陳 婷 張 文 朱仁愿 續(xù)艷麗 彭 濤

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院/甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，甘肅 蘭州 730050

香櫞為蕓香科植物枸櫞 (CitrusmedicaL.)或香圓(CitruswilsoniiTanaka)的干燥成熟果實，具有理氣和中、化痰止咳、抗菌、抗炎、抗過敏的功效[1]，用于緩解胃腹脹痛、嘔吐、咳嗽等癥[2-3]?！吨袊幍洹匪蛰d的藥用正品香櫞有枸櫞和香圓兩種[4]，香圓藥材資源分布廣泛，果實來源豐富，主產(chǎn)于四川、廣東、廣西、云南等地，由于香圓產(chǎn)地廣泛且栽培品種繁多，市場上藥材質(zhì)量差異較大[5-6]，藥典中香櫞僅以香圓中柚皮苷為含量測定及鑒別對象，并不能完全反映藥材的品質(zhì)，因此建立一種簡單有效的分析方法對不同產(chǎn)地香圓進(jìn)行質(zhì)量評價顯得尤為重要。

目前，液相-飛行時間質(zhì)譜儀(LC-Q/TOF)因具有靈敏度高、準(zhǔn)確率高、分辨率高等特點，能夠在線分析和鑒定復(fù)雜成分，尤其是飛行時間質(zhì)譜儀可精確測定分子的質(zhì)量數(shù)，特別適用于中藥及復(fù)方未知化合物的分析與鑒定[7-8]?，F(xiàn)存關(guān)于香圓的研究報道主要集中在部分成分如橙皮苷和柚皮苷等的含量測定及其指紋圖譜的研究，所用分析技術(shù)多為液相色譜法等[9-10]。隨著數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析已經(jīng)逐漸應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量評價中[11-12]。然而針對不同產(chǎn)地香圓的差異化學(xué)成分所進(jìn)行的高分辨質(zhì)譜研究尚未見報道。因此本文采用超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜相結(jié)合，快速、高效、精確地采集和分析不同產(chǎn)地香圓的化學(xué)成分，同時結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法對不同產(chǎn)地香圓進(jìn)行對比分析，找出各組之間的差異化學(xué)成分，為香圓的產(chǎn)地鑒別和品質(zhì)分類提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1290超高效液相色譜/6546四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)，配有雙電噴霧離子源(dual Jet Stream ESI)；ME204/02電子天平(美國梅特勒公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；SBL-10T型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司)；FW135 型中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜純，其他試劑均為分析純，試驗用水為Milli-Q超純水。香圓藥材來源為產(chǎn)地采購(安徽、四川、云南、浙江、廣西)，共25批，樣本均經(jīng)蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院中藥室鑒定為香圓。

1.2 供試品溶液的制備 精密稱取香圓樣本粉末(過三號篩)各50 mg，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲提取30 min，取出，放置冷卻，稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，離心(4000 r/min，15 min)，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3 檢測條件

1.3.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1mm×100 mm，3.5 μm)。流動相0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液(A)-乙腈溶液(B)；梯度洗脫(0～6 min，5%～30% B；6～16 min，30%～95% B；16～20 min，95%～5% B；20～23 min，5% B)；柱溫40 ℃；流速0.4mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，在正/負(fù)離子模式下分別采集數(shù)據(jù)。干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力3.1×105Pa；毛細(xì)管電壓4000 V；噴嘴電壓500 V；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流速11 L/min；掃描范圍：m/z50～1000。

