劉玨， 謝希婷，2， 沈樹(shù)浩， 王穎薇， 穆亞君， 陳劍， 周清△

（1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630；2深圳深東愛(ài)爾眼科醫(yī)院，廣東 深圳 518116）

葡萄膜炎是多發(fā)于青壯年的常見(jiàn)致盲性眼病，約2/3的葡萄膜炎患者出現(xiàn)慢性視力損傷［1］，在發(fā)展中國(guó)家致盲率高達(dá)25%［2］。自身免疫因素是非感染性葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)［3］，目前治療葡萄膜炎較為普遍的療法是長(zhǎng)期全身使用皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物或免疫抑制劑，治療效果不穩(wěn)定，而治療引發(fā)的眼部并發(fā)癥及全身副作用限制了此類(lèi)藥物的應(yīng)用［4］，開(kāi)發(fā)安全有效的治療方法是葡萄膜炎研究領(lǐng)域重要而緊迫的社會(huì)目標(biāo)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，可以通過(guò)影響全身Th細(xì)胞和Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子的分泌［5］，減輕EAU的嚴(yán)重程度，是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis， EAU）動(dòng)物模型治療方案中的突破點(diǎn)［6］。但在局部微環(huán)境下，MSCs存在異常分化［7］、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移［8］以及引起增殖性視網(wǎng)膜病變［9］等作用。MSCs外分泌蛋白具有MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的生物活性，同時(shí)避免了MSCs的副作用［10］，可作為取代MSCs的治療方案。目前針對(duì)MSCs外分泌蛋白在EAU模型中的免疫調(diào)節(jié)作用，以及MSCs外分泌蛋白是否影響眼球“免疫赦免防線(xiàn)”——血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retina barrier， BRB）的相關(guān)研究仍有許多未知區(qū)域，發(fā)掘探討這些內(nèi)容可為EAU模型的非細(xì)胞治療方案提供參考。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腹腔注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外分泌蛋白（human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived secretome， hUMSCs-S）對(duì)EAU模型大鼠進(jìn)行治療，通過(guò)檢測(cè)眼內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial，RPE）緊密連接蛋白及血清中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，探討 hUMSCs-S是否可以干預(yù)EAU的發(fā)生和發(fā)展其可能的作用機(jī)制，以期為EAU的治療提供補(bǔ)充依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

6~8周齡SPF級(jí)雌性健康Lewis大鼠72只，體重160~180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（質(zhì)量合格證編號(hào)No. 99410000001387； No.11400700386749），許可證號(hào)為SYXK（粵）2017-0174，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)編號(hào)為No. 00220089和 No.00229138；實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)過(guò)程經(jīng)暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批及全程監(jiān)督，批準(zhǔn)編號(hào)為IACUC-20190303-04和IACUC-20190705-02。

2 主要試劑

提取原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUMSCs），培養(yǎng)至P3代收集提取hUMSCs-S。該部分實(shí)驗(yàn)由暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)執(zhí)行，hUMSCs-S由暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取鑒定并惠贈(zèng)。

視網(wǎng)膜光感受器間維生素A類(lèi)結(jié)合蛋白（interphotoreceptor retino-binding protein， IRBP）由上海生物工程有限公司合成；弗氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant， CFA）購(gòu)自Sigma；氨基甲酸乙酯購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；眼球固定液購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素17（in-terleukin 17， IL-17）/IL-17A ELISA Kit購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco，蘇木素-伊紅染液購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；CD3抗體及緊密連接蛋白ZO-1抗體購(gòu)自Abcam；PBS磷酸緩沖液干粉購(gòu)自Biosharp。

3 主要方法

3.1 hUMSC-S的提取及鑒定 使用組織塊消化法提取hUMSC-S，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至P3代，24 h后收集上清液，1 000 kD透析袋密封上清液，超純水中透析，每3 h更換1次透析外液，透析24 h后用0.22 μm過(guò)濾器除菌并收集透析液。提取外分泌蛋白后用BCA法測(cè)試其蛋白濃度，Zeta電位儀檢測(cè)Zeta電位。隨機(jī)抽取10批次的外分泌蛋白混合后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型制作 排除全身及眼部異常，動(dòng)物按序編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照（control， CTRL）組、EAU模型組及hUMSCs-S治療組，每組24只大鼠。參照Caspi的方法建立EAU動(dòng)物模型并制備造模藥物［11］，IRBP與CFA（含2.5 g/L結(jié)核分枝桿菌）混合震蕩1 min制成乳液（0.2 mL含50 μg IRBP ）。EAU模型組及hUMSCs-S治療組組：每只大鼠尾根部及雙側(cè)大腿皮下注射乳液0.2 mL（尾部注射0.1 mL、雙側(cè)大腿皮下注射各0.05 mL），CTRL組大鼠相同部位注射等體積PBS緩沖液；hUMSCs-S治療組大鼠在免疫誘導(dǎo)的同時(shí)按100 μg/100 g體重腹腔注射hUMSCs-S懸液，CTRL組和EAU模型組腹腔注射等體積PBS緩沖液。

