張 明 ，于成龍 ，曹錦鵬

（1）青島市市南區(qū)人民醫(yī)院檢驗科;2）青島市第三人民醫(yī)院健康管理中心，山東 青島 266000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的90%以上，是全球癌癥相關死亡的常見原因。HCC 的主要危險因素包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酗酒、黃曲霉毒素暴露等[1]。隨著醫(yī)療技術的提升，HCC 患者的5 a 生存期得到了一定的提高，但由于確診較晚、化療耐藥以及癌癥的頻繁復發(fā)和和轉(zhuǎn)移，HCC 患者的預后仍然較差[2]。因此，迫切需要開發(fā)HCC 的生物標志物和治療靶點。

鋅指蛋白（zinc finger proteins，ZNFs）是人類基因組中參與轉(zhuǎn)錄活動和細胞過程調(diào)節(jié)的最大一類轉(zhuǎn)錄因子[3]。ZNF384 位于人類染色體12p13.31，是鋅指蛋白家族的一員[4]。先前的研究表明，ZNF384 在乳腺癌[5]和結(jié)直腸癌[6]中表達升高，促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。He 等[7]報道ZNF384在HCC 細胞系中高表達，但其調(diào)節(jié)HCC 進展的具體機制鮮有報道，有待進一步研究闡明。谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）是催化谷胱甘肽合成的第一種限速酶。GCL 由催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）和動力學調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM）2 個亞單位組成，這些亞單位的活性受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[8]。近來，研究發(fā)現(xiàn)GCLM 在人HCC 組織中表達升高[9]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)ZNF384 與GCLM 啟動子具有結(jié)合位點，并通過實驗證實ZNF384 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控GCLM 啟動子，抑制HCC 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 細胞

人HCC 細胞HepG2、HuH7 以及人腎胚細胞HEK293T 購自南京科佰生物科技有限公司。人正常肝細胞LO2 購自安徽巨州生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

MEM 培養(yǎng)基購自南京科佰生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基和RPMI-1 640 培養(yǎng)基武漢普諾賽生命科技有限公司。LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen。蛋白質(zhì)測定試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。兔抗ZNF384、GCLM 和GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自Abcam。ECL 發(fā)光液購自愛必信（上海）生物科技有限公司。CCK-8 試劑盒購自MedChemExpress。Transwell小室購自美國Coring。結(jié)晶紫染色液和胃蛋白酶購自上海Macklin。

1.3 細胞培養(yǎng)

HepG2 細胞培養(yǎng)在包含10%胎牛血清（FBS）、1%非必須氨基酸以及1 mmol/L 丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基內(nèi)。HuH7 和HEK293T 細胞分別培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)。LO2 細胞置于含20% FBS 和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基置于含5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)試劑盒說明書，采用LipofectamineTM2000 分別將si-NC、si-ZNF384#1、si-ZNF384#2、si-ZNF384#3、pcDNA-NC、pcDNA-GCLM 轉(zhuǎn) 染至HepG2、HuH7 細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后，將細胞置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。48 h 后，利用Western blot 檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后的細胞用于后續(xù)實驗。實驗分組為：si-NC 組、si-ZNF384#1組、si-ZNF384#2 組、si-ZNF384#3 組、pcDNANC 組、pcDNA-ZNF384 組、si-ZNF384+pcDNANC 組以及si-ZNF384+pcDNA-GCLM 組。

1.5 Western blot

提取細胞中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉，再與一抗（ZNF384：1∶2000，N-cadherin：1∶5 000，Vimentin：1∶1 000，E-cadherin：1∶1 000，GCLM：1∶1 000，GAPDH：1∶2 500）在4 ℃環(huán)境中避光孵育，漂洗后與二抗在室溫中避光孵育2 h。ECL 試劑處理后，凝膠成像系統(tǒng)顯色。Image J 軟件分析蛋白灰度值。

1.6 CCK-8

將成功轉(zhuǎn)染的HepG2 和HuH7 細胞接種至96 孔板中（1 000 個/孔），在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。向每孔中加入10%的CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值。

1.7 Transwell

HepG2 和HuH7 細胞經(jīng)饑餓培養(yǎng)24 h，制成細胞懸液后分別接種至Transwell 小室的上室，下室中加入含10% FBS 的培養(yǎng)基。Transwell 板置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后取出Transwell小室。4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡觀察細胞遷移情況。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

根據(jù)數(shù)據(jù)庫預測的ZNF384 與GCLM 啟動子的結(jié)合位點，構建GCLM 的野生型載體p-GLO熒光素酶載體。同時，突變GCLM 啟動子的A 位點和B 位點，構建GCLM 突變型p-GLO 載體。將熒光素酶載體與PCDNA-NC 和pcDNA-ZNF384共同轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞中。48 h 后收集細胞，裂解后利用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.9 熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

