癌物質。目前,對于Hp感染國內外專家都建議采取根除治療。對于Hp的根除治療方法,臨床上常使用質子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPI)與抗生素的組合,但隨著抗生素的不斷使用,導致Hp的耐藥株出現(xiàn),使得Hp的根除率不斷降低,同時,抗生素的使用還使得患者出現(xiàn)諸如惡心、腹瀉等副作用[7]。因此,急需探索具有拮抗Hp作用的非抗生素物質。近年來,大量研究表明直接或者間接給予益生菌干預能夠提高Hp陽性患者的轉陰率,減輕抗生素治療帶來的副作用[8-9]。

透明質酸(hyaluronan,HA)是一種線性糖胺聚糖,在人體內廣泛存在,具有保濕、潤滑、抗氧化及抗炎等特性[10]。透明質酸鈉作為透明質酸的結合鹽,分別于2008年及2021年被批準可以作為食品原料應用于保健及普通食品中。有研究表明,HA參與機體內炎癥反應及組織再生,且這種作用的發(fā)揮與透明質酸的分子質量息息相關[11]。

前期研究證明,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259具有拮抗Hp的作用[12]。本研究擬通過確定具有拮抗Hp效果的透明質酸鈉的分子質量,將其與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259進行復配,探究復配組方在動物及臨床上拮抗Hp的效果,以期開發(fā)出一款能夠干預治療Hp感染的復配產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與Hp SS1,江南大學食品學院食品生物技術中心菌種保藏庫。

1.1.2 實驗動物

4周齡、雄性、C57BL/6品系小鼠,平均體重為(16.5±0.5) g,購于上海斯萊克實驗動物公司,飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.1.3 試劑

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI),青島海博公司;胎牛血清,南京諾唯贊公司;哥倫比亞培養(yǎng)基,英國OXOID公司;無菌脫纖維綿羊血,杭州新銳公司;PCR引物,上海生工生物工程公司;透明質酸鈉,AbateHPTM透明質酸益生菌粉,山東海御華熙生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器與設備

CFX 實時熒光定量儀,美國伯樂(Bio-Rad)公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋,日本SANYO公司;i160三氣培養(yǎng)箱、LYNX4000大容量冷凍離心機、Multiscan Go多功能酶標儀,美國Thermo公司;BSC-1000ⅡA2 型生物安全柜,蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 動物實驗設計

本研究已經過江蘇省血吸蟲病防治研究所倫理委員會審核(編號:JlPD-2020071)。小鼠在實驗正式開始前適應1周。

1.3.1 不同分子質量HA拮抗Hp感染的動物實驗方案

動物實驗方案設計參考HONG等[13]的方法并稍做改進,60只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,將其隨機分為6組,每組10只。造模組及實驗組小鼠隔天灌胃200 μL BHI重懸的Hp菌懸液(濃度為109CFU/mL)總共灌胃5次。實驗組小鼠每天灌胃200 μL用PBS溶解的不同分子質量透明質酸鈉(質量濃度為3 mg/mL);空白組及造模組小鼠每天灌胃200 μL PBS。2次灌胃間隔1 h,實驗持續(xù)9 d,具體實驗方案如表1所示。

表1 不同分子質量HA拮抗Hp感染實驗方案Table 1 Experimental scheme of antagonistic effect of HA with different molecular weights on Hp infection

1.3.2 高分子質量HA與乳桿菌復配拮抗Hp感染的動物實驗設計

30只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,將其隨機分為3組,每組10只。造模組及實驗組小鼠隔天灌胃200 μL BHI重懸的Hp菌懸液(濃度為109CFU/mL)總共灌胃5次。實驗組小鼠每天灌胃200 μL 用PBS溶解的高分子質量透明質酸鈉與乳桿菌復配溶液(其中高分子質量透明質酸鈉質量濃度為3 mg/mL,乳桿菌菌懸液終濃度為109CFU/mL);空白組及造模組小鼠每天灌胃200 μL PBS。2次灌胃間隔1 h,實驗持續(xù)9 d,具體實驗方案如表2所示。

表2 HA-益生菌復配拮抗Hp感染實驗方案Table 2 Experimental scheme of antagonistic effects of HA-probiotic compounds on Hp infection

