吳玉臣,朱先鵬,李有志,侯云峰,聶 婧,尚小雷,鄧旭明,高 豐,呂強(qiáng)華,6*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院,河南 鄭州 450000;3.吉林省柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì),吉林 柳河135300;4.山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心,山東 濟(jì)南 250022;5.山東金鑄基藥業(yè)有限公司,山東 濟(jì)南 271100;6.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟(jì)南 250100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)是1892年由WELCH等[1]在約翰霍普金斯醫(yī)院的一起致命性主動(dòng)脈瘤病例中首次分離得到的,也被稱為魏氏梭菌。它是一種厭氧革蘭陽性、產(chǎn)芽孢、大型桿狀菌,廣泛分布于人類和動(dòng)物的胃腸道、食品和自然環(huán)境中[2]。目前,已知該菌產(chǎn)生的外毒素有12種(α、β、ε、ι、γ、δ、η、θ、κ、λ、μ和ν),根據(jù)外毒素不同可將其分為A～E 5種血清型[3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于典型的條件致病菌,既可導(dǎo)致地區(qū)性流行,又可引起散發(fā)性病例,每年都會(huì)造成大量人或動(dòng)物感染和死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染可引起人類和動(dòng)物的多種疾病,如氣性壞疽(人和動(dòng)物)、壞死性腸炎(人和動(dòng)物)、腸毒素血癥(動(dòng)物)、人類食物中毒、抗生素相關(guān)性腹瀉和散發(fā)性非食源性疾病等[4]。在世界范圍內(nèi),產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起食源性疾病暴發(fā)的重要病原之一,食源性傳播是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要傳播途徑,在英國和法國食源性疾病常見病因中位列第三,是美國食源性疾病的第二大常見致病菌[5]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起雞的壞死性腸炎,多見于2～6周齡的肉雞,發(fā)病率和病死率都很高,病死率甚至可達(dá)50%,嚴(yán)重危害全球養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[6-7]?？咕幍牟缓侠硎褂煤蜑E用,引發(fā)致病菌對(duì)多種抗菌藥耐藥[8-9],導(dǎo)致臨床療效下降甚至治療失敗。我國農(nóng)業(yè)部于2017和2018年分別制定了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃(2017—2020年)》[10]和《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案(2018—2021年)》[11],禁止在飼料端使用抗菌促生長劑,雞壞死性腸炎的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[12]。隨著“減抗和限抗”政策的實(shí)施必然對(duì)臨床雞壞死性腸炎為代表的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染造成巨大困擾,尋求新型抗菌藥物或抗菌策略對(duì)抗耐藥菌的感染迫在眉睫。研究表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌在宿主腸道黏附過程主要依賴于菌體表面的Ⅳ型菌毛系統(tǒng)(type Ⅳ pili,TFP)[13],通過依賴于TFP促進(jìn)細(xì)菌在宿主腸道內(nèi)的定植、存活和復(fù)制增殖[14]。TFP在多種血清型產(chǎn)氣莢膜梭菌中保守存在,相比常規(guī)抗生素直接殺菌或抑菌的作用機(jī)制,以此為靶標(biāo)的藥物研發(fā)成為一種理想策略。

在前期研究中,通過以TFP作為藥物篩選靶標(biāo),建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP抑制劑的篩選平臺(tái),在中藥來源的天然化合物中進(jìn)行大量篩選,最終獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。結(jié)合危害養(yǎng)雞業(yè)的產(chǎn)氣莢膜梭菌現(xiàn)狀,開發(fā)一種安全有效、療效確切、機(jī)制明確和無藥殘的新型中獸藥制劑。查閱大量文獻(xiàn)可知,側(cè)柏葉中穗花衫雙黃酮含量較高,可作為中藥制劑的候選中藥材。側(cè)柏葉,為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉,一般采收于夏、秋兩季。側(cè)柏葉顆粒劑作為一種新型中獸藥制劑,目前未見抗產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的報(bào)道。接下來,擬在前期基礎(chǔ)之上研究側(cè)柏葉顆粒劑對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用及機(jī)制,為臨床產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的防控提供候選“減抗”中獸藥制劑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞及主要試劑側(cè)柏葉顆粒劑(批號(hào):202012001),由保定冀中生物科技有限公司中試生產(chǎn);產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124菌株,購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);BHI培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣包、血紅素、維生素K1,購自青島海博生物技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫試劑,購自Sigma;結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶,購自Gibco;Triton X-100,購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

