蔣佳蕓,趙崇杰,李雪寧,何紅鵬,李軍訓(xùn),張曉元,陳勉,劉飛,王楠*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457) 2(山東泰山生力源集團(tuán)股份有限公司,山東 泰安,271000)3(山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟(jì)南,250101)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)能夠直接發(fā)酵降解碳水化合物產(chǎn)生乳酸,具有降糖降脂、抗炎、調(diào)節(jié)自身免疫、促進(jìn)機(jī)體發(fā)育等多種生物活性,是一種有益人體健康的益生菌[1-2]。乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是乳酸菌在正常生長(zhǎng)、代謝活動(dòng)過(guò)程中被分泌到宿主細(xì)胞壁膜外的次級(jí)代謝產(chǎn)物,可以大致分為莢膜多糖和黏液多糖。乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠改善腸道屏障[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4],具有抗高血壓[5]、降膽固醇[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]等多種生物活性。EPS可以廣泛應(yīng)用于化工和醫(yī)藥領(lǐng)域,也可以作為食物級(jí)多糖的一級(jí)來(lái)源。

已有多項(xiàng)研究證實(shí)乳酸菌的胞外多糖可以起到天然的強(qiáng)效抗氧化劑作用,參與自由基的清除,同時(shí)其安全無(wú)毒,因此可以作為化學(xué)合成的抗氧化劑的良好代替品。瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)KLDS1.8701體內(nèi)外均證實(shí)具有高抗氧化能力,體外對(duì)DPPH自由基、超氧自由基、羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力,體內(nèi)可以抑制D-gal誘導(dǎo)的小鼠肝臟氧化應(yīng)激和損傷[9]。DI等[8]評(píng)價(jià)了9株乳酸菌胞外多糖的抗腫瘤作用,發(fā)現(xiàn)其中4株干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacilluscasei)的EPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖都具有較強(qiáng)的抑制作用。瑞士乳桿菌MB2-1的胞外多糖LHEPS-1可以以活性氧(reactive oxygen species, ROS)依賴性途徑和線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡[10]。從母乳中分離的鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)的EPS對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗菌活性[11]。

課題組前期從醬香型白酒酒醅自行篩選分離得到一株乳酸片球菌PediococcusacidilacticiHAO2018[12],發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗腫瘤活性,但其耐酸、耐膽鹽及耐藥性等特性尚不清楚,而其胞外多糖是否具備生物學(xué)功能也尚未深入研究。因此,本研究中主要探究了該菌株的耐酸、耐膽鹽及耐藥性等特性,進(jìn)一步經(jīng)過(guò)乙醇沉淀及三氯乙酸去除蛋白提取胞外多糖,對(duì)該菌株EPS的多種生物學(xué)活性包括抗氧化活性、抗菌及抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),以期為益生菌相關(guān)藥食資源開(kāi)發(fā)和利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞

乳酸片球菌HAO2018,本實(shí)驗(yàn)室從醬香型白酒酒醅中篩選分離得到;結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29,中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑

MRS培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT)、Biomerieux藥敏檢測(cè)試紙,北京索萊寶科技有限公司;無(wú)水乙醇,天津市立元化工有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),上海生工生物工程有限公司;葡萄糖、水楊酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、苯酚及濃硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;SPX-150型生化培養(yǎng)箱,湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī),日本HITACHI公司;多功能酶標(biāo)儀,北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

將活化后的乳酸片球菌HAO2018取1 mL接種到MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)3～4 d。

1.2.2 菌株耐酸能力測(cè)定

將乳酸片球菌HAO2018以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于pH值為2.0、3.0、4.0的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)24 h[13];將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液置于96孔板中,加入20 μL的MTT(5 mg/mL)厭氧培養(yǎng)4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)量各組OD490nm值,將pH值為7.0的MRS作為陰性對(duì)照,測(cè)定存活率。

1.2.3 菌株耐膽鹽性質(zhì)

將乳酸片球菌HAO2018以3%(體積分?jǐn)?shù))接種于裝有不同膽鹽質(zhì)量濃度的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)過(guò)夜[13];參考1.2.2節(jié)的方法用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處各孔的吸光值,測(cè)定存活率。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法[14],使用藥敏試劑盒Biomerieux檢測(cè)試紙檢測(cè)菌株耐藥性;取100 μL菌液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,待培養(yǎng)基表面無(wú)明顯水滴,用鑷子輕輕夾取藥敏紙片并使紙片邊緣均勻平整地貼在固體平板表面上,將各組平板倒置(37 ℃)培養(yǎng)24 h后取出測(cè)定其抑菌圈直徑。

