李麗蘊(yùn),梁東閣,于海深,郭江濤,曾 磊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046)

在病毒感染過程中,宿主細(xì)胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),并引發(fā)下游抗病毒天然免疫反應(yīng)的級聯(lián)反應(yīng)[1-3]。環(huán)GMP-AMP(cyclic GMP-AMP,cGAMP)合成酶(cGAS)是一種細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器,在所有哺乳動物中cGAS感知病原DNA的入侵,并刺激炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬和凋亡。cGAS是通過檢測處于錯(cuò)誤位置的DNA來發(fā)揮作用。在正常條件下,DNA被緊密得包裝在細(xì)胞核中并受到保護(hù)。當(dāng)DNA片段逃離細(xì)胞核并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中時(shí),這通常表明存在著一些不祥征兆,比如來自細(xì)胞內(nèi)的損傷或來自侵入細(xì)胞內(nèi)的病毒或細(xì)菌的外來DNA。cGAS蛋白通過識別這種處于錯(cuò)誤位置的DNA而發(fā)揮作用。在正常情形下,它在細(xì)胞中處于休眠狀態(tài)。但是cGAS一旦檢測到DNA存在于細(xì)胞核外面時(shí)就會開始起作用。當(dāng)cGAS與胞質(zhì)中的雙鏈DNA結(jié)合時(shí),cGAS在GTP和ATP作用下產(chǎn)生2′,3′-環(huán)GMP-AMP(2′-3′-cyclic GMP-AMP,2′,3′-cGAMP)[4],cGA-MP隨后激活干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)、TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)和干擾素反應(yīng)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)或NF-κB信號通路,促進(jìn)干擾素-β(interferon-β,IFN-β)、白介素-18(interleukin 18,IL-18)和白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生[5-8]。在這種信號級聯(lián)反應(yīng)結(jié)束時(shí),細(xì)胞或者得到修復(fù),或者因損壞到無法修復(fù)的地步導(dǎo)致自我破壞。

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型(suid alphaherpesvirus 1,SuHV-1)或Aujeszky病病毒(Aujeszky's disease virus,ADV),是皰疹病毒科、甲皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的一員。偽狂犬病 (pseudorabies,PR)是由PRV引起的多種動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)并伴有腦脊髓炎的傳染病[9]。除了自然宿主豬,PRV還可以感染廣泛的哺乳動物,包括牛、羊、犬、狐貍、狼和老虎[10]。鑒于cGAS對宿主抵抗病毒感染過程中產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的重要性,本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建cGAS基因敲除小鼠,并檢測cGAS基因敲除小鼠與野生型小鼠相比感染PRV后對PRV增殖的影響,證明cGAS在抑制病毒增殖中發(fā)揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6N小鼠、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero、PRV-QXX(野毒株)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;PRV gE、gB單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備;cGAS、β-actin購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;黏附載玻片、蓋玻片購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司;RNAiso Plus購自寶日生物技術(shù)(北京)有限公司;草酸銨結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶科技有限公司;DAPI染色試劑(即用型)購自武漢塞維爾生物科技有限公司;Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly cross-Adsorbed Secondary antibody、Alexa Fluor Plus 555購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)美國國家生物技術(shù)中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站所公布的鼠cGAS基因序列,本試驗(yàn)針對小鼠cGAS基因設(shè)計(jì)對應(yīng)的sgRNA,引物名稱及序列見表1。PCR篩選雜合子小鼠引物設(shè)計(jì)見表2,PCR-cGAS-F1/R1引物的靶向等位基因?yàn)?38 bp,野生型等位基因?yàn)? 101 bp。交叉雜合小鼠產(chǎn)生純合子小鼠,PCR-cGAS-F1/R1引物擴(kuò)增長度為438 bp;PCR-cGAS-F2/R1引物擴(kuò)增長度為480 bp。純合子438 bp,雜合子438/480 bp,野生型480 bp。

