周湘忠 楊書鳳 李玉捷 陳立軍 魏剛

自噬是一種以包裹降解物形成自噬體輸送到溶酶體進(jìn)行消化的細(xì)胞內(nèi)降解過程，起到細(xì)胞器更新、滿足代謝需求以及保持細(xì)胞穩(wěn)定的作用［1］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化的主要場所，可生成腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），參與細(xì)胞增殖、衰老、穩(wěn)態(tài)及凋亡等過程［2］。當(dāng)機(jī)體處于缺血缺氧、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等情況時(shí)，線粒體自噬則會被啟動(dòng)。5-氟尿嘧啶（5-fluorouocil，5-Fu）為抗代謝類化療藥物，其多應(yīng)用治療消化道腫瘤，特別是對只能進(jìn)行藥物化療的老年患者具有重要治療意義。有研究指出［3］5-Fu 體內(nèi)的代謝產(chǎn)物F-cltrate 可應(yīng)用于線粒體阻斷三羧酸循環(huán)，降低ATP 的生成，使得線粒體膜通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致線粒體功能異常。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是黃芪的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明［4］AS-Ⅳ通過保護(hù)線粒體、抑制凋亡、減輕鈣超載、保持內(nèi)皮細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)、良好的抗脂質(zhì)過氧化及清除氧自由基等途徑參與心肌細(xì)胞的保護(hù)。但目前有關(guān)線粒體自噬途徑的干預(yù)機(jī)制鮮少見研究報(bào)道。本研究從線粒體自噬角度探討AS-Ⅳ對5-Fu 誘導(dǎo)心肌毒性的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物與儀器

氟尿嘧啶注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；AS-Ⅳ（Med Chem Express，純度為98.0%）；兔源LC3Ⅱ一抗（美國Proteintech Group 公司）；Beclin1、Parkin、PINK1、LAMP 一抗（沈陽萬類生物有限公司）；LC3 一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（美國Cell Signaling Technology公司）；美國Sigma-Aldrich Chemical Company］；TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國ROCHE）；線粒體ATP 及膜電位檢測試劑盒（上海碧云天有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8，同仁化學(xué)研究所）；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），透射電鏡（日本日立公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、培養(yǎng)

選8 周齡雄性SD 大鼠（200±20 g）20 只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0006。通過腹膜內(nèi)注射氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，無菌條件下取出心室肌組織，用冷PBS灌注3 min 后切成小塊。采用0.25%胰酶溶液反復(fù)消化小塊，并應(yīng)用10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，隨后將細(xì)胞懸浮液過濾離心1 min。將獲得的心肌細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長、融合至≥80%時(shí)，采用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞開展后續(xù)研究。

1.3 細(xì)胞分組

將細(xì)胞分成5 組：A 組、B 組、C 組、D 組、E 組。其中，除A 組外其余四組均加入80 μL 5-Fu溶液構(gòu)建5-Fu 心肌毒性模型，C 組、D 組、E 組均加入40 μmol/L AS-Ⅳ，另D 組、E 組分別加入線粒體自噬抑制劑1 μmol/L Mdivi-1 及激動(dòng)劑0.1 μmol/L RAPA 進(jìn)行處理。最后所有組均加入等量體積DMEM 和20%生理鹽水進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 CCK-8 檢測細(xì)胞活力

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)所制備細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，接種于96 孔板，每孔100 μL，使每孔細(xì)胞數(shù)目至1×105個(gè)后，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。各組按分組干預(yù)后，斜貼孔壁每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度，評估細(xì)胞活力。

1.5 TUNEL 染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞經(jīng)爬片處理后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗2 遍，爬片經(jīng)固定、破膜、通透后，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，室溫孵育10 min 進(jìn)行平衡處理，將配制好的TdT 孵育緩沖液37℃避光孵育1 h，利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚進(jìn)行核染色，加抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.6 線粒體ATP 檢測心肌線粒體功能損傷情況

采用1.5 mL 離心管收集細(xì)胞，每管加入100 μL 熱蒸餾水，在95℃熱水浴中超聲震碎。細(xì)胞懸液置于沸水浴10 min，取出渦旋混勻30 s。4℃下1 500 r/min 離心5 min，取上清液，按照線粒體ATP試劑盒說明書檢測各組ATP 含量。

