謝嘉馳 羅黎霞 羅純清 楊 寧

湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 湘潭 411100

化瘀止血膠囊處方來(lái)源于我院醫(yī)生的長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)，并以協(xié)定處方的形式在院內(nèi)使用多年。由三七、白及、蒲黃炭、延胡索四味藥組成，具有化瘀止血、消腫定痛功效，臨床上治療胃出血疾病效果顯著。為解決湯劑給臨床用藥帶來(lái)的不便，我院按照相關(guān)技術(shù)原則將其開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑——化瘀止血膠囊。本課題組前期已對(duì)大鼠胃出血模型進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示化瘀止血膠囊具有良好的療效。

此外，查閱國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)三七制劑可能引發(fā)胃腸道刺激[1]、出血、過(guò)敏反應(yīng)[2]，其中以皮膚損害最為常見(jiàn)[3]；延胡索制劑可致嚴(yán)重藥物性肝損傷[4-6]，這些制劑的不良反應(yīng)是影響臨床安全用藥的重要因素。因此，為控制該制劑產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效和安全用藥，本課題對(duì)三七、延胡索進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并參照《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)規(guī)定[7]，采用大鼠急性毒性試驗(yàn)探討其安全性[8-9]，為該制劑的質(zhì)量控制及臨床用藥安全提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PL2001-L型電子天平(上海甄明科學(xué)儀器有限公司)；SKG-01型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；DS-0405超聲波清洗機(jī)(深圳品凰科技有限公司)；CX23LEDRFSIC顯微鏡[奧林巴斯(中國(guó))有限公司]，CP214型電子天平(美國(guó)Ohaus公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)。

1.2 材料 三七對(duì)照藥材(批號(hào)：120941-201108)、延胡索對(duì)照藥材(批號(hào)：120928-201311)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供?；鲋寡z囊(湘潭市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20131201)；羧甲基纖維素鈉(上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20141201)；甲醇(天津科賽歐，批號(hào)：200304)；甲苯(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20180111)；乙酸乙酯(批號(hào)：20181129)、二氯甲烷(批號(hào)：20201212)，均購(gòu)自于廣東光華科技有限公司；正丁醇(批號(hào)：20220305)、乙醚(批號(hào)：20220319)、丙酮(批號(hào)：20190105)，均購(gòu)自于天津富宇精細(xì)化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)雌雄各半的費(fèi)城癌癥研究所(簡(jiǎn)稱：ICR)小鼠各20只，小鼠重量：18.0～20.0 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度：20～26 ℃，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室濕度：40%～70%，換氣次數(shù)：≥15次/h，動(dòng)物試驗(yàn)流程及相關(guān)操作遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七的薄層鑒別 取內(nèi)容物5 g，加40 mL甲醇，超聲30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，加水20 mL使殘?jiān)芙猓看斡?0 mL水飽和的正丁醇萃取，萃取3次，將正丁醇液合并，用20 mL氨試液洗滌，再用20 mL飽和的水正丁醇洗滌，洗滌2次，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即為供試品溶液。另取缺三七陰性樣品，同法制成缺三七陰性樣品溶液。再取三七對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照2015版《中國(guó)藥典》(四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取4 μL的供試品、陰性樣品、對(duì)照藥材溶液，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下層溶液為展開(kāi)劑，10 ℃以下放置2 h，展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。如圖1所示。

1 2 3 4 51.陰性樣品溶液；2.三七對(duì)照藥材溶液；3～5.供試品溶液圖1 三七TLC鑒別圖

2.2 延胡索的薄層鑒別 取內(nèi)容物10g，研細(xì)，加50 mL甲醇，超聲30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，加10 mL水使殘?jiān)芙?，加濃氨試液調(diào)至堿性，用 10 mL 乙醚振搖萃取，萃取3次，將乙醚液合并，蒸干，加1 mL甲醇使殘?jiān)芙?，即為供試品溶液。另取缺延胡索陰性樣品，同法制成缺延胡索的陰性樣品溶液。再取延胡索?duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照2015版《中國(guó)藥典》(四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上5 μL的供試品、陰性樣品、對(duì)照藥材溶液，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，再置于碘缸中約3 min取出，將板上吸附的碘揮盡后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾。如圖2所示。

1 2 3 4 51.陰性樣品溶液；2.延胡索對(duì)照藥材溶液；3～5.供試品溶液圖2 延胡索TLC鑒別圖

2.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)[10-18]