Cy3 標記的ZNF384 寡核苷酸探針和488 標記的GCLM 寡核苷酸探針用于FISH 實驗。4%多聚甲醛固定HepG2 細胞15 min，PBS 漂洗后用1%胃蛋白酶處理固定細胞。70%、90%、100%濃度的乙醇對細胞脫水并風干。ZNF384 探針、GCLM 探針與雜交緩沖液混合后孵育2 h。玻片經(jīng)檸檬酸鈉生理鹽水漂洗、風干，加入DAPI 試劑染細胞核。熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學處理

所有實驗均進行3 次重復。GraphPad Prism 8.0 分析數(shù)據(jù)并作圖，數(shù)據(jù)表示為均值±標準差（xˉ± SD）。2 組間數(shù)據(jù)比較采用student’st檢驗。多組間數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA，事后比較利用Tukey’s 檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 敲降ZNF384 抑制HCC 細胞增殖和轉(zhuǎn)移

分別培養(yǎng)HCC 細胞系HepG2 和HuH7，收集細胞，檢測ZNF384 的表達。結(jié)果表明，ZNF384在HepG2 和HuH7 細胞系中的表達高于人正常肝細胞LO2（P＜0.001），見圖1A～1B。隨后分別在HepG2 和HuH7 細胞中轉(zhuǎn)染si-ZNF384，檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-ZNF384 可顯著降低ZNF384 的表達（圖1C），且si-ZNF384#2 組在HepG2 細胞中表達最低（P＜0.001），見圖1D。si-ZNF384#3 在HuH7細胞中表達最低（圖1E，P＜0.001），因此，分別選擇si-ZNF384#2 和si-ZNF384#3 組轉(zhuǎn)染HepG2和HuH7 細胞進行后續(xù)實驗。CCK-8 和Transwell結(jié)果表明，敲降ZNF384 顯著抑制HepG2 和HuH7 細胞的增殖（P＜0.001）和遷移能力（P＜0.001），見圖1F～1H。Western blot 檢測表 明，敲降ZNF384 組中HepG2 和HuH7 細胞中Ncadherin（均P＜0.01）和Vimentin（均P＜0.01）的蛋白表達低于對照組，E-cadherin 的蛋白表達顯著升高（均P＜0.01），見圖1I～1K。綜上表明，敲降ZNF384 可明顯抑制HCC 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖1 敲降ZNF384 抑制HCC 細胞增殖和轉(zhuǎn)移Fig.1 Knockdown of ZNF384 inhibited the proliferation and metastasis of HCC cells

2.2 ZNF384 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控GCLM 的表達

進一步通過AnimalTFD3.0 數(shù)據(jù)庫預測與ZNF384 啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCLM 的轉(zhuǎn)錄因子與ZNF384 啟動子存在結(jié)合位點，見圖2A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，發(fā)現(xiàn)相比較于pcDNA-NC 組，過表達ZNF384 組中野生型及突變A 位點的GCLM 的熒光素酶活性顯著升高（圖2B，P＜0.001），而對突變B 位點以及同時突變A 位點和B 位點的GCLM 的熒光素酶活性無顯著影響，因此證實ZNF384 的轉(zhuǎn)錄因子與GCLM 啟動子的B 位點結(jié)合。FISH 實驗表明，ZNF384 和GCLM 主要共定位于HepG2 細胞的細胞核內(nèi)（圖2C）。Western blot 實驗檢測HCC 細胞中GCLM 的表達，結(jié)果見圖3D-F，GCLM 在HepG2和HuH7 細胞中高表達（圖2D，均P＜0.01），敲降ZNF384 組中GCLM 蛋白表達低于對照組（圖2E-2F，均P＜0.01）。由此可知，ZNF384 作為轉(zhuǎn)錄因子與GCLM 的啟動子結(jié)合，敲降ZNF384 抑制GCLM 的蛋白表達。

圖2 ZNF384 作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控GCLM 的表達Fig.2 ZNF384 as a transcription factor regulated the expression of GCLM

圖3 ZNF384 調(diào)控GCLM 抑制肝細胞癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移Fig.3 ZNF384 suppressed the proliferation and metastasis of HCC cells by regulating GCLM