表2 PCR鑒定引物

根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的mRNA序列,應(yīng)用NCBI的Primer-BLAST網(wǎng)頁設(shè)計(jì)Q-PCR引物,檢測目的基因名稱和引物序列見表3。引物由上海生工生物有限公司合成。

表3 熒光定量PCR引物

1.2.2cGAS基因敲除小鼠的構(gòu)建 敲除小鼠品種名稱為C57BL/6N-Mb21d1tm1cyagen,序列號為KOCMP-00464-Mb21d1,品種類型為C57BL/6N。設(shè)計(jì)gRNA目標(biāo)序列如下:gRNA1(上游):GAGTGTCAAGCGAACATTTCAGG;gRNA2(上游):GA-ATGACTCTTACCGGATAGTGG。cGAS基因(NC-BI 參考序列:NM_173386;Ensembl:ENSMU-SG00000032344)位于小鼠第9號染色體上。鑒定了5個(gè)外顯子,ATG起始密碼子位于外顯子1中,TGA終止密碼子位于外顯子5中(轉(zhuǎn)錄本:ENSMUST00000070742)。外顯子2～4將被選為目標(biāo)位點(diǎn)。外顯子2從大約40.50%的編碼區(qū)開始。外顯子2～4占編碼區(qū)的37.21%。有效KO區(qū)域的大小為3 210 bp。KO區(qū)域沒有任何其他已知基因。Cas9和gRNA將共同注射到受精卵中用于KO小鼠的生產(chǎn)。

幼鼠將通過PCR進(jìn)行基因分型,然后進(jìn)行測序分析。PCR基因分型具體方法如下:剪取小鼠尾尖后使用基因組DNA提取試劑盒,獲得高純度的基因組DNA,測量濃度后進(jìn)行定量。PCR反應(yīng)完成后將其產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳,通過電泳結(jié)果挑選出雜合子小鼠,并將雜合子小鼠進(jìn)行雜交配對以產(chǎn)生純合子小鼠。

1.2.3Western blot 用Western blot方法檢測C57BL/6N小鼠cGAS敲除情況及感染PRV-QXX后對PRV-gB和PRV-gE 蛋白表達(dá)影響。取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各6只,每3只為1組,共分為4組,每種小鼠各取1組為空白對照組,其余組為試驗(yàn)組,試驗(yàn)組滴鼻感染50 μL 稀釋后的PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×103,DMEM做空白對照。病毒感染3 d后,處死小鼠并將肺臟組織分為3份,分別進(jìn)行收取組織中總蛋白,用于Western blot試驗(yàn)、提RNA用于Q-PCR試驗(yàn)、4% PFA固定用于H&E試驗(yàn)。取腦和肺臟組織研磨并收取蛋白后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、室溫封閉、孵育一抗(cGAS兔多克隆抗體和PRV-gB、PRV-gE單克隆抗體)、孵育二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)和顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.4H&E染色 用H&E染色檢測cGAS-/-對小鼠組織形態(tài)及感染PRV-QXX后肺臟組織中炎性浸潤的影響。取上述試驗(yàn)中在4% PFA中固定后的肺臟組織進(jìn)行H&E染色,染色步驟依次為:組織塊沖水、酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等。

1.2.5小鼠存活率檢測 取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各15只,并分別取3只小鼠做空白對照,其余12只感染PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×105。將小鼠用乙醚麻醉后滴鼻感染50 μL稀釋后的病毒液,用DMEM做空白對照,每隔12 h觀察小鼠精神狀態(tài)并記錄死亡情況。