1.3.3 動物實驗樣本采集及指標測定

1.3.3.1 動物實驗樣本采集

實驗動物在最后一次灌胃后,禁食24 h,采用10 mg/mL的戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行腹腔注射,使其麻醉,后進行小鼠眼球取血,最后輔以頸椎脫臼法使其死亡,立即解剖取出胃,沿胃大彎剪開,取完整的胃組織(包括胃竇、胃體等),一半用于病理學切片檢測,另一半進行Hp定殖量檢測。

1.3.3.2 Hp感染小鼠胃部Hp定殖量測定

取2 mL培養(yǎng)好的Hp菌液,用PBS洗滌后,6 000×g離心5 min,重復3次。將Hp菌泥梯度稀釋后取100 μL涂板計數(shù),另外一部分使用TRIzol提取Hp RNA,反轉錄為cDNA,使用熒光定量SYBR Green法測定Ct值,Hp特異性引物參考閆宗寶等[14]的方法設計,序列為:上游 TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC,下游 CATAGGATTTCACACCTGACTGACTAT,建立菌落數(shù)(CFU)與Ct值標準曲線。

稱量感染小鼠胃組織質量,取200 mg收集到的小鼠胃部組織,用TRIzol法提取小鼠胃組織RNA,反轉錄為cDNA,使用熒光定量SYBR Green法測定Ct值,使用標準曲線進行比對,計算小鼠胃內Hp的定殖量。

1.3.3.3 Hp感染小鼠胃組織病理學切片觀察

感染小鼠胃部病理學切片參照劉陽[15]的方法操作,方法大致如下:小鼠胃部組織使用4%(體積分數(shù))多聚甲醛固定24 h,經過石蠟包埋,冷凍切片及蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining,HE染色)后,在倒置顯微鏡下觀察。

1.4 臨床試驗設計

本研究已經通過江蘇省鹽城市亭湖區(qū)人民醫(yī)院倫理管理委員會審核(編號:ET2021085),并在中國臨床注冊中心進行注冊(注冊號:ChiCTR2100053710)。臨床試驗方法參照張美怡[12]的實驗方法設計,臨床試驗共招募60名受試者,將受試者隨機分為3組,每組20人,分別為安慰劑組、透明質酸組及復配組。安慰劑組給予安慰劑產品,透明質酸組給予包含100 mg/條 100～150 wDa透明質酸的產品,復配組給予AbateHPTM透明質酸益生菌粉,菌粉包含100 mg/條 100～150 wDa透明質酸及5×109CFU/條鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259。透明質酸組與復配組產品除已標出的成分外均與安慰劑成分相同。受試者早晚各攝入1條,服用4周。所有產品均為粉末狀,外觀及包裝均無差別。

1.4.1 臨床試驗受試者納入及排除標準

招募人群為在實驗開始前經過14C呼氣實驗檢測為Hp陽性且無胃腸道病史的人群。在臨床試驗開始前1個月內服用過抗生素的受試者將被排除在外。

1.4.2 臨床試驗指標測定

招募人群為在實驗開始前經過14C呼氣實驗檢測為Hp陽性且無胃腸道病史的人群。在臨床試驗開始前1個月內服用過抗生素的受試者將被排除在外。

1.4.2.114C呼氣檢測

受試者在實驗開始前1 d及結束后1 d進行14C呼氣檢測。

1.4.2.2 血常規(guī)及血生化指標測定

受試者在研究開始前1 d及結束后1 d抽取空腹肘靜脈血,進行血常規(guī)檢測及血液生化分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)差異性用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8 進行分析,計量數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準誤差”,多組別間的差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩組之間差異性比較采用t檢驗,圖形的繪制通過 GraphPad Prism 8 完成。

2 結果與分析

2.1 不同分子質量HA對感染小鼠胃部Hp定殖量的影響

Hp通過定殖在胃上皮細胞上發(fā)揮其致病作用。有研究表明,幽門螺桿菌定殖量與其致病程度呈正相關[16]。因此,Hp在小鼠胃內定殖量的變化情況可以直接反映HA對Hp感染作用效果。如圖1所示,空白組小鼠胃內Hp含量約為102CFU左右,而造模組小鼠胃內Hp含量顯著高于空白組,在104CFU左右。經過PPI處理后,小鼠胃內Hp水平顯著下降。同時,與造模組相比,中低分子質量HA干預后,感染小鼠體內Hp含量有輕微下降趨勢,但在統(tǒng)計學上無顯著性差異,而在高分子質量HA干預后,感染小鼠胃內Hp含量顯著降低,說明高分子質量HA或可存在拮抗Hp的作用。