1.4 共有差異化學(xué)成分的鑒定及統(tǒng)計分析 取香圓樣品，制備供試品溶液，按“1.3”的方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，根據(jù)總離子流圖所得化合物的精確分子質(zhì)量信息，通過比對精確相對分子質(zhì)量和二級特征碎片離子，結(jié)合對照品、數(shù)據(jù)庫檢索及文獻(xiàn)報道，確定或推測共有峰信息。采集的原始數(shù)據(jù)通過Mass Hunter Qualitative Analysis 進(jìn)行分析處理，如保留時間校準(zhǔn)、峰識別、峰對齊等，將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMI-CA 14.1 軟件，對香圓中的化學(xué)成分進(jìn)行主成分分析(PCA)，觀察樣本的聚類情況，再采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗 取500 μL供試品溶液，過0.22 μm濾膜，得樣品溶液。分別選擇6個不同保留時間的離子(考察的離子分別是161.05243、289.07901、305.0739、325.0920、461.1162、597.1814)，計算各離子的保留時間(tR)，質(zhì)荷比(m/z)和歸一化后峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察儀器方法的性能。重復(fù)測定5次，得到離子保留時間的RSD值依次為0.2%、0.3%、0.2%、0.1%、0.2%、0.4%，質(zhì)荷比的RSD值均為0%，相對峰面積的RSD值依次為2.3%、1.6%、3.3%、1.2%、3.0%、4.1%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗 精密稱取香圓樣本粉末(過三號篩)，按1.2節(jié)方法制備5份供試品溶液，得到6個離子保留時間的RSD值分別為0.3%、0.2%、0.4%、0.1%、0.3%、0.5%，質(zhì)荷比的RSD值均為0%，相對峰面積的RSD值分別為4.2%、3.3%、1.2%、1.4%、2.5%、3.0%，結(jié)果顯示方法的重復(fù)性良好。

2.1.3 樣品穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h測定，得到6個離子保留時間的RSD值分別為2.3%、0.5%、1.4%、0.1%、0.1%、1.1%，相對峰面積的RSD值分別為3.4%、2.8%、1.7%、4.0%、3.2%、1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 數(shù)據(jù)采集與成分鑒定 按照液相色譜質(zhì)譜檢測條件的要求，取供試品溶液進(jìn)行采集分析。由于樣品化學(xué)成分復(fù)雜，因此采用正負(fù)離子分別掃描的方法，實現(xiàn)多種化合物同時測定。以安徽產(chǎn)地樣品為例，總離子流圖如圖1所示。通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件自動分析采集的原始數(shù)據(jù)，提取其總離子流色譜圖(EICs)中所得化合物的精確分子質(zhì)量信息，分析其二級碎片離子信息，通過對照品、化學(xué)數(shù)據(jù)庫(CNKI SciFinder，ChemSpider等)及文獻(xiàn)[13-20]報道進(jìn)行檢索，對各化合物進(jìn)行初步鑒定，建立包括化合物名稱、分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息的潛在化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。利用已有對照品的保留時間和質(zhì)譜信息進(jìn)行成分鑒定，推測出傘形花內(nèi)酯、橘皮素、檸檬苦素等29種共有化學(xué)成分，5個產(chǎn)地香圓樣品共有化合物詳細(xì)信息見表1。

a.TOF/MS TIC(ESI+)；b.TOF/MS TIC(ESI-)圖1 安徽產(chǎn)地香圓樣品TOF/MS總離子流色譜圖

表1 香圓樣品中化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF/MS 結(jié)果

2.3 不同產(chǎn)地香圓化學(xué)主成分分析(PCA) 不同產(chǎn)地香圓中的29種化學(xué)成分的離子峰面積數(shù)據(jù)按照要求處理后，導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行PCA處理，得分圖如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地香圓樣本群在得分圖中處于不同的聚落，可以較好地區(qū)分且被明顯分成了5組，說明不同產(chǎn)地香圓樣本主要化學(xué)成分存在差異變化。各組樣本點之間除廣西樣本外，其余離散性均較小，分布較為集中，表明廣西產(chǎn)地樣品的內(nèi)部差異性較大，其余產(chǎn)地(安徽、四川、云南、浙江)香圓樣品組內(nèi)差異較小。

