萬鑫蕊，王曉燕，王 霖，馬志強(qiáng)，李才信，許世濤，唐興蕊，毛紅艷

（昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650301）

非結(jié)核分枝桿菌（non tuberculous mycobacterum，NTM）是指除麻風(fēng)分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（tuberculosis，TB）以外的分枝桿菌，目前已超過170 種非結(jié)核分枝桿菌菌種被報(bào)道。NTM 在水、土壤等自然環(huán)境中廣泛存在，可引起肺、皮膚、淋巴結(jié)和軟組織等感染，其中NTM 肺病占90%以上[1]。隨著免疫抑制人群的增多和細(xì)菌分離鑒定技術(shù)的提高，我國NTM 感染率呈逐年增加的趨勢，已逐漸成為公共衛(wèi)生健康問題。NTM 感染與結(jié)核病的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查十分相似，常常被誤診為肺結(jié)核。因此NTM 感染者大多接受了無效的抗結(jié)核治療，引起了由抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的肝、腎功能損傷[2]。除此之外，目前研究表明機(jī)體免疫狀態(tài)與NTM 感染和發(fā)展密切相關(guān)，尤其CD4+T 淋巴細(xì)胞在分枝桿菌感染的免疫控制中起重要作用[3]。為此分析我院非結(jié)核分枝桿菌感染者的肝腎功能、免疫功能和耐藥性，以期為NTM 的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021 年5 月至2022 年3 月在昆明市第三人民醫(yī)院確診為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者122 例為非結(jié)核組，其中男性55 例，女性67 例。并隨機(jī)選取同期確診為結(jié)核分枝桿菌感染的患者共130 例作為結(jié)核組，其中男性71 例，女性59 例。同時(shí)選取健康體檢者150 例作為健康組，其中男性68 例，女性82 例。根據(jù)年齡段將2 組感染者分為青年（＜ 45 歲）、中年（45～60 歲）、老年（＞ 60 歲）3 組。本研究經(jīng)過昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（KSLL20230320007）。非結(jié)核分枝桿菌感染者診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：符合下述條件之一可作出診斷（1）痰2 次NTM 培養(yǎng)均是同一致病菌；（2）痰或支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性++以上1 次；（3）痰或支氣管肺泡灌洗液NTM 培養(yǎng)陽性1 次，涂片抗酸桿菌陽性++以上；（4）經(jīng)支氣管鏡或其他肺組織檢查，表明分枝桿菌組織病理學(xué)特征性（肉芽腫性炎或抗酸桿菌陽性），同時(shí)NTM 培養(yǎng)陽性；（5）肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌組織病理學(xué)特征（肉芽腫性炎或抗酸桿菌陽性）且至少1 個(gè)痰液或支氣管肺泡灌洗液NTM 培養(yǎng)陽性1 次。結(jié)核分枝桿菌感染者診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）2 個(gè)痰標(biāo)本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性；（2）1 份痰標(biāo)本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性，同時(shí)符合肺部影像學(xué)檢查活動(dòng)性肺結(jié)核影像；（3）1 份痰標(biāo)本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性，同時(shí)1 份痰標(biāo)本結(jié)核菌培養(yǎng)陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)感染非結(jié)核和結(jié)核分枝桿菌的患者。

1.2 肝、腎功能檢測

采用日立公司生產(chǎn)的008as 全自動(dòng)生化分析儀檢測結(jié)核組、非結(jié)核組和健康組的肝、腎功能指標(biāo)包括總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBLI）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、肌酐（creatinine，CR）、尿素（carbamide，UREA）和尿酸（uric acid，UA）。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用銀科公司分枝桿菌藥敏檢測試劑盒進(jìn)行微孔板藥敏檢測實(shí)驗(yàn)。吸取200 μL 雜菌抑制劑和200 μL 1mg/mL 的菌懸液加入到藥敏培養(yǎng)集基中，混勻后吸取200 μL 加入到微孔藥敏板中。放置于35 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d 后觀察結(jié)果。

結(jié)核分枝桿菌藥敏包含異煙肼INH、利福平RFP、鏈霉素SM、乙胺丁醇EMB、左氧氟沙星LVFX、利福噴丁RFT、利福布丁RFB、丙硫乙酰胺PTO、力克肺疾DIP、對(duì)氨基水楊酸PAS、莫西沙星MFX、氯法齊明CFZ、卡那霉素KM、卷曲霉素CPM、克拉霉素CLR、阿米卡星AMK共16 種；非結(jié)核分枝桿菌藥敏包含利福平RFP、乙胺丁醇EMB、阿米卡星AMK、莫西沙星MOX、克拉霉素CLR、利福噴丁RFT、米諾環(huán)素MNO、利奈唑胺LNZ、多西環(huán)素DOX、妥布霉素TOB、亞胺培南/西司IM/CI、加替沙星GAT、磺胺甲唑SMX、頭孢西丁FOX、阿奇霉素AZM、和共15 種。