1.2.5 胞外多糖提取及產(chǎn)量測(cè)定

將乳酸片球菌HAO2018以3%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃)后,將菌液離心20 min(4 ℃,8 000 r/min),收集上清液;向上清液中加入質(zhì)量濃度為800 g/L三氯乙酸溶液至終質(zhì)量濃度為4 g/L,置于4 ℃過(guò)夜,離心20 min(4 ℃,8 000 r/min)去除蛋白,收集上清液;向上清液中以V(上清液)∶V(乙醇)的比例加入無(wú)水乙醇,置于4 ℃過(guò)夜,離心20 min(4 ℃,8 000 r/min),收集沉淀并用少量蒸餾水溶解,向透析袋中緩慢加入溶解液,將透析袋置于4 ℃透析48 h,最后進(jìn)行真空冷凍干燥,獲得粉末狀粗多糖。用苯酚-硫酸法及Bradford試劑盒測(cè)定多糖中總糖及蛋白質(zhì)的含量。

1.3 生物活性的研究

1.3.1 抗氧化活性

1.3.1.1 對(duì)羥自由基的清除率

參考水楊酸法測(cè)定[15],配制不同濃度的胞外多糖樣液,分別加入濃度為9 mmol/L的FeSO450 μL,搖勻后加入9 mmol/L的H2O2溶液50 μL,充分混勻后置于室溫下反應(yīng)10 min;再加入9 mmol/L的乙醇-水楊酸溶液50 μL(AX),混勻靜置;重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),將水楊酸換成蒸餾水(A0),測(cè)量其510 nm處的吸光值;2 mg/mL維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照(AX0),羥自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.1.2 對(duì)DPPH自由基的清除率

配制不同濃度的胞外多糖樣液,分別向試管中加入4 mL樣液,再加入4 mL 0.15 mmol的DPPH-乙醇溶液(A1)[15],混勻靜置30 min(避光);將樣液與相同體積的無(wú)水乙醇混合(A0),測(cè)量各組在517 nm處的吸光值;2 mg/mL維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照(A2),DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

1.3.1.3 還原能力

參考鐵氰化鉀還原法[16],配制不同濃度的胞外多糖樣液,分別加入50 μL PBS,搖勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀50 μL,反應(yīng)10 min,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸50 μL,低速離心10 min(4 ℃,3 000 r/min),取上清液,在上清液中加入100 μL蒸餾水和20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氯化鐵,反應(yīng)30 min,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),測(cè)其在700 nm處的吸光值(A);2 mg/mL維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照(A0),還原能力的計(jì)算如公式(3)所示:

還原能力/%=(A-A0)×100

(3)

1.3.2 抑菌活性

參考濾紙片擴(kuò)散法[17]探究HAO2018胞外多糖對(duì)致病菌的抑菌效果,活化致病菌,并用生理鹽水稀釋制備菌懸液,均勻地涂布在LB培養(yǎng)基上,分別取無(wú)菌水、1 mg/mL青霉素溶液、0.5 mg/mL和1 mg/mL胞外多糖溶液各10 μL滴加在濾紙片上,倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),以無(wú)菌水作陰性對(duì)照,以青霉素為陽(yáng)性對(duì)照組,16 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.3 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

將HT-29細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/mL接種到96孔板中,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h(37 ℃,5% CO2)后,用PBS清洗2次,用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基溶解胞外多糖凍干粉,配制成不同濃度,過(guò)膜除菌,加入細(xì)胞中[18]。分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT培養(yǎng)4 h,再加入100 μL DMSO避光振蕩10 min,用酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)量吸光值,計(jì)算EPS對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制率;其計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:A1為加多糖的細(xì)胞組,A2為不加多糖的細(xì)胞組,A0為無(wú)細(xì)胞組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)均重復(fù)3次或3次以上,采用one-way ANOVA方法進(jìn)行數(shù)值分析,用IBM SPSS Statistics 27對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌HAO2018菌株耐酸及耐膽鹽能力

人體胃液pH值一般為1.5～4.5左右,益生菌耐受胃酸才能在體內(nèi)發(fā)揮作用。人體腸道中膽汁鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%波動(dòng),膽鹽會(huì)影響菌體外膜的通透性,導(dǎo)致菌體DNA損傷,從而影響菌株的存活率。本研究將乳酸片球菌HAO2018分別在pH值為2.0、3.0、4.0和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%條件下培養(yǎng)4 h,檢測(cè)菌株存活情況,結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 乳酸片球菌HAO2018的耐酸性Fig.1 Acid tolerance of P.acidilactici HAO2018