3.3 眼前段Caspi評(píng)分 建模后每日在裂隙燈顯微鏡下觀察并拍攝記錄大鼠眼前段情況，共觀察21 d，根據(jù)Caspi評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］評(píng)價(jià)眼前段炎癥程度。

3.4 眼球組織切片HE染色及病理學(xué)觀察 于第7、14和21天隨機(jī)抽取3組大鼠各8只，20%氨基甲酸乙酯按1.5 mL/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，待充分麻醉后斷頸處死大鼠，Ⅲ型安爾碘消毒眼周皮膚，用無(wú)菌眼科顯微器械分離眼球與瞼結(jié)膜等周?chē)M織，剪斷眼球遠(yuǎn)端視神經(jīng)及血管，完整摘除雙側(cè)眼球，固定并制成石蠟切片行HE染色，根據(jù)Caspi組織病理學(xué)分級(jí)評(píng)分［12］，用顯微鏡（Leica DM4000）拍攝全眼球切片，每張切片選取前房睫狀突附近3個(gè)視野進(jìn)行觀察，采用ImageJ軟件對(duì)前房浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍攝及計(jì)數(shù)分析由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科專(zhuān)業(yè)研究人員同時(shí)操作。

3.5 免疫組化檢測(cè) CD3+T細(xì)胞及免疫熒光檢測(cè)ZO-1蛋白 眼球組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、雙氧水處理、血清封閉后，Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育50 min，DAB顯色、蘇木素染核、脫水封片，鏡下觀察棕黃色著色細(xì)胞為CD3陽(yáng)性表達(dá)。各組大鼠眼球石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)、血清封閉后，滴加ZO-1 Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h、DAPI染細(xì)胞核后封片，-20 ℃避光保存，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.6 ELISA檢測(cè)外周血IL-10、IL-17水平 第14天時(shí)隨機(jī)抽取3組大鼠，先進(jìn)行上述3.4步驟取材，隨后開(kāi)腹采集腹主動(dòng)脈血3~5 mL，將血液標(biāo)本置于37 ℃水浴鍋中孵育1 h，2 000 ×g離心10 min后取上清，釆用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-10、IL-17水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，EAU模型組與hUMSCs-S治療組大鼠眼部炎癥Caspi評(píng)分采用兩樣本t檢驗(yàn)分析，血清中IL-10、IL-17表達(dá)量差異比較使用單因素方差檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 hUMSCs-S蛋白質(zhì)譜分析鑒定

BCA蛋白定量檢測(cè)結(jié)果顯示有血清存在條件下提取液中的蛋白濃度約為3.690 mg/mL，無(wú)血清條件下提取的蛋白濃度為0.598 mg/mL。蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示hUMSC-S中含蛋白質(zhì)共379種，其中包括ICOS配體、vasorin、protein sidekick-2、moesin、retinal dehydrogenase-1、caspase recruitment domain-containing protein 16及各型免疫球蛋白等與免疫反應(yīng)相關(guān)和視網(wǎng)膜損傷及修復(fù)過(guò)程相關(guān)的蛋白成分。

2 眼前段炎癥觀察及Caspi評(píng)分

CTRL組大鼠眼前節(jié)表現(xiàn)為角膜透明，虹膜紋理清晰，虹膜血管無(wú)明顯充血擴(kuò)張，瞳孔等大等圓，對(duì)光反射靈敏，眼底紅光反射存在，見(jiàn)圖1A：a~d。EAU組造模后第7天開(kāi)始可觀察到虹膜表面血管擴(kuò)張、充血（圖1A：f）；第14天眼前段炎癥加重達(dá)高峰，虹膜表面血管進(jìn)一步擴(kuò)張、充血，房水混濁，瞳孔區(qū)虹膜后粘連或閉鎖（圖1A：g），眼底紅光反射變暗，嚴(yán)重者出現(xiàn)前房積血；第16~18天眼前段炎癥減輕，造模后第21天前段炎癥消退，個(gè)別模型可見(jiàn)虹膜血管輕度充血（圖1A：h）。

