劉帥,王志磊,周世斌,袁春龍,3*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)2(留壩縣農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展與監(jiān)督服務(wù)中心,陜西 漢中,724100) 3(西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站,陜西 渭南,714000)

根據(jù)國(guó)際葡萄與葡萄酒組織2021年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,世界葡萄產(chǎn)量為7 474.8萬(wàn)t,其中鮮食葡萄占比43.3%。鮮食葡萄產(chǎn)量增長(zhǎng)1.5%,但世界鮮食葡萄消費(fèi)量仍然低于產(chǎn)量。同在陜西省據(jù)果業(yè)局統(tǒng)計(jì)公報(bào)顯示,2021年陜西省鮮食葡萄產(chǎn)量為85.15萬(wàn)t,相比去年增長(zhǎng)了5.5%。鮮食葡萄產(chǎn)量不斷上漲,已出現(xiàn)季節(jié)性供大于求的趨勢(shì)[1],為解決生產(chǎn)相對(duì)過(guò)剩的問(wèn)題,需要進(jìn)行葡萄的深加工來(lái)提高產(chǎn)品附加值,葡萄酒釀造就是其中一種,但目前在鮮食葡萄釀酒方面的研究較少[2-4],很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的增值增效。而且國(guó)內(nèi)大多數(shù)消費(fèi)者對(duì)于干型紅葡萄酒的口感接受度不高,為此很多人選擇鮮食葡萄進(jìn)行家庭釀造葡萄酒。

葡萄酒的品質(zhì)受到葡萄品種[5]、氣候和栽培方式[6]、釀造工藝[7-8]、酵母[9-10]等多種因素的影響。而對(duì)于鮮食葡萄而言,原料方面存在皮薄、肉質(zhì)堅(jiān)硬、出汁率低、含糖量不高的缺陷[11],目前使用的鮮食葡萄的釀造工藝,容易引起葡萄酒微生物污染、甲醇超標(biāo)、顏色較淺、高級(jí)醇含量高、口感寡淡等問(wèn)題[12-13]。因此,需要對(duì)鮮食葡萄釀酒的關(guān)鍵工藝技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究,而鮮食葡萄發(fā)酵菌種的篩選就是其中重要的環(huán)節(jié)之一。鮮食葡萄釀酒缺乏專用酵母菌,這是鮮食葡萄酒品質(zhì)較差的重要原因之一。要獲得品質(zhì)優(yōu)秀、具有鮮食葡萄特色的葡萄酒,篩選合適的酵母菌十分重要[14]。目前針對(duì)鮮食葡萄釀酒的酵母種類較少,使得鮮食葡萄酒失去了特征,無(wú)法展現(xiàn)鮮食葡萄酒的特點(diǎn)[15]。

因此,本實(shí)驗(yàn)選取陜西主栽品種之一的“戶太8號(hào)”為原料,進(jìn)行鮮食葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母的分離篩選,以期獲得適合鮮食葡萄釀造的菌株,增加家庭釀造葡萄酒的多樣性。從商業(yè)酵母和專用酵母兩方面對(duì)比篩選,對(duì)未來(lái)鮮食葡萄酵母篩選研究方向提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄原料

戶太8號(hào),采自陜西省西安市鄠邑區(qū)崔家灣村(東經(jīng)108.6,北緯34.1),采收時(shí)間為2020年10月,原料含糖量170 g/L,可滴定酸含量為3.60 g/L(以酒石酸計(jì))。

1.1.2 商業(yè)酵母

釀酒酵母SY,安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母ST,法國(guó)Laffort公司;釀酒酵母LA-PE,法國(guó)OENOFRANCE公司;釀酒酵母EC1118,法國(guó)Lallemand公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂20(固體培養(yǎng)基加入);WL培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary-60紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),安捷倫科技(中國(guó))有限公司;FTIR Lyza 5000 Wine葡萄酒分析儀,奧地利Anton Paar公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌種分離鑒定

取自然發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)時(shí)期(除梗破碎后Z1、酒精發(fā)酵前期Z2、中期Z3、后期Z4和末期Z5)的葡萄酒樣1 mL進(jìn)行梯度稀釋(10-3、10-4、10-5),均勻涂布在WL培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取單菌落,多次劃線純化,并接種單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中活化24 h,之后劃線接種于WL鑒別培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行初步歸類[16]。

