劉寶寶 賈晶瑩 孟桂智 劉祖江 馬 云 蔡小艷*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類在生物中高度保守的、長度為18～25個(gè)核苷酸(nt)的單鏈非編碼小分子RNA。早在1993年,試驗(yàn)驗(yàn)證了秀麗隱桿線蟲miRNA lin-4的堿基可以與lin-14基因的3′非翻譯區(qū)(UTR)的堿基互補(bǔ)配對結(jié)合,從而下調(diào)基因lin-14的翻譯,這一研究成果初步揭示了miRNA發(fā)揮調(diào)控作用的方式,即與靶基因結(jié)合抑制靶基因翻譯或降解靶mRNA,從而降低靶基因表達(dá)水平,影響基因功能[1]。miRNA的發(fā)現(xiàn)打破了之前對于基因調(diào)節(jié)生物過程的傳統(tǒng)認(rèn)知,miRNA及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制成為分子研究的一大熱點(diǎn)。越來越多的研究表明,miRNA不僅可以靶向調(diào)控生物體內(nèi)源性基因表達(dá),還可以跨界調(diào)節(jié)其他物種體內(nèi)的生物發(fā)生過程。如干燥堅(jiān)果中的miR159a和miR156c通過靶向腫瘤壞死因子受體超家族成員1A(TNFRSF1A)mRNA,抑制白色和棕色脂肪細(xì)胞中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路,進(jìn)而減少小鼠脂肪組織的炎癥,增加小鼠棕色和皮下脂肪庫的積累[2]。經(jīng)典的跨界調(diào)控有水稻來源的miR168通過靶向小鼠肝臟內(nèi)的低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)減緩血液中低密度脂蛋白的清除,且植物源性miR156a被發(fā)現(xiàn)存在于牛血液中[3]。苜蓿是奶牛高乳蛋白的重要保障,苜蓿miR156a(mtr-miR156a)是隨苜蓿被采食進(jìn)入奶牛體內(nèi)的初級代謝產(chǎn)物之一,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其存在于奶牛血清和乳清外泌體中,但其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)中乳蛋白合成的調(diào)控及機(jī)制尚不清楚,這阻礙了進(jìn)一步高效利用苜蓿養(yǎng)分提升奶牛乳蛋白的進(jìn)程。因此,本研究以mtr-miR156a為主要研究對象,并借助生物信息學(xué)分析聯(lián)合現(xiàn)代分子手段,對“mtr-miR156a-BMECs-酪蛋白基因表達(dá)”進(jìn)行研究,揭示mtr-miR156a在BMECs的靶基因及對乳蛋白合成的調(diào)控作用,為后續(xù)進(jìn)一步開展mtr-miR156a調(diào)控奶牛乳蛋白的分子調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

BMECs、psiCHECK-2載體和人胚胎腎細(xì)胞293T(HEK-293T)來自寧夏大學(xué)寧夏反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期保存。

1.1.2 主要試劑

TRIzol(TaKaRa,日本)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊,中國)、熒光定量試劑盒(諾唯贊,中國)、限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ(TaKaRa,日本)、DNA片段純化回收試劑盒(天根,中國)、感受態(tài)細(xì)胞(天根,中國)、質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA,美國)、DMEM/F12培養(yǎng)基(雅酶,中國),胎牛血清(BI,澳大利亞)、雙熒光素酶報(bào)告試劑盒(Promega,美國)、mtr-miR156a mimic和mimic NC序列(通用生物,中國)、牛α酪蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(茁彩生物,中國)、牛β酪蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(茁彩生物,中國)和牛κ酪蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(茁彩生物,中國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞RNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol裂解法提取過表達(dá)mtr-miR156a 48 h后BMECs的總RNA,并置于-80 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,利用多功能酶標(biāo)儀檢測RNA的吸光度(OD)值以及濃度。選取OD值在1.8～2.0,并且凝膠電泳完整的RNA樣本,按照cDNA第1鏈合成試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并置于-20 ℃保存。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