1.4 淋巴細(xì)胞亞群檢測

使用邁瑞公司CD3/CD4/CD8/CD45 檢測試劑對(duì)結(jié)核組、非結(jié)核組和健康組進(jìn)行外周血T 淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)。取CD3/CD4/CD8 檢測試劑20 μL，加入EDTA 抗凝外周靜脈血50 μL，渦旋混勻后室溫避光放置15 min 后加入450 μL 溶血?jiǎng)瑴u旋混勻后室溫避光放置15 min 后通過流式細(xì)胞儀檢測各組 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2013 建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用（）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）表示。組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

非結(jié)核分枝桿菌感染者122 例，其中男性55 例、女 性67 例，年 齡15～87 歲，平 均（48.75±16.60）歲；結(jié)核分枝桿菌感染者130 例，其中男性71 例、女性59 例，年齡17～83 歲，平均（42±17.94）歲；健康對(duì)照組150 例，其中男性68 例、女 性82 例，年 齡16～85 歲，平 均（44±15.87）歲。非結(jié)核分枝桿菌感染者青年45 例、中年49 例、老年28 例；結(jié)核分枝桿菌感染者青年56 例、中年44 例、老年20 例；健康對(duì)照組青年79 例、中年45 例、老年26 例。3 組在不同年齡組和性別間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 非結(jié)核和結(jié)核分枝桿菌感染者年齡、性別比較[n（%）]Tab.1 Comparison of age and sex between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected people[n（%）]

2.2 肝腎功能指標(biāo)比較

非結(jié)核組與結(jié)核組和健康組肝、腎功能指標(biāo)比較，非結(jié)核組TBIL 9.0（6.9，12，6）、ALT 14（11，20）、AST 21（16，27）、GGT 23.6（16.9，41.1）、CR 63（53，73）、UA 375（300，478）與結(jié)核組和健康組相比均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。進(jìn)一步分析非結(jié)核組和結(jié)核組2組間肝、腎功能指標(biāo)差異，非結(jié)核組TBIL、ALT、AST、GGT 與結(jié)核組相比均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 非結(jié)核和結(jié)核分支桿菌感染者肝腎功能指標(biāo)比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of liver and kidney function indexes between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients [M（P25，P75）]

2.3 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比較

非結(jié)核組和結(jié)核組的CD3+T、CD4+T、CD8+T與健康組相比均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。非結(jié)核組CD8+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)高于結(jié)核組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD3+T 和CD4+T與結(jié)核組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。3 組間CD4/CD8 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表4和圖1。

圖1 非結(jié)核和結(jié)核分支桿菌感染患者免疫功能比較Fig.1 Comparison of immune function between nontuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients.

表4 非結(jié)核和結(jié)核分支桿菌感染患者免疫功能比較（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

表4 非結(jié)核和結(jié)核分支桿菌感染患者免疫功能比較（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

3組間差異的顯著性用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，*P＜0.05。3組間兩兩比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)，與健康組比較#P＜0.05；與結(jié)核比較，ΔP＜0.05。

2.4 耐藥性情況比較

結(jié)核組對(duì)異煙肼的耐藥率最高為22.31%，其次為利福平和利福噴丁分別為17.69%和16.15%。而對(duì)于丙硫乙酰胺、氯法齊明、卡那霉素、卷曲霉素、克拉霉素和阿米卡星均未有耐藥菌株檢出。在非結(jié)核組中，亞胺/西司的耐藥率最高為99.18%，其次為多西環(huán)素和米諾環(huán)素，分別為78.69%和72.95%。非結(jié)核組對(duì)利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福噴丁的耐藥率均高于結(jié)核組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5、表6。

表5 非結(jié)核和結(jié)核分支桿菌感染患者耐藥性比較（n）Tab.5 Comparison of drug resistance between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（n）

表6 非結(jié)核和結(jié)核分枝桿菌感染患者對(duì)同種抗結(jié)核藥物耐藥性比較n（%）Tab.6 Comparison of drug resistance with the same anti-tuberculosis drugs between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients n（%）