Figure 1. Anterior chamber performance and Caspi score of the rats in the 3 groups. A： anterior chamber images at various time points： the day of modeling （D0）， the 7th day （D7）， the 14th day （D14）， and the 21st day （D21）. Vascular dilation and congestion on the surface of the iris could be observed since D7 after modeling in the EAU group （f）. Blood vessels on the surface of the iris were further dilated and congested， with cloudy aqueous humor， and atretopsia on the D14 （g）. hUMSCs-S group exhibited less inflammation in the anterior segment than EAU group， with onset of congestion and dilation of iris vessels on D7 （j）， and mild turbidity of aqueous humor on D14 （k）. The anterior segment basically returned to normal on D21 （h， l）. Scale bar=2 mm. B： anterior chamber Caspi score of rats in EAU and hUMSCs-S group. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0.01 vs huMSCs-S group.圖1 3組大鼠眼前段表現(xiàn)及眼前段Caspi評(píng)分

hUMSCs-S治療組眼前段炎癥表現(xiàn)較EAU模型組輕， 第7~10天起病，第13~14天病變達(dá)高峰，觀察到虹膜血管充血、擴(kuò)張，房水混濁；其后炎癥逐漸消退，至第21時(shí)眼前節(jié)基本恢復(fù)正常，見(jiàn)圖1 A：i-l。

EAU模型組及hUMSCs-S治療組大鼠前房Caspi評(píng)分，采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EAU組眼前段Caspi評(píng)分均數(shù)在第11~17天均高于hUMSCs-S組（P<0.05），見(jiàn)圖1B。

3 眼球組織切片HE染色及組織病理學(xué)分析

觀察第7天、第14天、第21天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠眼球組織石蠟切片HE染色情況，其前房、虹膜睫狀體、視網(wǎng)膜病理學(xué)改變、前房及玻璃體炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況與眼前段炎癥改變時(shí)間段及炎癥程度一致。

CTRL組虹膜、視網(wǎng)膜及前房結(jié)構(gòu)完整、分層有序，無(wú)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A：a、d、g）。EAU組在第7天出現(xiàn)虹膜及視網(wǎng)膜水腫、前房和玻璃體腔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第12~14天達(dá)高峰，虹膜血管擴(kuò)張、充血，虹膜及前房大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A：b、h）、視網(wǎng)膜分層結(jié)構(gòu)紊亂（圖2A：e）；第21天病變消退，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，極少數(shù)模型遺留視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂。hUMSCs-S組虹膜及視網(wǎng)膜組織輕度水腫（圖2A：c、f）、虹膜及前房少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A：c、i），破壞程度較EAU組明顯減輕，第21天虹膜及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均恢復(fù)正常。第14天時(shí)EAU模型組視網(wǎng)膜損傷Caspi評(píng)分均數(shù)高于hUMSCs-S治療組（P<0.01），見(jiàn)圖2B。EAU組前房滲出細(xì)胞數(shù)明顯高于CTRL組和hUMSCs-S組（P<0.05），見(jiàn)圖2C。

Figure 2. HE staining of iris， retina and anterior chamber， retinal Caspi score and anterior chamber infiltrating inflammatory cells onthe 14th day after modeling of three groups of rats. A： HE staining of iris， retina and anterior chamber. Iris， retina and anterior chamber were intact， stratified and orderly without edema or inflammatory cell infiltration in the CTRL group （a， d，g）. In the EAU model group， edema of the iris and retina， infiltration of a large number of inflammatory cells in the iris，anterior chamber， dilation and congestion of the iris blood vessels， and disorders of retinal stratification were observed （b，e， h）. In the hUMSCs-S group ， there was mild edema of iris and retina tissues as well as a small amount of inflammatory cell infiltration in iris and anterior chamber （c， f， i）. Scale bar=100 μm. B： statistical results of retinal tissue Caspi scores between the EAU group and the hUMSCs-S group at days 7， 14 and 21. C： infiltrating cells of the anterior chamber in the three groups at D14 were analyzed. Mean±SD. n=8. *P<0.05， **P<0.01 vs CTRL group； ##P<0.01 vs EAU group .圖2 造模后第14天3組大鼠虹膜、視網(wǎng)膜及前房組織HE染色結(jié)果，視網(wǎng)膜Caspi評(píng)分及前房滲出炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)