從生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan提供的?；蛐畔⒁约奥?lián)川生物云平臺(tái)(https://www.omicstudio.cn/index)進(jìn)行mtr-miR156a靶基因預(yù)測。對靶基因進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,篩選出參與調(diào)控乳蛋白合成相關(guān)信號通路。在預(yù)測到的所有相關(guān)信號通路中篩選出mtr-miR156a調(diào)控乳蛋白合成相關(guān)的靶基因,并在RNAhybrid在線網(wǎng)站上進(jìn)行比對,最終篩選出符合自由能閾值的靶基因。

1.2.3 3′ UTR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增

絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa調(diào)節(jié)亞基delta亞型(PPP2R5D)和磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位2(PIK3R2)基因3′ UTR序列通過NCBI網(wǎng)站檢索下載。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)包含mtr-miR156a種子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的3′ UTR擴(kuò)增引物,并分別在上游、下游加入XhoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn),引物信息見表1,由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

表1 3′ UTR引物信息Table 1 3′ UTR primer information

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL,染料10 μL,上游、下游引物各1 μL,加入ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)全至20 μL。反應(yīng)程序如下:95 ℃,3 min;95 ℃,15 s;60 ℃,20 s;35個(gè)循環(huán);72 ℃,60 s;72 ℃,5 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像儀中選擇有目的片段的凝膠塊,利用DNA片段純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.4 載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ對擴(kuò)增片段與psiCHECK-2載體進(jìn)行酶切,取純化后的酶切產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。構(gòu)建PPP2R5D和PIK3R2基因與psiCHECK-2野生型(PPP2R5D-Wt和PIK3R2-Wt)載體;突變型(PPP2R5D-Mut和PIK3R2-Mut)載體構(gòu)建方法同上,通過突變結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增引物構(gòu)建突變型載體,對構(gòu)建的野生型和突變型載體送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序檢測。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測

將mtr-miR156a mimic和mimic NC分別與構(gòu)建好的基因野生型和突變型載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293T,轉(zhuǎn)染試劑為Lipo 3000,轉(zhuǎn)染方法與說明書一致。轉(zhuǎn)染48 h后,按照雙熒光素酶試劑盒說明書處理細(xì)胞,使用多功能酶標(biāo)儀對細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

通過NCBI官網(wǎng)檢索PPP2R5D和PIK3R2基因和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路中相關(guān)基因以及酪蛋白基因的序列,使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)熒光定量上游和下游引物及內(nèi)參引物,并通過NCBI在線網(wǎng)站進(jìn)行單一性比對,以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因,引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成,引物信息見表2。

表2 qRT-PCR引物信息Table 2 qRT-PCR primer information

表3 候選靶基因信息Table 3 Candidate target gene information

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

將mtr-miR156a mimic和mimic NC在BMECs中過表達(dá)48 h后,按照ELISA檢測試劑盒說明書處理樣品,通過多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,分析過表達(dá)mtr-miR156a后BMECs培養(yǎng)液上清液中酪蛋白的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組數(shù)據(jù)至少設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行表示,使用GraphPad Prism 7軟件的t檢驗(yàn)對qRT-PCR結(jié)果和雙熒光素酶結(jié)果作圖并進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析預(yù)測mtr-miR156a靶基因

通過在線生物學(xué)軟件分析預(yù)測mtr-miR156a在奶牛體內(nèi)靶基因,并對預(yù)測的靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),靶基因主要富集在脂肪酸降解通路、Ras信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,還包括富集在PI3K/Akt/mTOR信號通路,其中預(yù)測候選靶基因數(shù)量有28個(gè),表明mtr-miR156a可能對奶牛體內(nèi)脂肪酸降解、細(xì)胞生長和分化以及蛋白質(zhì)合成和分泌等都具有調(diào)控作用。