A.側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌在半固體培養(yǎng)基上滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的影響;B.滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)率統(tǒng)計(jì)。NS.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同

1.2 主要儀器超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IF)、恒溫培養(yǎng)箱(HPS250)和生物安全柜(HDL2600),購自哈爾濱東聯(lián)有限公司;恒溫振蕩器(THZ-82),購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;電子天平(BSA124S/224S-CW),購自德國賽多利斯;全自動(dòng)樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-24),購自上海凈信生物科技有限公司;免疫熒光顯微鏡(IX-83),購自日本奧林巴斯;電泳儀(PowerPacBasic)、小型垂直電泳槽(Mini Gel Tank)、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(170-3940)和熒光定量PCR儀(CFX96),購自美國Bio-Rad;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 4200),購自上海天能科技有限公司;透射電鏡(HT8700),購自日本日立。

1.3 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

1.3.1滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養(yǎng)基,置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。取1 mL過夜培養(yǎng)菌液,10 000 r/min離心5 min,重懸于100 μL BHI培養(yǎng)基中,將10 μL菌懸液滴至0.7% BHI瓊脂平板中央,分別設(shè)置為陽性對(duì)照組(不含側(cè)柏葉顆粒劑)、側(cè)柏葉顆粒劑組(0.7% BHI瓊脂平板中含側(cè)柏葉顆粒,質(zhì)量濃度為1.3 g/L)和DMSO對(duì)照組(0.7% BHI瓊脂平板中含等體積的DMSO溶劑),置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)72 h后,測(cè)定滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù),并采集圖像。

1.3.2生物被膜試驗(yàn) 取1 mL過夜培養(yǎng)菌液6 000 r/min離心10 min,PBS洗滌3次,重懸于TSB培養(yǎng)基中,調(diào)至D600 nm=0.1,加入24孔板內(nèi),每孔400 μL。分別加入不同體積的側(cè)柏葉顆粒貯存液,使其終質(zhì)量濃度分別為0,0.65和1.30 g/L,設(shè)陽性對(duì)照組(不含側(cè)柏葉顆粒)和陰性對(duì)照組(不含菌液和側(cè)柏葉顆粒),置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中30℃靜置培養(yǎng)120 h。棄掉培養(yǎng)過后24孔板內(nèi)上清,PBS洗滌3次,置于37℃電熱恒溫干燥箱烘干1 h,加入400 μL 結(jié)晶紫(0.1%),室溫染色1 h,PBS洗滌3次,加入33%乙酸400 μL溶解混勻后取100 μL 置于新96孔板中,測(cè)定D570 nm值,根據(jù)下列公式計(jì)算生物被膜形成率。生物被膜形成率=(D570 nm 樣品組-D570 nm 陰性組)/(D570 nm 陽性組-D570 nm 陰性組)×100%,以陽性對(duì)照組為100%計(jì)算。

1.4 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞的影響

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。

1.4.2菌懸液的制備 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124接種至BHI液體培養(yǎng)基中,置于2.5 L厭氧培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。次日,用BHI調(diào)至D600 nm=0.4備用。

1.4.3LDH法檢測(cè)側(cè)柏葉顆粒對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性 將Caco-2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,密度為2×104cells /孔,置于37℃和 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。棄掉培養(yǎng)基,加入1640培養(yǎng)基,加藥,設(shè)陽性對(duì)照組(0.2% TritonX-100)、陰性對(duì)照組(僅含1640培養(yǎng)基)、藥物組(側(cè)柏葉顆粒終質(zhì)量濃度分別為0,0.65,1.30,2.60和5.20 g/L),每組3個(gè)重復(fù),置于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。1 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液至新96孔板,向各孔內(nèi)加入LDH工作液100 μL,避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔D492 nm值,計(jì)算樣品的LDH釋放率。LDH釋放率=(D492 nm 處理組-D492 nm 陰性組)/(D492 nm 陽性組-D492 nm 陰性組)×100%,以陽性對(duì)照組LDH釋放率為100%計(jì)算。