圖2 乳酸片球菌HAO2018的膽鹽耐受性Fig.2 Bile salt tolerance of P.acidilactici HAO2018

由圖1可知,在pH=2、pH=3和pH=4條件下培養(yǎng)4 h后存活率分別為(21.15±1.37)%、(30.34±2.83)%和(58.33±2.23)%。由圖2可知,在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%的條件下培養(yǎng)4 h后存活率分別為(82.07±3.06)%、(48.00±1.96)%和(39.42±1.66)%。因此,乳酸片球菌HAO2018有較強(qiáng)的酸耐受能力和膽鹽耐受能力。

2.2 HAO2018菌株藥敏試驗(yàn)

隨著抗生素的廣泛使用,乳酸菌的耐藥性問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重。乳酸片球菌HAO2018的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,乳酸片球菌HAO2018對(duì)卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢他啶、紅霉素、亞胺培南敏感;對(duì)環(huán)丙沙星中度敏感;對(duì)萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明不敏感。

表1 乳酸片球菌HAO2018的藥物敏感性Table 1 Antibiotic susceptibility of P.acidilactici HAO2018

2.3 胞外多糖的抗氧化活性

乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的產(chǎn)量為5.26 mg/mL,多糖純度81.76%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同),蛋白含量4.39%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

2.3.1 羥自由基的清除率

羥自由基不能直接被特異的酶促反應(yīng)降解,易對(duì)機(jī)體造成危害,因此羥自由基的有效去除可能對(duì)生物體預(yù)防疾病具有一定意義。乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的羥自由基清除率見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的羥自由基清除率Fig.3 The hydroxyl radical scavenging rate of EPS of P.acidilactici HAO2018注:圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

由圖3可知,HAO2018的胞外多糖對(duì)羥自由基有一定的清除能力,其清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí),其對(duì)羥自由基的清除率為(23.35±2.31)%(P<0.05,下同),當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10.0 mg/mL時(shí),其清除率為(83.43±3.87)%。而作為陽(yáng)性對(duì)照的維生素C在2.0 mg/mL時(shí)清除率為(97.30±0.46)%。李堯等[19]對(duì)乳酸片球菌C6菌株的EPS進(jìn)行了分離純化,發(fā)現(xiàn)其胞外多糖主要包含3個(gè)組分,其中分子質(zhì)量為2.53×104Da的EPS-3抗氧化活性最強(qiáng),在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基的清除率為65.50%。在本研究中,乳酸片球菌HAO2018的胞外多糖在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)清除率為80.24%。這些結(jié)果說(shuō)明乳酸片球菌HAO2018在羥自由基清除方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3.2 DPPH自由基的清除率

DPPH自由基可與自由基清除劑(如EPS、多酚和維生素E等)反應(yīng),其溶液吸光度值的變化可用于評(píng)估自由基清除劑的抗氧化能力。乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的DPPH自由基清除率見(jiàn)圖4。

由圖4可知,HAO2018的胞外多糖能夠清除DPPH自由基,高質(zhì)量濃度的EPS(2.0～10.0 mg/mL)對(duì)DPPH自由基的清除效果顯著,基本接近100%;當(dāng)EPS質(zhì)量濃度逐漸由0.2 mg/mL升至0.6 mg/mL時(shí),EPS對(duì)DPPH自由基的清除能力變化較快,且隨濃度的升高而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),當(dāng)EPS質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH的清除率為(68.46±4.16)%。而維生素C在2.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH的清除率為(97.80±0.46)%。一株從韓國(guó)發(fā)酵米酒中分離的乳酸片球菌M76的EPS在1 mg/mL的質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基具有45.8%清除率[20]。一株乳酸片球菌NCDC252在10 mg/mL的質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到54.9%[21]。相比于這些乳酸片球菌的胞外多糖的抗氧化活性,低濃度的乳酸片球菌HAO2018已達(dá)到較高的DPPH清除率,因此HAO2018在DPPH的清除率上具有一定優(yōu)勢(shì),抗氧化效果更佳。

2.3.3 還原能力

天然活性物質(zhì)的鐵還原能力可作為其電子給體活性的重要指標(biāo),常用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力。乳酸片球菌HAO2018胞外多糖的還原能力見(jiàn)圖5。