2.2 mtr-miR156a調(diào)控蛋白質(zhì)合成相關(guān)靶基因的篩選

在預(yù)測到的所有靶基因中篩選出mtr-miR156a調(diào)控蛋白質(zhì)合成相關(guān)的17個(gè)靶基因,包括熱休克蛋白90α家族B類成員1(HSP90AB1)、促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2(EPHA2)、白細(xì)胞介素-4受體(IL4R)、PIK3R2、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基β4(GNB4)、Janus激酶1(JAK1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白亞基β5(GNB5)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、PPP2R5D、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)、MET原癌基因受體酪氨酸激酶(MET)、血小板衍生的生長因子亞基A(PDGFA)、成纖維細(xì)胞生長因子5(FGF5)、KIT配體(KITLG)、血小板反應(yīng)蛋白2(THBS2)、Janus激酶3(JAK3)和Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(RAC1),然后在RNAhybrid在線網(wǎng)站上進(jìn)行比對,最終篩選出8個(gè)候選靶基因3′ UTR與mtr-miR156a種子區(qū)堿基全部結(jié)合且符合自由能閾值的靶基因,預(yù)測這些靶基因可能參與乳蛋白合成代謝。

2.3 候選靶基因PPP2R5D和PIK3R2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖1所示,通過PCR儀擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳以及在凝膠成像儀中顯示后,加了Xho Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)的PPP2R5D和PIK3R2產(chǎn)物長度分別為269和340 bp。經(jīng)過DNA片段純化回收、雙酶切、載體連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化后,菌液PCR如圖2所示,PPP2R5D在左側(cè)第2、3、4和5泳道的片段大小為555 bp左右,與目的片段大小一致;PIK3R2在右側(cè)第1、3和4泳道的片段大小為626 bp左右,與目的片段大小一致,因此使用相對應(yīng)編號的新鮮菌液送檢進(jìn)行DNA堿基測序。測序結(jié)果如圖3和圖4所示,通過DNAMAN 5.2.9軟件進(jìn)行序列比對分析發(fā)現(xiàn),PPP2R5D-2的測序結(jié)果與PPP2R5D的3′ UTR序列一致,PIK3R2-1的測序結(jié)果與PIK3R2的3′ UTR序列一致,圖中用紅色虛框標(biāo)注的是mtr-miR156a種子區(qū)與mRNA的結(jié)合位點(diǎn),表明PPP2R5D和PIK3R2野生型重組質(zhì)粒(psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt和psiCHECK-2-PIK3R2-Wt)構(gòu)建成功。構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒時(shí)將PPP2R5D和PIK3R2結(jié)合位點(diǎn)堿基TTCTGTC突變?yōu)镃CAGACG,如圖5和圖6所示。

第1泳道是DNA marker,第2泳道是PPP2R5D的3′ UTR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖,第3泳道是PIK3R2的3′ UTR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。Lane 1 was DNA marker, lane 2 was agarose gel electrophoretogram of 3′ UTR amplification product of PPP2R5D, and lane 3 was agarose gel electrophoretogram of 3′ UTR amplification product of PIK3R2.圖1 PCR擴(kuò)增3′ UTR序列瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 3′ UTR sequence amplified by PCR

第1行為PPP2R5D的3′ UTR序列,第2行為psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt測序序列,第3行為共同序列。The first line was PPP2R5D 3′ UTR sequences, the second line was psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt sequences, and the third line was consensus sequences.圖3 psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt與PPP2R5D的3′ UTR序列對比圖Fig.3 Comparison of 3′ UTR sequences of psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt and PPP2R5D

第1行為PIK3R2的3′ UTR序列,第2行為psiCHECK-2-PIK3R2-Wt測序序列,第3行為共同序列。The first line was PIK3R2 3′ UTR sequences, the second line was psiCHECK-2-PIK3R2-Wt sequences, and the third line was consensus sequences.圖4 psiCHECK-2-PIK3R2-Wt與PIK3R2的3′ UTR序列對比圖Fig.4 Comparison of 3′ UTR sequences of psiCHECK-2-PIK3R2-Wt and PIK3R2