1.4.4側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞的影響 Caco-2細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,密度為3×105cells/mL,置于37℃和 5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);每孔加入10 μL菌懸液,分為陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和藥物組。1 000 r/min離心10 min后37℃靜置培養(yǎng)2 h;用滅菌PBS洗去未黏附細(xì)菌,每孔洗3次,加入1 mL高壓滅菌的蒸餾水,震蕩5 min充分釋放和裂解細(xì)胞,倍比稀釋涂布于BHI平板,37℃厭氧過夜培養(yǎng),計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU)。黏附率=處理組CFU/陽性對(duì)照組CFU×100%。

1.5 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄和菌毛形態(tài)的影響

1.5.1qRT-PCR檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124置于BHI培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),第2天20倍稀釋擴(kuò)培,加入終質(zhì)量濃度為0和1.30 g/L的側(cè)柏葉顆粒,37℃厭氧培養(yǎng)4 h。使用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,配制RT-PCR反應(yīng)體系見表1,使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè),qRT-PCR反應(yīng)條件見表2。引物由上海生工生物科技有限公司合成,序列信息見表3。試驗(yàn)完畢,按照2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系

表2 qRT-PCR反應(yīng)條件

表3 引物序列信息

1.5.2側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響 使用BHI培養(yǎng)基將產(chǎn)氣莢膜梭菌過夜培養(yǎng)物的D600 nm調(diào)整至0.1,取6 mL調(diào)后的菌液,分裝至2個(gè)試管,每管2 mL,向其中分別加入側(cè)柏葉顆粒貯存液,使其終質(zhì)量濃度為1.3 g/L,同時(shí)等量DMSO的對(duì)照組,37℃靜置厭氧培養(yǎng)8 h。在4℃和10 000 r/min條件下離心10 min,棄上清,收集菌體,PBS洗滌3次,棄上清。使用負(fù)染色法處理樣品,在透射電鏡(TEM)下觀察產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體TFP的形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP表型功能的影響

2.1.1側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng) 如圖1所示,經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)72 h后,產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124在0.7% BHI瓊脂平板呈現(xiàn)滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)。相比于陽性對(duì)照組,側(cè)柏葉顆粒處理組滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)半徑明顯減小,差異顯著;DMSO組滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)與陽性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明,側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)。

2.1.2側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜的形成 如圖2所示,與陽性對(duì)照組相比,在側(cè)柏葉顆粒的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.65～2.60 g/L),產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜的形成率呈劑量性降低,表明側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜形成。

圖2 側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜形成

2.2 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞的影響

2.2.1側(cè)柏葉顆粒對(duì)Caco-2細(xì)胞無明顯檢測(cè)毒性 如圖3所示,與陰性對(duì)照組相比,不同質(zhì)量濃度的側(cè)柏葉顆粒處理Caco-2細(xì)胞后,培養(yǎng)體系中LDH釋放率差異并不顯著,表明在受試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0.65～5.20 g/L),側(cè)柏葉顆粒對(duì)Caco-2細(xì)胞無可檢測(cè)細(xì)胞毒性。

圖3 側(cè)柏葉顆粒對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.2.2側(cè)柏葉顆粒劑抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞 如圖4所示,陽性對(duì)照組黏附率為(71.05±3.70)%,不同質(zhì)量濃度側(cè)柏葉顆粒組的黏附率分別為(51.15±2.23)%和(39.73±2.03)%,相比陽性對(duì)照組黏附率顯著降低。結(jié)果表明,側(cè)柏葉顆粒顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞。

圖4 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞的抑制作用

2.3 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄和菌毛形態(tài)的影響

2.3.1側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP基因轉(zhuǎn)錄的影響 由圖5可知,質(zhì)量濃度為1.3 g/L的側(cè)柏葉顆粒顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP相關(guān)基因virR、virS、pilA、pilD、pilT、pilC和pilM的mRNA轉(zhuǎn)錄。