圖1 HA對胃部Hp定殖量的影響Fig.1 Effects of HAs on Hp Colonization in the stomach注:*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同。

2.2 不同分子質量HA對感染小鼠胃部病理學切片的影響

為進一步探究不同分子質量HA拮抗Hp的作用,對感染小鼠胃部病理學情況進行觀察。Hp感染后胃部的病理情況主要是通過胃部組織病理切片情況進行評價。不同處理組小鼠胃黏膜HE染色后結果如圖2所示,感染Hp后小鼠胃黏膜固有層炎癥細胞浸潤顯著性增多。HENRIQUES等[17]利用Hp感染的C57BL/6小鼠評價不同規(guī)格乙?；瘹ぞ厶俏⑶驅p感染的緩解效果,對感染小鼠胃組織病理學切片進行觀察發(fā)現(xiàn),在經過Hp感染后,小鼠胃黏膜上皮結構紊亂,并出現(xiàn)可見的炎性細胞浸潤,這與本研究出現(xiàn)的病理結果相似。如圖2所示,低分子質量HA沒有改善這一情況,而PPI組、中分子質量和高分子質量HA組小鼠胃黏膜與正常對照組類似,基本沒有炎癥細胞浸潤情況,這進一步證明了中分子質量和高分子質量HA能夠對Hp感染引起的炎癥反應有一定的緩解效果。杭興偉等[18]的研究證明,透明質酸能夠抑制炎性細胞的趨化及移動,表明透明質酸具有緩解炎癥的作用,這與本文研究結果基本一致。

A-空白組;B-造模組;C-PPI干預組;D-低分子質量HA組; E-中分子質量HA組;F-高分子質量HA組圖2 HA對小鼠胃黏膜的影響Fig.2 Effects of HAs on Gastric mucosa of mice

2.3 高分子質量HA與乳桿菌復配對感染小鼠胃部Hp定殖量的影響

諸多研究證明,鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌及干酪乳桿菌等多種乳桿菌具有拮抗Hp的作用。張美怡[12]研究了多種乳桿菌在體外緩解幽門螺桿菌的作用,證明鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259在體外能夠拮抗Hp,存在臨床上拮抗幽門螺桿菌的潛能。前面的研究已經證明,高分子質量HA能夠降低Hp感染小鼠體內Hp定殖量,減輕感染小鼠胃部炎癥。為了探究HA與乳桿菌的協(xié)同效果,將高分子質量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復配,利用Hp感染動物模型探究復配組方對Hp的緩解作用。如圖3所示,造模組小鼠體內Hp含量顯著高于空白組,在鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質量HA干預后,感染小鼠體內Hp含量得到了顯著降低。

圖3 HA-益生菌組合物對胃部Hp定殖量的影響Fig.3 Effects of HA-probiotic compounds on Hp Colonization in the stomach

A-空白組;B-造模組;C-復配組圖4 HA-益生菌組合物對小鼠胃黏膜的影響Fig.4 Effects of HA-probiotic compounds on Gastric mucosa of mice注:HE染色(200×)。

2.4 高分子質量HA與乳桿菌復配對感染小鼠胃部病理學切片的影響

觀察乳桿菌與高分子質量HA干預后Hp感染小鼠胃部組織切片。在經過Hp感染后,小鼠胃部組織出現(xiàn)了明顯的黏膜脫落,與上述實驗結果一致,在經過Hp感染后,小鼠胃組織中出現(xiàn)明顯的炎性浸潤,且這種炎性浸潤作用在經過鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質量HA復配組方干預后獲得了一定的緩解。因此,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質量HA復配能夠顯著降低Hp定殖量,緩解因Hp感染引發(fā)的胃部炎癥,具有較好拮抗Hp的潛力。

2.5 臨床試驗受試者基本信息

基于上述動物實驗研究結果,對具有較好表現(xiàn)的鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259與高分子質量HA復配組方(AbateHPTM)進行臨床干預,評價其臨床功效。實驗共招募60名符合條件的受試者,最終有48人完成了本次研究。具體實驗完成情況如圖5所示。