1.2.6病毒PFU檢測 取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各6只,每3只為1組,共分為4組,其中2組為空白對照組,2組為試驗(yàn)組,試驗(yàn)組滴鼻感染50 μL PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×103,用DMEM做空白對照。感染3 d天后處死小鼠,收取肺臟組織的病毒液。用Vero細(xì)胞鋪板于24孔板,每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)。將收取的病毒液用DMEM進(jìn)行倍比稀釋。待24孔板中的Vero細(xì)胞長至90%時(shí),棄上清加入稀釋后的病毒液,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱吸附1 h,棄病毒液加入維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d。用4% PFA室溫固定細(xì)胞,利用1%結(jié)晶紫染色,流水浸洗后倒扣晾干,顯微鏡下統(tǒng)計(jì)噬斑數(shù)。

1.2.7Q-PCR檢測cGAS-/-對PRV感染后相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響,將上述得到的肺臟組織用TRIzol裂解法收取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板,用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase-H Plus)進(jìn)行Q-PCR檢測。β-actin mRNA表達(dá)水平為內(nèi)參值,計(jì)算PRV-TK、PRV-gB、IFN-β、ISG15和ISG20 mRNA表達(dá)水平,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8免疫組化檢測cGAS-/-對PRV-gB蛋白表達(dá)影響 將感染PRV不同時(shí)間點(diǎn)的C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠肺臟組織,經(jīng)過石蠟包埋后進(jìn)行切片,烘片后進(jìn)行脫蠟和復(fù)水。然后用EDTA抗原熱修復(fù)法對組織切片進(jìn)行抗原熱修復(fù):將組織切片放置煮沸的抗原修復(fù)液中,繼續(xù)煮沸15～20 min,自然緩慢冷卻至室溫后用雙蒸水浸洗2次。用1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)浸洗后進(jìn)行室溫封閉和通透,再分別進(jìn)行室溫孵育PRV-gB單克隆抗體(1∶500稀釋)、熒光二抗和DAPI染色劑浸染細(xì)胞核等步驟,1×PBS和雙蒸水分別浸洗3次后封片,晾干后拍照。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的構(gòu)建與鑒定已知敲除片段為外顯子2～4所在區(qū)域(圖1A)。為確認(rèn)敲除片段是否正確,對純合子小鼠基因組進(jìn)行測序。由測序結(jié)果可知(圖1B)與理論序列信息一致,表明該KO小鼠已成功構(gòu)建,可用于后續(xù)試驗(yàn)。取3只雜交產(chǎn)生的幼鼠(2只公鼠,1只母鼠)用上述PCR方法進(jìn)行基因型鑒定。PCR分型使用的2個(gè)對照:水對照(不添加DNA模板);野生型對照(小鼠基因組DNA 400 ng)。電泳分離出大小為438 bp左右的目的條帶(圖1C),表明3只幼鼠均為純合子陽性。隨后另取3只純合子小鼠的肺臟和腦組織用Western blot方法檢測cGAS基因已經(jīng)敲除完全(圖1D),以野生型小鼠的肺臟和腦組織作對照。

A.小鼠Mb21d1敲除區(qū)域示意圖; B.C57BL/6N-cGAS-/-測序結(jié)果;C.cGAS-/-純合子鑒定結(jié)果(M.DL1000 DNA Marker;1#．幼母鼠;2#,3#．幼公鼠); D.Western blot檢測cGAS敲除結(jié)果

2.2cGAS敲除對C57BL/6N小鼠肺臟和腦組織形態(tài)影響為驗(yàn)證cGAS敲除后是否對小鼠組織形態(tài)產(chǎn)生影響,使用H&E染色檢測了小鼠肺臟和腦部的組織形態(tài)。結(jié)果顯示,cGAS敲除后對小鼠肺臟和腦組織形態(tài)無明顯影響(圖2)。

圖2 cGAS敲除對C57BL/6N小鼠肺臟和腦組織形態(tài)無影響

2.3cGAS敲除提高PRV毒力PFU測定結(jié)果顯示,PRV感染C57BL/6N小鼠后測定PFU為102.6PFU/mL,在C57BL/6N-cGAS-/-小鼠體內(nèi)PFU為105.6PFU/mL,表明隨著PRV感染時(shí)間增加C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的病毒毒力顯著高于C57BL/6N小鼠(圖3)。結(jié)果表明,敲除cGAS能顯著提高PRV毒力。