1.7 膜電位觀察線粒體功能改變

利用陽離子熒光染料JC-1 進(jìn)行線粒體膜電位檢測，將細(xì)胞接種于24 孔板，細(xì)胞處理后，將細(xì)胞與JC-1 工作液在37℃避光孵育30 min，隨后PBS洗2 次，熒光顯微鏡觀察紅色及綠色熒光，如膜電位較高時(shí)為紅色，而膜電位降低為綠色，紅綠熒光比值反映膜電位情況。

1.8 LC3Ⅱ免疫熒光染色檢測線粒體自噬活性

各組按分組干預(yù)后，給予細(xì)胞固定、通透、封閉、一抗孵育、FITC 標(biāo)記熒光二抗孵育、DAPI 染核后，于顯微鏡上觀察。采用Image J軟件進(jìn)行陽性標(biāo)記計(jì)數(shù)。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction technology，RT-PCR）檢測PINK1/Parkin 基因變化

使用1.5 mL 離心管收集細(xì)胞，每管加入1 mL Trizol 裂解液，提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA。將合成的cDNA 加入引物建立擴(kuò)增體系，按RT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃，15 s，60℃，60 s，72℃，40 s，進(jìn) 行35 個(gè)循環(huán)。采 用2-ΔΔCt方法處 理數(shù)據(jù)，并以GAPDH 作為內(nèi)參計(jì)算各組PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、LC3 mRNA 水平。

1.10 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測PINK1/Parkin 通路蛋白表達(dá)

使用1.5 mL 離心管收集心肌細(xì)胞，每管加入RIPA 裂解液提取總蛋白。使用BCA 法定量、SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜，4℃過夜孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX-Ⅳ抗體（稀釋度均為1∶500）及LC3 抗體（稀釋度為1∶1 000），次日洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（稀釋度為1∶1 000）繼續(xù)孵育90 min。掃描膠片，采用Image J 軟件進(jìn)行相對定量分析，各目的蛋白以COX-Ⅳ（內(nèi)參蛋白）校正。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞功能改變情況

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率比較，A 組＞D 組＞C 組＞E 組＞B 組（P＜0.05）；TUNEL 染色檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率比較，E 組＞B 組＞C 組＞D 組＞A 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞功能改變情況（）Table 1 Changes of cardiomyocyte function in each group（）

表1 各組心肌細(xì)胞功能改變情況（）Table 1 Changes of cardiomyocyte function in each group（）

2.2 各組線粒體功能改變情況

各組ATP 含量、膜電位比較，A 組＞D 組＞C 組＞B 組＞E 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組線粒體功能改變情況（）Table 2 Changes of mitochondrial function in each group（）

表2 各組線粒體功能改變情況（）Table 2 Changes of mitochondrial function in each group（）

2.3 各組細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)水平比較

各組LC3Ⅱ表達(dá)水平比較，E 組＞B 組＞C 組＞D組＞A 組（F=38.130，P＜0.05）。圖1。

圖1 各組心肌細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)水平Fig. 1 LC3Ⅱexpression level of cardiomyocytes in each group

2.4 各組細(xì)胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平

各組Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP及LC3Ⅱ/ⅠmRNA 相對表達(dá)量比較，E 組＞B 組＞C 組＞D 組＞A組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平（）Table 3 mRNA expression levels related to PINK1/Parkin pathway in cells of each group（）

表3 各組細(xì)胞PINK1/Parkin 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平（）Table 3 mRNA expression levels related to PINK1/Parkin pathway in cells of each group（）

2.5 各組PINK1/Parkin 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

各 組Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/ⅠmRNA 相對表達(dá)量比較，E 組＞B 組＞C 組＞D組＞A 組（F=16.824、8.167、23.291、14.622、6.571，P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組PINK1/Parkin 通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig. 2 Expression of PINK1/Parkin pathway-related proteins in each group