圖5 側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.3.2側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響 由圖6可知,在10 000倍視野中,陽性對(duì)照組菌體邊緣可見纖維狀菌毛存在,菌體周身呈絨毛狀;經(jīng)側(cè)柏葉顆粒(1.3 g/L)處理后,菌體邊緣幾乎無纖維狀菌毛存在,菌體周身光滑。結(jié)果表明側(cè)柏葉顆?？梢砸种飘a(chǎn)氣莢膜梭菌TFP菌毛的形態(tài),導(dǎo)致TFP結(jié)構(gòu)缺失。

注:左側(cè)圖(×5 000);右側(cè)圖(×10 000)

3 討論

“減抗和限抗”的政策法令實(shí)施之前,畜牧生產(chǎn)中主要通過在飼料中添加抗生素來預(yù)防和控制病原微生物的感染,同時(shí)作為促生長劑,提升動(dòng)物的生產(chǎn)性能,如桿菌肽和維吉尼亞霉素的應(yīng)用等。隨著飼料端禁抗措施的實(shí)施,無疑給抗生素的研發(fā)、使用和銷售及臨床畜禽細(xì)菌性疾病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。產(chǎn)氣莢膜梭菌導(dǎo)致的雞壞死性腸炎持續(xù)困擾養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,抗生素的研發(fā)周期漫長和投資逐年增加的特點(diǎn),導(dǎo)致新型抗生素的研發(fā)進(jìn)入困境。開發(fā)新型治療策略或研制抗生素替代藥物進(jìn)行畜禽疾病防控成為公認(rèn)的思路。相比于傳統(tǒng)抗生素直接抑菌/抗菌的作用機(jī)制,通過抑制細(xì)菌生命過程非必需成分(如溶血素、菌毛、鞭毛和產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP)為靶標(biāo)的抗毒力藥物研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。近年來,已有許多以細(xì)菌毒力因子為靶標(biāo)的天然化合物和小分子抑制劑陸續(xù)被報(bào)道出來[15-17],也為新型藥物研發(fā)提供了科學(xué)范例。我國中藥資源和應(yīng)用歷史悠久,尤其清熱解毒或補(bǔ)中益氣等藥性的中藥及方劑為抗感染藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。中藥具備來源廣、活性豐富、成本低、無藥物殘留和綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì),為抗細(xì)菌感染新藥研發(fā)提供了良好的資源寶庫。隨著如今人們生活水平的提高和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng),對(duì)綠色健康養(yǎng)殖和動(dòng)物性產(chǎn)品的安全性要求提出了新的要求,開發(fā)新型獸用中藥制劑成為抗生素替代藥物研發(fā)的突破點(diǎn)。本研究正是基于前期研究基礎(chǔ),通過建立靶向產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP的小分子抑制劑篩選平臺(tái),在中藥來源的天然化合物中進(jìn)行篩選,獲得了活性良好的穗花衫雙黃酮。通過選擇成藥性良好的側(cè)柏葉作為理想中藥材,經(jīng)過提取工藝、處方工藝和制劑工藝研究制備出適合規(guī)?；B(yǎng)雞場群體給藥的側(cè)柏葉顆粒制劑,旨在研發(fā)含量較高、活性良好和含量穩(wěn)定的防治雞壞死性腸炎的新型獸用制劑。

為了闡明側(cè)柏葉顆粒劑的藥理活性和作用機(jī)制,在前期研究基礎(chǔ)之上進(jìn)行了后續(xù)研究。首先,通過滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)和生物被膜測(cè)試2種表型驗(yàn)證側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用;隨后,通過細(xì)胞黏附試驗(yàn)測(cè)定側(cè)柏葉顆粒抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌黏附至Caco-2細(xì)胞的作用;最后,借助qRT-PCR測(cè)定側(cè)柏葉顆粒對(duì)TFP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)合透射電子顯微鏡(TEM)觀察側(cè)柏葉顆粒處理對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP形態(tài)的影響,通過以上研究確證了側(cè)柏葉顆粒對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP功能的抑制作用,闡明抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌TFP介導(dǎo)功能的作用機(jī)制。綜上所述,該研究為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的雞壞死性腸炎防治提供了新型中獸藥制劑,也為側(cè)柏葉顆粒劑的臨床開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。