與對照組比較,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);ns.差異不顯著(P>0.05)。下同

A.Q-PCR檢測感染PRV不同時(shí)間PRV-gB基因拷貝數(shù);B.Q-PCR檢測感染PRV不同時(shí)間PRV-TK基因拷貝數(shù)

A.Western blot檢測感染PRV后PRV-gB和PRV-gE蛋白的表達(dá)量;B.免疫組化檢測感染PRV后PRV-gB蛋白的表達(dá)量

A.Q-PCR檢測感染PRV不同時(shí)間IFN-β基因拷貝數(shù);B.Q-PCR檢測感染PRV不同時(shí)間ISG15基因拷貝數(shù);C.Q-PCR檢測感染PRV不同時(shí)間ISG20基因拷貝數(shù)

2.4 敲除cGAS促進(jìn)PRV-gB和PRV-TKmRNA轉(zhuǎn)錄取感染PRV-QXX的C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的肺臟組織,Q-PCR檢測PRV-gB、PRV-TKmRNA表達(dá)水平。隨著PRV-QXX感染時(shí)間增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠體內(nèi)PRV-gB(圖4 A)和PRV-TK(圖4 B)mRNA表達(dá)量顯著高于C57BL/6N小鼠。結(jié)果表明,敲除cGAS促進(jìn)PRV-gB和PRV-TK基因轉(zhuǎn)錄。

2.5 敲除cGAS上調(diào)PRV-gB和PRV-gE 蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠PRV-gB和PRV-gE蛋白顯著高于C57BL/6N小鼠(圖5A)。同時(shí)免疫組化的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)隨著PRV感染時(shí)間增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠PRV-gB蛋白表達(dá)顯著高于C57BL/6N小鼠(圖5B)。結(jié)果表明,敲除cGAS促進(jìn)PRV-gB和PRV-gE蛋白的表達(dá)。

2.6 敲除cGAS抑制PRV調(diào)控的IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA轉(zhuǎn)錄Q-PCR檢測C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠感染PRV-QXX后體內(nèi)IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA表達(dá)水平。隨著PRV-QXX感染時(shí)間增加,C57BL/6N小鼠體內(nèi)IFN-β(圖6A)、ISG15(圖6B)和ISG20(圖6C)mRNA表達(dá)量顯著高于C57BL/6N-cGAS-/-小鼠。結(jié)果表明,敲除cGAS抑制了IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA轉(zhuǎn)錄。

2.7 敲除cGAS促進(jìn)PRV感染肺臟組織炎性浸潤H&E染色檢測C57BL/6N及C57BL/6N-cGA-S-/-小鼠感染PRV-QXX后肺臟組織內(nèi)炎性浸潤情況。隨著PRV感染時(shí)間的增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠肺臟組織內(nèi)炎性浸潤顯著多余C57BL/6N小鼠(圖7)。結(jié)果表明,敲除cGAS促進(jìn)了PRV感染引起的肺臟組織內(nèi)的炎性浸潤。

2.8cGAS敲除降低PRV感染后小鼠存活率為檢測C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠在感染PRV后存活率的差異,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠在感染病毒3 d后均出現(xiàn)死亡,但C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的死亡率顯著高于對照組,并且在病毒感染5 d后全部死亡(圖8)。結(jié)果表明,cGAS敲除后可促進(jìn)小鼠死亡。

圖8 cGAS敲除促使小鼠存活率降低

3 討論

天然免疫是宿主抵御病原體的第一道防線,而cGAS是天然免疫中的重要銜接蛋白。有研究報(bào)道,cGAS是一種觸發(fā)Ⅰ型干擾素通路的細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器,而且還揭示了一種新的免疫信號傳導(dǎo)機(jī)制,其中cGAS產(chǎn)生第二信使cGAMP,cGAMP結(jié)合并激活STING[11],從而觸發(fā)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[12]。在缺乏cGAS的細(xì)胞中,例如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞不能產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和其他細(xì)胞因子。干擾素家族的細(xì)胞因子現(xiàn)在被認(rèn)為是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分和對抗病毒感染的第一道防線。