4 眼球免疫組化檢測(cè)CD3+ T細(xì)胞及免疫熒光檢測(cè)ZO-1蛋白

CTRL組虹膜睫狀體及視網(wǎng)膜可見(jiàn)少量CD3+T細(xì)胞表達(dá)；EAU模型組虹膜睫狀體有大量CD3+T細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，視網(wǎng)膜的外核層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層及節(jié)細(xì)胞層及脈絡(luò)膜層均可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。hUMSCs-S治療組虹膜睫狀體及視網(wǎng)膜的CD3+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)較EAU組明顯減少。

CTRL組ZO-1蛋白在視網(wǎng)膜明顯表達(dá)；EAU模型組在第14天時(shí)視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜的ZO-1明顯減少，以視網(wǎng)膜內(nèi)層及色素上皮層缺失明顯；hUMSCs-S治療組視網(wǎng)膜內(nèi)層ZO-1表達(dá)較CTRL減少，但仍多于EAU模型組，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Immunohistochemistry staining of CD3+ T-lymphocytes and immunofluorescence staining of ZO-1 in iris and retina of the three groups at D14 after modeling. A small amount of CD3+ T cells were observed in iris，ciliary body and retina in CTRL group （a， d）. In EAU group， a large number of CD3+ T cells were positively expressed in the iris， ciliary body， anterior chamber and the retina （b， e）. The expression of CD3+ T lymphocytes in iris ciliary body and retina of hUMSCs-S group was significantly reduced compared with EAU group （c， f）. ZO-1 protein was obviously expressed in retina in CTRL group （g）. In the EAU group， ZO-1 levels in retina decreased significantly，especially in the inner retina and retinal pigment epithelium （h）. The expression of ZO-1 in the inner retina of hUMSCs-S was lower than that of CTRL， but still higher than that of EAU group （i）.圖3 造模后第14天3組大鼠虹膜、視網(wǎng)膜CD3+ T淋巴細(xì)胞免疫組化染色及ZO-1免疫熒光染色結(jié)果

5 ELISA檢測(cè)大鼠外周血IL-17、IL-10濃度

采用ELISA試劑盒對(duì)3組大鼠第14天時(shí)外周血中IL-17、IL-10水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，EAU模型組外周血清中IL-17表達(dá)組較CTRL組和hUMSCs-S治療組均增加（P<0.01），見(jiàn)圖4A； EAU模型組血清中IL-10表達(dá)水平高于CTRL組（P<0.01），hUMSCs-S治療組血清中IL-10表達(dá)水平高于EAU模型組（P<0.05），見(jiàn)圖4B。

Figure 4. Concentrations of IL-17 （A） and IL-10 （B） in peripheral blood of rats in 3 groups at D14 after modeling.mean±SD. n=8. **P<0.01 vs CTRL group； #P<0.05，##P<0.01 vs EAU group.圖4 造模后第14天3組大鼠外周血中IL-17和IL-10濃度

討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用IRBP聯(lián)合弗氏完全佐劑成功誘導(dǎo)EAU大鼠模型，在誘導(dǎo)免疫的同時(shí)給予腹腔注射hUMSCs-S，結(jié)果顯示腹腔注射hUMSCs-S可使EAU大鼠眼前段炎癥緩解、前房浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜損傷程度減輕，證明腹腔注射hUMSCs-S對(duì)大鼠EAU治療有效。

BRB的完整性與眼內(nèi)炎癥反應(yīng)程度關(guān)系密切，EAU時(shí)BRB被破壞，白細(xì)胞黏附，血管通透性增加，炎癥細(xì)胞及相關(guān)因子透過(guò)屏障浸潤(rùn)至視網(wǎng)膜，引起視網(wǎng)膜組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管生成。BRB的完整性和眼部微血管通透性的維持主要依賴(lài)于緊密連接蛋白的表達(dá)，即ZO-1緊密連接蛋白，其表達(dá)可反應(yīng)BRB的完整性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ZO-1蛋白在CTRL組大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)明顯；在造模第14天時(shí)EAU組大鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜相應(yīng)區(qū)域淡染甚至無(wú)染色、CD3+T細(xì)胞大量表達(dá)；hUMSCs-S治療組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層ZO-1表達(dá)較CTRL組減少，較EAU模型組表達(dá)量增加，表明腹腔注射hUMSCs-S可通過(guò)減輕EAU模型大鼠視網(wǎng)膜即脈絡(luò)膜ZO-1蛋白破壞程度維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性。