3 討論

NTM 多發(fā)生于存在慢性基礎(chǔ)肺部疾病和免疫功能缺陷的人群[6]。近年來NTM 感染導(dǎo)致的疾病發(fā)病率逐年上升，而NTM 感染和TB 感染臨床癥狀相似，使之前部分診斷為肺結(jié)核的患者實(shí)際為NTM 感染。隨著NTM 檢測技術(shù)的發(fā)展，NTM 檢出率也呈逐年上升的趨勢，成為了值得研究的重要公共健康問題。

有研究表明，與青年相比中老年人感染NTM較為常見，可能與NTM 自身的生物學(xué)特性有關(guān)。NTM 是機(jī)會(huì)致病菌，與結(jié)核分枝桿菌相比毒力較弱，因此免疫力低下的中老年人更容易感染[7]。但在本研究中，非結(jié)核組和結(jié)核組相比年齡和性別沒有顯著差異。排除了后續(xù)對(duì)兩組臨床特征分析時(shí)年齡和性別帶來的干擾。

目前使用的大部分抗結(jié)核藥物對(duì)肝功能和腎功能均有一定的損害，并且多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合用藥與藥物性肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。異煙肼、利福平、乙胺丁醇等一線抗結(jié)核藥物均會(huì)對(duì)患者的肝、腎功能產(chǎn)生影響，包括膽紅素代謝異常、膽汁淤積以及腎臟代謝功能異常等[10]。本研究中與結(jié)核組和健康對(duì)照相比NTM 感染者肝腎功能指標(biāo)均有不同程度的升高，而TB 感染者肝腎功能指標(biāo)變化相對(duì)較少。NTM 感染組肝功能指標(biāo)如TBIL、ALT、AST、GGT 均高于TB 感染組。提示NTM 組肝功能損傷更加嚴(yán)重，可能與非結(jié)核分枝桿菌感染易誤診為肺結(jié)核有關(guān)。非結(jié)核分枝桿菌感染后的臨床癥狀和結(jié)核分枝桿菌相似，均有發(fā)熱、咯血、咳嗽和咳痰等癥狀。并且NTM 感染也可使結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、結(jié)核菌感染T 淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陽性，因此NTM 感染易被誤診為結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病[11]，且大多NTM 感染者按照抗結(jié)核方案進(jìn)行治療，不僅治療效果不佳而且容易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。長期抗結(jié)核藥物的使用也使NTM 感染者與TB 感染者相比藥物性肝損傷更加嚴(yán)重。

在復(fù)雜的宿主-病原體相互作用過程中，NTM 感染者的免疫功能受到抑制。固有免疫和適應(yīng)性免疫在對(duì)抗NTM 感染均起到重要作用。NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可以在感染早期階段通過吞噬作用和顆粒酶消除和殺滅非結(jié)核分枝桿菌[12]。此外，CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫促進(jìn)各種細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，起到預(yù)防和控制NTM 感染作用[13]。本研究中，與健康對(duì)照組相比NTM 感染者和TB 感染者的CD3+T、CD4+T 和CD8+T 計(jì)數(shù)均有降低，提示2 組免疫功能均有一定損傷和降低，使感染者無法產(chǎn)生針對(duì)NTM 侵襲的細(xì)胞因子和抗體，最終促使NTM-PD 的發(fā)生。NTM 感染組CD8+T 淋巴細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌感染組相比顯著升高，CD3+T、CD4+T 和CD4/CD8 相對(duì)較高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4+T 釋放的細(xì)胞因子如γ-干擾素、IL-12 等可激活巨噬和中性粒細(xì)胞殺滅NTM[14]，而CD8+T 淋巴細(xì)胞可以抑制體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)促使NTM 病情進(jìn)展[15]。這種淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和比例的變化提示了NTM感染者免疫功能的紊亂和受損，也反映出細(xì)胞免疫的失衡可能增加了NTM 的易感性[16]。

分析NTM 感染者藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞胺/西司、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、乙胺丁醇和磺胺甲唑的耐藥率均超過50%，但對(duì)阿米卡星和莫西沙星的耐藥率較低，僅為4.1%。對(duì)于同種抗結(jié)核藥物，如利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福噴丁等，非結(jié)核分枝桿菌往往具有更高的耐藥率。由于NTM 細(xì)胞壁的通透性屏障和表面的高疏水性[17]，NTM 對(duì)亞胺/西司、乙胺丁醇和磺胺甲唑基本處于天然耐藥狀態(tài)。除此之外，抗菌藥物的長期使用、頻繁更換也是耐藥基因突變和耐藥菌株大量繁殖的重要原因之一[18]。因此加強(qiáng)分枝桿菌的菌種鑒定，非結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的推廣應(yīng)用，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥、減少耐藥菌株的產(chǎn)生以及減輕患者痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要的意義。