2.3 ZNF384 調(diào)控GCLM 抑制HCC 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移

接下來驗證ZNF384 調(diào)控GCLM 對HCC 細胞增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。分別在HepG2 和HuH7細胞系中轉(zhuǎn)染si-ZNF384 和pcDNA-GCLM，轉(zhuǎn)染效率檢測顯示（圖3A-3C），相比較于si-ZNF384+pcDNA-NC 組，轉(zhuǎn)染pcDNA-GCLM 明顯上調(diào)細胞中GCLM 的表達（P＜0.01），而對ZNF384 表達無明顯作用（P＞ 0.05）。CCK-8（圖3D）和Transwell（圖3F-G）實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降ZNF384 且過表達GCLM 組中HepG2 和HuH7 細胞的增殖（P＜0.01）和遷移（均P＜0.01）能力明顯高于僅敲降ZNF384組。EMT 相關標志物檢測發(fā)現(xiàn)（圖3H-3J），相比較于僅敲降ZNF384 組，敲降ZNF384 且過表達GCLM 組N-cadherin（均P＜0.05）和Vimentin（均P＜0.05）高表達，E-cadherin 表達明顯降低（P＜0.001）。綜上表明，過表達GCLM 可逆轉(zhuǎn)敲降ZNF384 對HepG2 和HuH7 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用，促進HCC 細胞的惡性生物學行為。

3 討論

HCC 是消化道惡性腫瘤之一。近年來，HCC發(fā)病率明顯增加，由于發(fā)病的隱匿性以及癌細胞的惡性轉(zhuǎn)移，患者的5 a 生存率較低[10]。雖然手術切除、原位肝移植、放化療等綜合治療已應用于臨床，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移、排斥反應、化療耐藥以及放療抵抗等多種因素的存在，治療效果仍不夠理想[11-13]。因此，探索HCC 發(fā)展所涉及的具體機制，對于確定治療的靶點以及提高HCC 的臨床療效十分重要。

先前的研究證明，ZNF384 作為融合基因，與TCF3、EP300、CREBBP、BMP2K 等基因伴侶融合重排，調(diào)控兒童B 細胞前體急性淋巴細胞白血病的發(fā)生與發(fā)展[14]。ZNF384 與TAF15 基因融合后重排，導致患者從前B 急性淋巴系白血病轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙运柘蛋籽15]。ZNF384 也可作為腫瘤細胞的調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控腫瘤的發(fā)展進程。例如：Tim-3/Gal-9 通過調(diào)控ZNF384，促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中NLRC4 炎癥小體的形成和激活，引發(fā)炎癥[16]。ZNF384 通過激活ZEB1 的表達，促進乳腺癌細胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]。此外，在人乳頭瘤病毒E6 通過ZNF384 的外源表達促進人用生化角質(zhì)形成細胞中APOBEC3B 啟動子激活，促進人乳頭瘤病毒誘導的癌癥發(fā)生[17]。ZNF384通過結(jié)合受損DNA 和Ku70/Ku80，促進非同源末端連接修復體的構建，在DNA 雙鏈斷裂的修復中具有重要作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)ZNF384 在HCC 細胞系HepG2 和HuH7 中表達升高。敲降ZNF384顯著抑制HepG2 和HuH7 細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Xiao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ZNF384 可作為DNASE1L3 的上游轉(zhuǎn)錄因子，負調(diào)節(jié)DNASE1L3的表達，從而抑制HCC 的生長并促進體內(nèi)細胞凋亡。

近來，研究發(fā)現(xiàn)GCLM 在多種疾病中具有調(diào)控作用。GCLM 敲除小鼠具有強烈的氧化應激反應，高脂飲食不會促進小鼠的葡萄糖耐受不良或胰島素抵抗[19]。丹參素上調(diào)GCLM 的表達，改善魚藤酮誘導的帕金森小鼠運動和神經(jīng)功能障礙[20]。GCLM 是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，在膀胱癌中上調(diào)，與膀胱癌的免疫浸潤相關，下調(diào)GCLM 抑制膀胱癌細胞的克隆形成能力[21]。抑制GCLM 可改善肺小細胞癌肺癌細胞的順鉑耐藥性[22]。抑制GCLM 可有效改善非小細胞肺癌細胞的順鉑耐藥性[22]。GCLM 在催乳素瘤中高表達，敲降GCLM可緩解Cabergoline 誘導的催乳素瘤細胞鐵死亡[23]。Cheng 等[24]報道，GCLM mRNA 在HBV 相關肝硬化和終末期肝病組中表達較高。本研究發(fā)現(xiàn)，GCLM 在HCC 細胞系中表達升高，GCLM 的啟動子受ZNF384 調(diào)控，過表達GCLM 可逆轉(zhuǎn)敲降ZNF384 對HepG2 和HuH7 細胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的促進作用。

綜上所述，ZNF384 和GCLM 在HCC 細胞系中高表達，ZNF384 作為轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控GCLM啟動子。敲降ZNF384 通過抑制GCLM 的表達，抑制HCC 細胞增殖和轉(zhuǎn)移。