將酵母菌菌種委托深圳華大基因股份有限公司鑒定。在離心管中加入200 μL預(yù)處理液與適量菌樣品,充分研磨。再加入20 μL Proteinase K溶液,混勻,37 ℃放置30～60 min。加入200 μL裂解液,混勻,70 ℃放置10 min。加200 μL無(wú)水乙醇,混勻,短離心。過(guò)吸附柱室溫放置5～10 min。向吸附膜中間位置懸空滴加50～100 μL ddH2O,室溫放置5～10 min,12 000 r/min離心2 min,收集溶液于離心管中。16S/18S擴(kuò)增后進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),觀察條帶性狀并按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn),上機(jī)檢測(cè)。并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)。

1.3.2 酵母一級(jí)篩選

將分離純化得到的酵母菌株活化2 d,至其活性高度旺盛期,接入放有倒置杜氏管的YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d,每隔12 h觀察其產(chǎn)氣情況,記錄杜氏管內(nèi)氣體體積[17]。篩選出起酵速度快,產(chǎn)氣較多的菌株,并用于二級(jí)篩選。

1.3.3 酵母二級(jí)篩選

1.3.3.1 高酒精耐受性試驗(yàn)

在裝有YPD液體培養(yǎng)基的試管中,放入倒置的杜氏管(不含空氣)。液體培養(yǎng)基先于121 ℃滅菌20 min,試管中培養(yǎng)基冷卻至室溫,作為基礎(chǔ)YPD培養(yǎng)基。在無(wú)菌條件下加入無(wú)水乙醇,使試管中酒精含量為8%、10%、12%、14%。將一級(jí)篩選出酵母菌株活化后按2%的接種量接入培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)2 d,每隔12 h觀測(cè)其生長(zhǎng)狀況,判斷其酒精耐受性。以商業(yè)釀酒酵母及空白試驗(yàn)作為對(duì)照。

1.3.3.2 低pH值耐受性試驗(yàn)

無(wú)菌條件下用1 mol/L的鹽酸溶液分別調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基的pH值為2.0、2.5、3.0、3.5。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 高糖耐受性試驗(yàn)

無(wú)菌條件下使用葡萄糖調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基的葡萄糖含量分別為20%、30%、40%、50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.4 高SO2耐受性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下分別向YPD培養(yǎng)基中加入不同量的亞硫酸溶液,使培養(yǎng)基中SO2含量為200、250、350、450 mg/L。酵母菌接種與觀察方法同1.3.3.1節(jié)。

1.3.4 發(fā)酵性能測(cè)定

1.3.4.1 葡萄酒發(fā)酵工藝

按小容器釀造法釀造葡萄酒[18],將800 g經(jīng)挑選與除梗后的戶太8號(hào)葡萄破碎為葡萄醪,裝入1 L發(fā)酵罐中,調(diào)整總糖至216 g/L。在20 ℃下,采用二級(jí)篩選獲得的酵母及4種商業(yè)酵母(SY、ST、LA-PE、EC1118),使用YPD培養(yǎng)基活化擴(kuò)培至108CFU/mL后以5×106CFU/L的接種量接種到葡萄醪中進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.4.2 葡萄酒發(fā)酵曲線

每12 h測(cè)定發(fā)酵過(guò)程葡萄醪中還原糖的變化,并繪制發(fā)酵曲線。在發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行皮渣分離并澄清過(guò)濾。

1.3.4.3 基本理化指標(biāo)測(cè)定

葡萄酒中酒精度、可滴定酸、揮發(fā)酸、pH、甘油及總酚含量使用葡萄酒分析儀測(cè)定;葡萄酒中還原糖的含量采用菲林試劑熱滴定法測(cè)定;葡萄酒CIELab值采用葡萄酒顏色分析儀測(cè)定。所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4.4 葡萄酒的感官評(píng)價(jià)

成立10人的感官品評(píng)小組,均經(jīng)過(guò)專業(yè)的感官培訓(xùn)。小組成員從葡萄酒外觀、香氣、口感、平衡性4個(gè)方面進(jìn)行打分,得出葡萄酒的感官質(zhì)量整體評(píng)價(jià)。