由圖5可知,HAO2018的胞外多糖有一定的還原能力,當(dāng)EPS的質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL,其還原能力分別為(14.03±0.15)%、(25.60±0.06)%、(36.93±0.15)%、(45.50±0.12)%、(54.10±0.15)%。而2.0 mg/mL維生素C的還原能力為(97.80±0.46)%。與我們的研究結(jié)果相似,發(fā)酵乳桿菌CECT5716[22]和雙歧桿菌BB12[23]的胞外多糖均被證實(shí)具有較好的抗氧化活性,具有還原Fe3+的能力。

2.4 抑菌活性

滴加無(wú)菌水的紙片周圍無(wú)抑菌圈出現(xiàn),表明水對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。乳酸片球菌HAO2018胞外多糖對(duì)7種食源性致病菌的抑菌程度不同,抑菌效果見(jiàn)表2。

由表2可知,不同濃度的HAO2018的EPS抑菌能力有差別,低濃度的EPS可能無(wú)明顯抑菌效果。隨EPS濃度升高,其抑菌能力逐漸增強(qiáng)。HAO2018的EPS對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和阪崎克羅諾桿菌展示出一定的抑制作用,其中高劑量的EPS(10 μg)對(duì)志賀氏菌的抑制效果高于相同劑量的青霉素,對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑制效果也與青霉素相當(dāng)。HAO2018的EPS對(duì)大腸桿菌的抑制效果較差,對(duì)單增李斯特菌和銅綠假單胞菌無(wú)抑制作用。丁濤等[24]研究發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌BacilluspumilusXQ的粗胞外多糖對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有一定的抑制作用。RANI等[25]證實(shí)加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)FR4的異源胞外多糖對(duì)單增李斯特菌MTCC657具有較好的抑制效果。

2.5 抗腫瘤活性

乳酸片球菌HAO2018胞外多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)圖6。

a-EPS處理HT-29細(xì)胞48 h;b-EPS處理HT-29細(xì)胞72 h圖6 乳酸片球菌HAO2018胞外多糖對(duì)HT-29細(xì)胞 增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of EPS of P.acidilactici HAO2018 on the proliferation of HT-29 cells

由圖6可知,當(dāng)0.5～2 mg/mL的EPS作用于HT-29細(xì)胞48 h時(shí),隨著EPS濃度的升高,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng);當(dāng)EPS質(zhì)量濃度達(dá)2.0 mg/mL時(shí),抑制率達(dá)到(80.46±5.86)%(P<0.05)。當(dāng)處理72 h后,低濃度的EPS(0.5 mg/mL)也表現(xiàn)出較高的抑制率(51.23±1.86)%,當(dāng)EPS質(zhì)量濃度達(dá)2.0 mg/mL時(shí),抑制率達(dá)到(96.05±1.06)%。SUN等[26]分析了4株植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarun)的胞外粗多糖對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用,發(fā)現(xiàn)其中植物乳植桿菌12的抗腫瘤效果最好,在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL處理48 h時(shí)抑制率最大,達(dá)到(31.3±0.46)%。SONG等[27]證實(shí)副干酪乳酪桿菌副干酪亞種(Lacticaseibacillusparacaseisubsp.paracasei)M5L胞外多糖在1 mg/mL作用48 h時(shí)對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制效果最好,達(dá)到80%左右,但72 h時(shí)抑制率下降到40%左右。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳酸片球菌HAO2018胞外多糖具有較高的抗腫瘤活性。

3 結(jié)論

綜上所述,乳酸片球菌HAO2018菌株具有良好的酸耐受能力和膽鹽耐受能力,且對(duì)卡那霉素等大部分抗生素敏感。其胞外多糖具有強(qiáng)的抗氧化能力、對(duì)食源性致病菌志賀氏菌和阪崎克羅諾桿菌具有較好的抑制效果,對(duì)腫瘤細(xì)胞HT-29具有較強(qiáng)的抑制作用,為進(jìn)一步揭示乳酸片球菌的抗氧化和抗腫瘤等的功能及作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。在本研究中尚未對(duì)乳酸片球菌HAO2018的胞外多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,因此在后續(xù)的工作中將進(jìn)一步對(duì)多糖進(jìn)行分離純化并解析多糖的結(jié)構(gòu),分析其構(gòu)效關(guān)系?？傊?這些研究可為益生菌及其胞外多糖在相關(guān)功能食品、醫(yī)藥產(chǎn)品和化學(xué)工業(yè)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。