根據(jù)干擾素結(jié)構(gòu)組成及功能可以將其分為3大類:分別為Ⅰ型干擾素、Ⅱ型干擾素、Ⅲ型干擾素,并可以根據(jù)它們所傳遞信號的受體復(fù)合體進(jìn)行進(jìn)一步分類。Ⅰ型(IFNα/β)和Ⅲ型(IL28A、IL28B、IL29)干擾素通常被認(rèn)為是抗病毒類別[13]。干擾素刺激基因(ISG)在干擾素抗病毒途徑中有不同的作用。一些ISGs的功能是阻止病毒復(fù)制,而另一些ISGs則能夠促進(jìn)或增強(qiáng)某些病毒的復(fù)制[14]。ISGs的產(chǎn)生分為2種途徑,抗病毒干擾素通過JAK/STAT信號通路誘導(dǎo)ISGs的產(chǎn)生,還有一些ISGs是在沒有通過干擾素的情況下由病毒感染直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的[15]。最早發(fā)現(xiàn)的抗病毒ISGs是非常有效的(例如MX1、PKR、OAS1),在近幾年中又發(fā)現(xiàn)了新的成員(TRIM 5、ZAP、APOBEC3G、IFITM3)。ISG介導(dǎo)的抗病毒活性的一個(gè)特點(diǎn)是,單個(gè)干擾素效應(yīng)器可以抑制病毒復(fù)制。據(jù)報(bào)道,ISG15可以阻止病毒介導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)的降解,從而增加IFN-β的表達(dá)[16]。

病毒必須進(jìn)入細(xì)胞翻譯和復(fù)制基因組,然后釋放感染新的細(xì)胞,以此完成它們的生命周期。病毒生命周期的每個(gè)階段都是ISG干預(yù)的潛在目標(biāo)。病毒依賴宿主核糖體進(jìn)行蛋白質(zhì)合成,而翻譯是ISG干預(yù)的常見目標(biāo)。例如,鋅指抗病毒蛋白(ZAP)、干擾素誘導(dǎo)的帶有四肽重復(fù)序列的蛋白(IFIT)家族、OAS-RNASE途徑和PKR這些ISGs可以抑制翻譯[17-19]。除了翻譯,病毒或宿主蛋白的翻譯后修飾對病毒復(fù)制和傳染也很重要。ISG15是ISG復(fù)雜性的典范,并在將翻譯與翻譯后修飾相結(jié)合方面發(fā)揮了新的作用[20]。

理論上,所有能夠攜帶DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)的微生物,如DNA病毒、細(xì)菌、寄生蟲(如瘧疾)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV),都可能觸發(fā)cGAS-STING通路[21-22]。cGAS酶促合成cGAMP作為一種信號放大機(jī)制,可增強(qiáng)相關(guān)免疫反應(yīng)。然而cGAS在宿主細(xì)胞質(zhì)中檢測到自身DNA也可能導(dǎo)致自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Sj?gren綜合征和Aicardi-Goutières綜合征[23]。先前的研究表明,通過siRNA下調(diào)豬cGAS顯著降低了PRV感染后IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平,提示PRV感染可以激活cGAS[24];以及BRD4抑制劑通過cGAS-STING誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答和抗病毒天然免疫,抑制PRV的感染[4]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著PRV感染時(shí)間的延長,敲除cGAS基因可以顯著促進(jìn)PRV-TK、PRV-gBmRNA的轉(zhuǎn)錄,PRV-gE蛋白的翻譯以及子代病毒的毒力,因此cGAS在C57BL/6N小鼠體內(nèi)抑制PRV病毒增殖中發(fā)揮重要作用。