1.3.4.5 數(shù)據(jù)分析

采用Mircosoft EXCEL 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖;Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離

從鮮食葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中5個(gè)時(shí)期共分離出110株酵母菌,將其按不同時(shí)期編號(hào)劃分,除梗破碎時(shí)期、發(fā)酵前期、發(fā)酵中期及發(fā)酵后期及發(fā)酵末期編號(hào)分別為Z101～Z130、Z201～Z220、Z301～Z320、Z401～Z420、Z501～Z520,以商業(yè)酵母SY做對(duì)照。對(duì)分離出的110株酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,按照其形態(tài)類型分類匯總,分為六類,如表1所示。

表1 自然發(fā)酵汁中分離的菌落形態(tài)描述Table 1 Description of colony morphology isolated from natural fermented juice

2.2 酵母種群的動(dòng)態(tài)變化

從每一類菌株中挑選1～2個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行檢測(cè)鑒定。結(jié)果顯示(圖1)從自然發(fā)酵汁中分離得到的110株酵母菌株分屬5大類,分別為畢赤酵母屬、擬威克酵母屬、釀酒酵母屬、有孢漢遜酵母屬和Starmerella屬。除梗破碎時(shí)期在鮮食葡萄醪液中的酵母種群數(shù)量最豐富,其中畢赤酵母是優(yōu)勢(shì)種群,隨著酒精發(fā)酵的啟動(dòng),擬威克酵母屬和畢赤酵母屬菌株逐漸消失;在發(fā)酵過(guò)程的前、中、后期,有孢漢遜酵母和釀酒酵母是優(yōu)勢(shì)種群,尤其在發(fā)酵中期只分離到了有孢漢遜酵母和釀酒酵母;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),釀酒酵母逐漸顯示出比有孢漢遜酵母更強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì);發(fā)酵后期,Starmerella屬酵母再次活躍;發(fā)酵末期,發(fā)酵液中分離到釀酒酵母占比最高。

圖1 五個(gè)時(shí)期的酵母種群變化Fig.1 Variations in yeast species over five periods

2.3 耐受性分析

通過(guò)產(chǎn)氣篩選得到了20株發(fā)酵性能好、產(chǎn)氣能力強(qiáng)的菌株。再根據(jù)耐受性實(shí)驗(yàn)分析,得到4種酵母菌,耐受性強(qiáng)度表現(xiàn)如表2所示。

表2 酵母菌耐受能力對(duì)比分析表Table 2 Comparative analysis of yeast tolerance ability

隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行,酒精度會(huì)不斷升高,不耐酒精的酵母活動(dòng)會(huì)受到抑制,導(dǎo)致發(fā)酵提前終止[19],因此耐酒精能力反應(yīng)了其酒精發(fā)酵的可持續(xù)性[20]。結(jié)果顯示6株酵母菌高酒精耐受性性能優(yōu),6株良,6株中等,菌株Z503和Z509高酒精耐受性低;釀酒前一般會(huì)添加抑菌劑,如SO2,這對(duì)酵母的SO2耐受能力提出了要求[21]。菌株的SO2耐受性,18株表現(xiàn)為優(yōu),菌株Z507和Z509的耐受性差。葡萄醪液是酸性環(huán)境,這需要酵母具有一定耐酸能力,pH值為3.5、3和2.5時(shí),20株酵母菌產(chǎn)生氣泡的量均可充滿杜氏管,均能耐受葡萄酒的酸性環(huán)境,Z507和Z515表現(xiàn)更為突出。葡萄酒釀造時(shí),糖含量一般為20%左右,因此需要篩選耐高糖的酵母。菌株高糖耐受性能,8株高糖性能優(yōu),3株良,7株中等,其中菌株Z509和Z515耐糖性極低。對(duì)于商業(yè)酵母來(lái)說(shuō),4種性能表現(xiàn)均為優(yōu)。