G.1～5廣東；Y.1～5云南；S.1～5四川；Z.1～5浙江；A.1～5安徽圖2 香圓藥材樣品的PCA分析得分圖

2.4 不同產(chǎn)地香圓化學(xué)成分偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 為了更好地觀察樣品組間差異，采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型對25批香圓進(jìn)行分析，得分圖如圖3所示。由模型驗證參數(shù)可知，數(shù)據(jù)矩陣的結(jié)實率參數(shù)R2(X)= 0.754，模型區(qū)分參數(shù)R2(Y)=0.958，模型預(yù)測參數(shù)Q2(cum)=0.930，說明75.4%變量可用來解釋各組之間95.8%的差異，該模型的平均預(yù)測能力為93.0%，預(yù)測能力大于50%，且R2(Y)與Q2(cum)之間的差值為0.028，小于0.3，表明建立的模型穩(wěn)定且有較強(qiáng)的預(yù)測能力。

G.1～5廣東；Y.1～5云南；S.1～5四川；Z.1～5浙江；A.1～5安徽圖3 香圓藥材樣品的OPLS-DA分析得分二維圖(a)、三維圖(b)、置換驗證結(jié)果圖(c)

為了驗證模型的有效性，利用OPLS-DA模型置換交叉檢驗，經(jīng)過800次交叉驗證，結(jié)果R2與真實模型的R2Y值的一條回歸線截距為0.0881 (<0.4)，Q2與真實模型Q2Y值的一條回歸線截距為-0.443(<0.05)，結(jié)果顯示模型未出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象，該模型具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖3c)。圖3a、3b結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的香圓在OPLS-DA 圖中呈現(xiàn)了各自的特定區(qū)域，分離效果明顯。與無監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)結(jié)果相比較，5個產(chǎn)地的香圓樣品得到更好地分離，且有助于尋找樣品間的差異化學(xué)成分。為進(jìn)一步確認(rèn)樣品分類差異貢獻(xiàn)程度的大小，采用變量載荷評價參數(shù)值(VIP)進(jìn)行評價，該值可以體現(xiàn)變量對模型的整體貢獻(xiàn)水平。VIP值越大，表明變量的貢獻(xiàn)程度越大，當(dāng)VIP 值大于 1 時，化合物視為模型潛在的差異化學(xué)成分。本實驗篩選出VIP 值>1的8個化學(xué)成分作為不同產(chǎn)地香圓差異性的主要化學(xué)標(biāo)記物，包括金合歡素、柚皮苷、傘形花內(nèi)酯、5，7-二羥基香豆素、兒茶素、橘皮素、橙皮素、辛弗林，是區(qū)分不同產(chǎn)地香圓最重要的化合物。

3 結(jié)論

本文對25批不同產(chǎn)地香圓藥材進(jìn)行了研究，建立了UPLC-Q-TOF/MS定性分析方法，分析香圓化學(xué)成分圖譜并結(jié)合柚皮苷等對照品的保留時間和質(zhì)譜信息等進(jìn)行成分鑒定，共鑒定出29個成分。采用特征圖譜信息結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析對25批不同產(chǎn)地香圓樣品的主成分進(jìn)行評價，通過PCA和OPLS-DA 對5個產(chǎn)地香圓藥材進(jìn)行了區(qū)分。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地香圓樣本群處于不同的空間聚落，可以較好地區(qū)分且被明顯分成了5組，廣西樣品離散型較大，說明同一產(chǎn)地樣品的內(nèi)部差異性較大；安徽、四川、云南、浙江樣品分布較為集中，組間差異較?。贿M(jìn)一步采用VIP值法進(jìn)行分析，本實驗篩選出VIP 值>1的8個化學(xué)成分作為香圓差異性的主要化學(xué)標(biāo)記物。

本文建立的HPLC-Q-TOF/MS高分辨質(zhì)譜測定香圓中化學(xué)成分的定性方法簡單、可靠，可較為全面的反應(yīng)香圓化學(xué)信息，結(jié)合化學(xué)計量法對特征信息進(jìn)行綜合評價，使結(jié)果更為全面科學(xué)，且有助于從多組分體系的角度鑒別中藥材品種，相互配合，為進(jìn)一步的質(zhì)量控制提供依據(jù)。