3 討論

心臟損傷是化療藥物的嚴(yán)重副作用之一，因此明確化療藥物心臟毒性的發(fā)生機(jī)制，對于降低化療藥物的不良影響以及治療效果的改善具有重要意義。5-FU 已廣泛應(yīng)用于癌癥治療，但5-FU 所導(dǎo)致的心肌毒性發(fā)生率較高，可達(dá)20%～100%。本研究結(jié)果顯示，與A 組相比，B 組的細(xì)胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均降低，凋亡率、LC3Ⅱ水平均升高，提示5-FU 可誘導(dǎo)心肌線粒體損傷，與既往研究［5］相符。5-Fu 導(dǎo)致的心肌毒性發(fā)病機(jī)制是多方面的，而線粒體損傷是一種機(jī)制假說，線粒體損傷會積累有缺陷的細(xì)胞器，導(dǎo)致線粒體自噬被啟動(dòng)［6］。自噬的激活通常被認(rèn)為具有心臟保護(hù)性，但過度自噬會造成心肌損傷以及細(xì)胞凋亡［7］。黃芪具有益衛(wèi)固表、補(bǔ)氣健脾作用，其在臨床已被應(yīng)用于高齡、慢性疾病以及術(shù)后放化療等患者［8］。AS-Ⅳ是黃芪的主要成分之一，研究表明［8］AS-Ⅳ通過激活一氧化氮合成酶產(chǎn)生一氧化氮，從而激活cGMP/PKG 信號通路，進(jìn)一步使糖原合成酶激酶-3 失活，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，發(fā)揮心肌線粒體保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后，心肌細(xì)胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均高于B 組，凋亡率、LC3Ⅱ水平均低于B 組，提示AS-Ⅳ可減輕5-Fu 誘導(dǎo)的心肌線粒體損傷，與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究一致。因線粒體自噬抑制劑Mdivi-1與AS-Ⅳ作用類似，而線粒體自噬激動(dòng)劑RAPA 增強(qiáng)了自噬的作用。本研究結(jié)果顯示，與B 組相比，D 組的細(xì)胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均更高，凋亡率、LC3Ⅱ水平均更低，與AS-Ⅳ干預(yù)結(jié)果相似；而與C 組相比，E 組的細(xì)胞活力、線粒體ATP 水平、膜電位均降低，凋亡率、LC3Ⅱ水平均升高，表明過度的自噬會造成心肌損傷以及細(xì)胞凋亡。

PINK1/Parkin 信號通路與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。既往研究表示［10-11］抑制線粒體自噬后可明顯減少升主動(dòng)脈縮窄引起的心肌纖維化。本研究結(jié)果顯示，E 組的PINK1/Parkin 信號通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)升高，表明線粒體自噬參與了5-Fu 誘導(dǎo)的心肌毒性，而且線粒體可呈現(xiàn)自噬過度狀態(tài)。當(dāng)自噬激活時(shí)，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇共價(jià)結(jié)合后形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜，故LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬水平［12］。再灌注階段自噬的激活與Beclin1 密切相關(guān)，Beclin1的表達(dá)受活性氧的誘導(dǎo)及抗凋亡蛋白Bcl-2 的負(fù)性調(diào)節(jié)，活性氧的積累會磷酸化Bcl-2 導(dǎo)致其從Bcelin1 復(fù)合體上分離出來，進(jìn)一步激活自噬，故再灌注階段自噬的激活會導(dǎo)致細(xì)胞損傷及凋亡的增高［13］。正常情況下的PINK1 表達(dá)極低，當(dāng)線粒體損傷時(shí)會阻礙PINK1 進(jìn)入線粒體內(nèi)的過程，使其積累在線粒體外膜TOM 復(fù)合物上，PINK1 的積累可造成引起泛素和Mfn2 磷酸化，并隨后募集E3 連接酶Parkin。Parkin 磷酸化可激活周圍泛素化的蛋白，通過與LC3 特異性結(jié)合，最終激活PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬［14］。此外，LAMP為溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合狀態(tài)［15］。本研究結(jié)果顯示，AS-Ⅳ干預(yù)后，Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP 及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白及基因表達(dá)均降低，證實(shí)AS-Ⅳ可通過抑制線粒體自噬PINK1/Parkin 通路過度激活，維持自噬穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而對心肌線粒體數(shù)量與質(zhì)量的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起到維持作用。

綜上，AS-Ⅳ可能通過抑制線粒體自噬PINK1/Parkin 通路過度激活，減輕5-Fu 誘導(dǎo)的心肌線粒體損傷，為AS-Ⅳ治療心肌損傷提供理論依據(jù)。