研究表明，Th17細(xì)胞分泌的IL-17在EAU模型動(dòng)物的虹膜睫狀體、視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜組織中均有表達(dá)，其表達(dá)量與病變程度正相關(guān)［13］，而作為EAU中Th1分泌的主要促炎因子，IFN-γ基因敲除鼠仍可由IL-17誘導(dǎo)發(fā)生EAU［14］，IL-17特異性抗體可明顯減輕EAU癥狀［15］；說(shuō)明IL-17是EAU發(fā)病機(jī)制中更為重要的因子。現(xiàn)有對(duì)MSCs及其外分泌蛋白治療EAU模型的機(jī)制研究多集中在抑制眼球局部T細(xì)胞增殖分化，減少I(mǎi)L-17的表達(dá)，上調(diào)Treg細(xì)胞占比等方面；IL-17在EAU病理機(jī)制中的作用還包括破壞ARPE-19細(xì)胞（人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞）的ZO-1緊密連接蛋白，刺激其分泌炎癥介質(zhì)［16］，吸引活化白細(xì)胞進(jìn)一步加重?fù)p傷［17］。目前應(yīng)用MSCs-S治療EAU的給藥方式一般采取眼周局部注射或玻璃體腔注射。在本實(shí)驗(yàn)中，第14天時(shí)EAU模型組大鼠外周血中促炎因子IL-17的表達(dá)水平較CTRL組增加，經(jīng)腹腔注射hUMSCs-S的EAU大鼠外周血IL-17表達(dá)水平較EAU組下降，但與CTRL組比較仍有增加。

IL-10是調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞分泌的抑炎因子。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)MSC分泌的微囊泡處理的激活狀態(tài)BV2細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞表達(dá)抑炎因子IL-10和TGF-β總量增加，同時(shí)炎性細(xì)胞因子（TNF-α和IL-1β）的表達(dá)減少［18］；MSCs-S治療可顯著提高神經(jīng)退行性病變［19］及慢性炎性疾病模型（如多發(fā)性硬化［20］、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［21］和1型糖尿病［22］）動(dòng)物體內(nèi)損傷組織、外周淋巴器官及血清中表達(dá)IL-10的Treg細(xì)胞比例；細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs-S抑炎作用的主要機(jī)制為通過(guò)抑制漿細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Breg細(xì)胞表達(dá)IL-10，進(jìn)而減輕炎癥［23］。外周血中IL-10表達(dá)的調(diào)控在EAU治療中的作用未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)探討了hUMSCs-S對(duì)EAU模型外周血中IL-10的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，與腹腔注射PBS的EAU組相比，腹腔注射hUMSCs-S組大鼠外周血中抑炎因子IL-10表達(dá)明顯升高。提示腹腔注射hUMSCs-S可提高外周血中抑炎因子IL-10的表達(dá)。

綜上所述，在IRBP聯(lián)合弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的EAU大鼠模型中，眼球內(nèi)ZO-1緊密連接蛋白的表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致BRB的破壞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎癥的產(chǎn)生，腹腔注射hUMSC-S可以通過(guò)減少ZO-1蛋白的破壞達(dá)到維持BRB穩(wěn)定性、減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。腹腔注射hUMSCs-S后EAU大鼠外周血中炎癥因子IL-17表達(dá)下降、抑炎因子IL-10的表達(dá)增加與EAU緩解程度一致，說(shuō)明hUMSCs-S除能夠有效穿透組織和生物屏障，在眼球局部發(fā)揮作用外，還可能通過(guò)在全身發(fā)揮抑炎、調(diào)節(jié)免疫作用同步發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥免疫的作用。使用hUMSC-S可以有效地抑制模型大鼠EAU炎癥反應(yīng)。在實(shí)際應(yīng)用中，相對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源緊缺及導(dǎo)入機(jī)體方式不完善等限制，hUMSC-S具有來(lái)源廣泛，分離提取技術(shù)成熟，獲取存儲(chǔ)較易的優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)的完成為異源性MSCs外分泌蛋白全身給藥治療大鼠EAU提供了證據(jù)，腹腔注射hUMSCs-S有潛力成為EAU干細(xì)胞治療中重要的補(bǔ)充手段。