最后綜合4種發(fā)酵耐受性能,篩選出了5株綜合能力較強(qiáng)的菌株,編號(hào)分別為Z308、Z502、Z504、Z511和Z516。

2.4 酵母菌發(fā)酵性能研究

不同酵母菌發(fā)酵葡萄酒還原糖變化見(jiàn)圖2。Z502起酵最慢,Z504發(fā)酵速度最慢,Z511發(fā)酵速度最快。Z502、Z511、Z516、ST、LA-PE、EC1118在108 h時(shí)還原糖含量已降至4 g/L以下,完成了酒精發(fā)酵。而Z308、Z504、SY在發(fā)酵進(jìn)行120 h時(shí)完成了酒精發(fā)酵。由此可見(jiàn),各酵母菌均能正常完成酒精發(fā)酵,Z502、Z511、Z516、ST、LA-PE、EC1118 6種酵母菌的完成酒精發(fā)酵的速度更快。

圖2 發(fā)酵期間不同酵母葡萄酒發(fā)酵還原糖變化曲線Fig.2 Curve of reducing sugar in wine during fermentation

2.5 不同酵母對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)的影響

如表3所示,各組成品酒的總糖均在4 g/L以下,均為干型酒,且發(fā)酵完全。每個(gè)處理組初始糖含量為216 g/L,潛在酒度為12%(體積分?jǐn)?shù)),各組在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中,酒精度變化范圍為11.84%～12.58%。所有處理組可滴定酸含量均高于初始可滴定酸的量,SY組最高,Z511組最低。各組間揮發(fā)酸含量與pH值相差不大,且揮發(fā)酸含量均低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)(1.2 g/L),符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同酵母發(fā)酵葡萄酒的主要理化指標(biāo)Table 3 Main physical-chemical indexes of wines fermented by different yeasts

2.6 不同酵母對(duì)顏色的影響

CIELab顏色模型是用來(lái)描述人眼可見(jiàn)的所有顏色的最完備的色彩模型[22]。明亮度(L*)、紅/綠色彩通道(a*)、黃/藍(lán)色彩通道(b*)是其3個(gè)基本坐標(biāo)。a*值越高代表酒樣更偏向紅色色調(diào);b*值越高代表酒樣更偏向黃色色調(diào);色度Cab值越大,表明酒樣色彩飽和度越高;色調(diào)角Hab通常為0°～90°,其值越大表明葡萄酒顏色越傾向紫紅色,反之則越傾向磚紅色。

測(cè)定不同酵母發(fā)酵葡萄酒酒樣的CIELab顏色參數(shù)L*、a*、b*、Cab和Hab,結(jié)果如圖3所示。9組酒樣整體明亮度均較高,均在95°以上,這與鮮食葡萄本身的特點(diǎn)一致;LA-PE組酒樣a*值最高,b*值最低,Hab最小,表現(xiàn)出更強(qiáng)的紅色色調(diào)。ST組b*值最高,Hab值最大,與其他組相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的黃色色調(diào)。SY組L*值最高,a*值最低,b*值較低,Cab值最低,表明該組酒樣顏色較淺。

a-彩度;b-明度圖3 不同酵母發(fā)酵的葡萄酒彩度與明度分布圖Fig.3 Colorfulness and lightness distributions of wines fermented by different yeasts

2.7 不同酵母對(duì)感官品質(zhì)的影響

根據(jù)感官品評(píng)結(jié)果對(duì)不同酵母所釀葡萄酒感官品質(zhì)做定量描述分析如圖4所示。在外觀方面,LA-PE組酒樣(0.91)得分最高,SY組酒樣(0.82)得分最低,與上文中酒樣顏色分析相符合;Z308、Z516、SY3組整體表現(xiàn)相對(duì)較差,整體評(píng)分低于0.8;Z511在各方面表現(xiàn)居中,在香氣、整體平衡方面均比不上Z504;口感方面表現(xiàn)最好的是Z502組酒樣;Z504組在香氣、口感與整體上均評(píng)分較高。

圖4 不同酵母發(fā)酵的葡萄酒感官定量描述分析Fig.4 Sensory quantitative descriptive analysis of wines fermented by different yeasts