2.3.1 最大給藥量實(shí)驗(yàn) 將雌雄各20只SPF級(jí)ICR的小鼠按性別、體重隨機(jī)方法分為兩組，即為空白對(duì)照組和化瘀止血膠囊組。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h以上，按40 mL/kg劑量經(jīng)口灌胃分別給予空白對(duì)照品組和化瘀止血膠囊組，給藥當(dāng)日給藥2次，間隔6 h，化瘀止血膠囊組累積劑量為10.0 g生藥/kg，具體試驗(yàn)劑量及分組情況見(jiàn)表1。給藥當(dāng)天，尤其在給藥后0～4 h內(nèi)密切觀察并記錄各組小鼠一般活動(dòng)狀況、中毒表現(xiàn)和特點(diǎn)、毒性反應(yīng)出現(xiàn)及恢復(fù)時(shí)間以及死亡情況等。然后每天觀察1次，連續(xù)觀察14 d。分別于給藥前及給藥后第7天、第14天，使用電子天平對(duì)小鼠體重進(jìn)行稱量。所有小鼠在試驗(yàn)結(jié)束后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉處死，并予以大體解剖，肉眼觀察各臟器的位置、大小、色澤、粘連等情況，并檢查臟器表面和切面的質(zhì)地、積液及腫瘤等異常改變。在試驗(yàn)過(guò)程中若有非計(jì)劃死亡的動(dòng)物(包括瀕死動(dòng)物)，均應(yīng)進(jìn)行大體解剖。

表1 試驗(yàn)劑量及分組設(shè)計(jì)

2.3.3 結(jié)果

2.3.3.1 一般活動(dòng)狀況及死亡情況 在灌胃給藥后0～4 h內(nèi)和連續(xù)14 d觀察期間，空白對(duì)照組和化瘀止血膠囊組小鼠自主活動(dòng)如常，未見(jiàn)明顯異常和死亡現(xiàn)象。

2.3.3.2 體重變化情況 分別于給藥前、給藥后第7天和第14天稱重，結(jié)果與空白對(duì)照組比較，化瘀止血膠囊組小鼠體重變化無(wú)顯著性差異，且體重在正常增長(zhǎng)范圍內(nèi)，說(shuō)明ICR小鼠經(jīng)口灌服化瘀止血膠囊，給藥當(dāng)日給藥2次，累積劑量10.0生藥/kg，對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。具體見(jiàn)表2、表3、表4。

表2 化瘀止血膠囊對(duì)小鼠體重影響

表3 化瘀止血膠囊對(duì)雌性小鼠體重影響

表4 化瘀止血膠囊對(duì)雄性小鼠體重影響

2.3.3.3 大體解剖檢查結(jié)果 肉眼觀察各臟器表面和切面均未見(jiàn)明顯異常情況。

3 討論

化瘀止血膠囊方中三七化瘀止血、活血止痛，為君藥；白及收斂止血、消腫生肌，止血同時(shí)促進(jìn)恢復(fù)，延胡索活血、行氣、止痛，兩者配合三七化瘀止血，行氣止痛，為臣藥；蒲黃止血、化瘀，調(diào)血而兼止，為佐藥。諸藥合并，化瘀止血、消腫定痛。根據(jù)湖南省藥品監(jiān)督管理局《湖南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案管理實(shí)施細(xì)則》的規(guī)定，薄層鑒別應(yīng)首選處方中君臣藥。故采用TLC法鑒別化瘀止血膠囊中三七、白及、延胡索藥味，建立其TLC色譜方法學(xué)研究。

在三七的薄層鑒別試驗(yàn)中，參考《中國(guó)藥典》2015版一部，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)為展開(kāi)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該展開(kāi)劑中三氯甲烷毒性大。后經(jīng)查閱文獻(xiàn)，選用二氯甲烷代替三氯甲烷為展開(kāi)劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，且展開(kāi)劑毒性降低，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在延胡索的薄層鑒別試驗(yàn)中，選用延胡索對(duì)照藥材作為對(duì)照，結(jié)果顯示，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)明顯，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。處方中白及薄層分離效果差，且陰性干擾嚴(yán)重，故未列入質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此，將三七、延胡索列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)試驗(yàn)，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)。

本課題組在前期已對(duì)化瘀止血膠囊的止血治療作用進(jìn)行了研究，顯示對(duì)胃出血其具有較好的治療作用。在肯定其療效的前提下，對(duì)該制劑的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果在本試驗(yàn)條件下，ICR小鼠經(jīng)口灌胃給予化瘀止血膠囊(0.125 g生藥/mL)，最大劑量40 mL/kg，每天給藥2次(累積劑量為10.0 g生藥/kg)，對(duì)其一般活動(dòng)狀況和體重量增長(zhǎng)無(wú)明顯影響，未見(jiàn)明顯急性毒性反應(yīng)。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[10]，計(jì)算出小鼠最大給藥量相當(dāng)于70 kg成人臨床擬用量的130倍，提示化瘀止血膠囊口服用藥安全性較高，可為臨床應(yīng)用安全性提供依據(jù)。