圖5 臨床試驗完成情況Fig.5 Completion of clinical trials

完成實驗的48名受試者的基本信息如表3所示。在完成實驗的48名受試者中,各組之間的年齡無統(tǒng)計學上的差異性,具有可比性。

表3入組受試者基本信息Table 3 Basic information of the enrolled subjects

2.6 高分子質量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復配對受試者轉陰率及有效率的影響

臨床上經常使用14C呼氣檢測的方法來診斷受試者是否存在Hp感染。有研究表明,呼氣試驗可以反映受試者體內Hp的密度[19],因此,在受試者在實驗開始前一天及結束后一天進行14C呼氣實驗以檢測在經過干預后受試者體內Hp的變化情況。表4反映了HA及復配組方干預后受試者轉陰率的變化情況。在完成實驗的48人中,安慰劑組的16人中有5名受試者轉為陰性,轉陰率為31.25%,而HA組的15人中,有8名受試者轉為陰性,轉陰率為53.33%,為安慰劑組的2倍,表明經過HA干預可以降低Hp患者體內Hp定殖密度。在復配組的17人中有11人轉變?yōu)殛幮?轉陰率為64.71%,略高于HA組,表明HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259聯(lián)合使用具有協(xié)同增效的效果。以上實驗結果說明,HA及復配組方均能夠降低Hp陽性患者體內Hp的定殖密度,復配組方的拮抗效果略高于單攝入透明質酸。HOLZ等[20]的一項隨機臨床試驗探究了具有Hp共聚能力的羅伊氏乳桿菌對Hp陽性患者的影響,與本實驗結果相似,在經過羅伊氏乳桿菌干預后,受試者體內Hp定殖量也表現(xiàn)出顯著降低。

表4 HA-益生菌對Hp根除率的影響Table 4 Effects of HA-probiotic compounds on eradication rates of Hp

為更加直觀地觀察各組干預對受試者體內Hp變化的影響,定義受試者在干預前后14C呼氣值下降超過100為有效,對各組受試者進行有效人數(shù)統(tǒng)計,計算有效率。如表5所示,在經過安慰劑干預后,16名受試者中有6名受試者在干預前后呼氣值下降超過100,有效率為37.50%,而在15名受試者的HA組及17名受試者的復配組中,分別有10名和13名受試者在干預前后呼氣值降低超過了100,有效率分別為66.67%和76.47%,表明HA及復配組方干預均能有效拮抗Hp感染,且復配組方的拮抗效果略高于單攝入透明質酸。

2.7 高分子質量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復配對受試者血常規(guī)及血生化指標的影響

為了進一步測定HA及復配組干預對受試者基本生理狀態(tài)的影響,對受試者在干預前后進行血常規(guī)及血液生化檢測。受試者在實驗開始前一天及結束后一天抽取空腹肘靜脈血進行血常規(guī)及肝臟、腎臟相關血液生化指標檢測,檢測結果如圖6所示。在經過HA或復配組方干預后,受試者白細胞、紅細胞、血小板及血紅蛋白濃度等血常規(guī)基本指標并未發(fā)生顯著變化,肝功能相關血液生化指標谷草轉氨酶、總膽紅素及腎臟相關指標尿素氮等也未發(fā)生明顯改變,說明HA及復配組方干預并不會對受試者肝臟及腎臟相關指標產生明顯影響。MEHLING等[21]探究了羅伊氏乳桿菌DSM17648干預對Hp感染陽性患者的影響,結果表明經過羅伊氏乳桿菌DSM17648干預并不會對Hp感染陽性患者血常規(guī)及血液生化指標產生不利影響,這與本文的研究結果基本一致。

a-白細胞;b-紅細胞;c-血紅蛋白濃度;d-血小板;e-堿性磷酸酯酶;f-谷草轉氨酶;g-總膽紅素;h-谷胱甘肽還原酶;i-尿素氮圖6 干預對受試者血常規(guī)及血生化指標的影響Fig.6 Effects of intervention on blood routine and blood biochemical indexes of subjects

3 結論

前期研究表明,鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259在體外具有拮抗幽門螺桿菌的作用,主要表現(xiàn)在能夠顯著抑制Hp生長以及抑制Hp與AGS細胞的黏附。動物實驗結果證明,單使用高分子質量HA或者使用高分子質量HA與鼠李糖乳酪桿菌CCFM1259復配均能夠顯著降低感染小鼠體內Hp定殖量,減輕小鼠因Hp感染引起的胃部炎癥。進一步的臨床試驗結果表明,HA及復配組方干預均提高了受試者Hp轉陰率及有效率,特別是在復配組方干預后,并且干預未發(fā)現(xiàn)對受試者基本生理狀態(tài)產生影響。