3 討論

葡萄酒的酒精發(fā)酵是多酵母屬、種及菌株共同參與的過(guò)程,發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌的種類組成變化及其釀酒特性對(duì)葡萄酒的感官質(zhì)量有重要貢獻(xiàn)[23]。本研究對(duì)戶太8號(hào)自然發(fā)酵過(guò)程的微生物進(jìn)行了研究,得出了發(fā)酵過(guò)程菌種的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。戶太8號(hào)自然發(fā)酵前期非釀酒酵母占據(jù)主導(dǎo)地位,而隨發(fā)酵進(jìn)行到中后期釀酒酵母成為了優(yōu)勢(shì)菌,這與前人研究一致[16-17]。

酵母菌選擇是葡萄酒釀造的關(guān)鍵技術(shù)之一,通過(guò)對(duì)不同酵母釀造的葡萄酒進(jìn)行CIELab顏色分析得到,LA-PE組酒樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的紅色色調(diào),ST組最強(qiáng)的黃色色調(diào),SY組酒樣的顏色較淺;從感官評(píng)價(jià)上可以發(fā)現(xiàn)Z502在口感上表現(xiàn)最好,Z504在香氣上表現(xiàn)最佳。由此可見(jiàn)采用相同葡萄原料但不同酵母發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒,在顏色、感官質(zhì)量等方面存在較大差異。

一味的使用商業(yè)活性干酵母會(huì)導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)同質(zhì)化,不利于葡萄酒產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展,因此需要對(duì)葡萄酒微生物進(jìn)行研究推進(jìn)葡萄酒差異化,突出其典型性。近年來(lái),不少研究篩選了具有本土特色的酵母菌株,并取得了可觀的成果。溫雅驕[24]從5個(gè)地區(qū)不同釀酒葡萄種植基地采集樣品,分離純化得到97株酵母菌株,對(duì)其生長(zhǎng)速率、耐受性和生長(zhǎng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià),以及通過(guò)小容器釀酒對(duì)比試驗(yàn),篩選出5株優(yōu)良釀酒酵母菌株。楊詩(shī)妮等[17]從甘肅祁連產(chǎn)區(qū)篩選出3株本土戴爾有孢圓酵母,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)高乙醇、高糖濃度等逆境具有良好的耐受性,生長(zhǎng)能力較好,具有釀造優(yōu)良葡萄酒的潛力。張文靜等[25]優(yōu)選本土畢赤克魯維酵母(PichiakluyveriHS-2-1)在混菌發(fā)酵過(guò)程中具有良好的定殖能力。這些有關(guān)葡萄酒釀造的微生物研究多集中于釀酒葡萄,從鮮食葡萄篩選酵母的研究較少,分離所得的酵母數(shù)量少。為此本研究從鮮食葡萄中分離110株酵母菌株,對(duì)其進(jìn)行耐受性篩選,并與商業(yè)酵母對(duì)比研究獲得了2株適合鮮食葡萄釀酒的酵母菌株,其各項(xiàng)性能指標(biāo)接近商品化釀酒酵母,可以用于陜西地區(qū)鮮食葡萄酒釀造的商品化菌株。

4 結(jié)論

本研究從戶太8號(hào)鮮食葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中篩選出了110株酵母,通過(guò)杜氏管發(fā)酵和耐受性實(shí)驗(yàn)篩選出了5株耐受性能較好的菌株,經(jīng)過(guò)鑒定均為釀酒酵母。經(jīng)過(guò)CIELab顏色分析發(fā)現(xiàn)所有鮮食葡萄酒的明亮度高,LA-PE組酒樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的紅色色調(diào),ST組最強(qiáng)的黃色色調(diào),SY組酒樣的顏色較淺。將這些葡萄酒經(jīng)過(guò)感官評(píng)價(jià)后得到了口感較好和綜合性評(píng)價(jià)高的兩株酵母,編號(hào)為Z502和Z504,Z502在口感上表現(xiàn)最好,Z504在香氣上表現(xiàn)最佳。上述的商業(yè)酵母和從葡萄自身篩選的酵母均能用于鮮食葡萄釀酒,且各有自身的特點(diǎn)。從葡萄自身篩選的酵母可以突出品種和產(chǎn)地特色,可以避免葡萄酒品質(zhì)低、同質(zhì)化嚴(yán)重問(wèn)題,從葡萄自身篩選的酵母無(wú)疑是鮮食葡萄酒微生物研究的一個(gè)重要趨勢(shì)。