5′ UTR:5′ 非翻譯區(qū) 5′ untranslated region;CDS:編碼DNA序列 coding DNA sequence;3′ UTR:3′ 非翻譯區(qū) 3′ untranslated region;mfe:最小自由能 minimum free energy。圖6同 the same as Fig.6。圖5 mtr-miR156a與PPP2R5D結(jié)合位點(diǎn)和自由結(jié)合能值以及PPP2R5D突變型載體突變位點(diǎn)Fig.5 Binding sites and free binding energy values of mtr-miR156a and PPP2R5D as well as mutation sites of PPP2R5D mutant vector

圖6 mtr-miR156a與PIK3R2結(jié)合位點(diǎn)和自由結(jié)合能值以及PIK3R2突變型載體突變位點(diǎn)Fig.6 Binding sites and free binding energy values of mtr-miR156a and PIK3R2 as well as mutation sites of PIK3R2 mutant vector

2.4 mtr-miR156a與PPP2R5D、PIK3R2結(jié)合位點(diǎn)的分析鑒定

如圖7所示,在所有篩選出來的靶基因中,PPP2R5D和PIK3R2與mtr-miR156a的種子區(qū)堿基全部結(jié)合,且自由結(jié)合能值較大,分別為-20.9和-26.3 kcal/moL(1 kcal≈4.184 kJ),因此選擇PPP2R5D和PIK3R2進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告檢測。

A:mtr-miR156a靶向結(jié)合PPP2R5D后雙熒光素酶活性檢測結(jié)果;B:mtr-miR156a靶向結(jié)合PIK3R2后雙熒光素酶活性檢測結(jié)果。A: assay results of dual-luciferase activity after mtr-miR156a targeted binding to PPP2R5D: B: assay results of dual-luciferase activity after mtr-miR156a targeted binding to PIK3R2.*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,ns表示無顯著差異(P>0.05)。下圖同。* mean P<0.05, ** mean P<0.01, *** mean P<0.001, and ns mean no significant difference (P>0.05). The same as below.圖7 mtr-miR156a與PPP2R5D和PIK3R2基因雙熒光素酶活性檢測結(jié)果Fig.7 Detection results of dual-luciferase activity of mtr-miR156a with PPP2R5D and PIK3R2 genes

2.5 mtr-miR156a與候選靶基因靶向關(guān)系的鑒定

利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證mtr-miR156a與PPP2R5D和PIK3R2的靶向關(guān)系。如圖7-A所示,與psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt與mimic NC共轉(zhuǎn)染相比,將psiCHECK-2-PPP2R5D-Wt與mtr-miR156a mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T,熒光素酶活性降低了大約40%(P<0.01);而與psiCHECK-2-PPP2R5D-Mut與mimic NC共轉(zhuǎn)染相比,psiCHECK-2-PPP2R5D-Mut與mtr-miR156a mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T,熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。如圖7-B所示,與psiCHECK-2-PIK3R2-Wt與mimic NC共轉(zhuǎn)染相比,將psiCHECK2-PIK3R2-Wt與mtr-miR156a mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T,熒光素酶活性降低了大約40%(P<0.01);而與psiCHECK-2-PIK3R2-Mut與mimic NC共轉(zhuǎn)染相比,psiCHECK-2-PIK3R2-Mut和mtr-miR156a mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T,熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。

2.6 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs中PPP2R5D和PIK3R2表達(dá)的影響

如圖8所示,進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在BMECs中過表達(dá)mtr-miR156a后,PPP2R5D和PIK3R2相對表達(dá)量都極顯著下降(P<0.01)。這表明在BMECs中mtr-miR156a可以特異性靶向結(jié)合PPP2R5D和PIK3R2并下調(diào)其表達(dá)。

PPP2R5D:絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa調(diào)節(jié)亞基delta亞型 serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit delta isoform;PIK3R2:磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位2 phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 2。圖8 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs中PPP2R5D和PIK3R2表達(dá)的影響Fig.8 Effects of overexpression of mtr-miR156a on expression of PPP2R5D and PIK3R2 in BMECs

2.7 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs乳蛋白合成通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖9所示,在BMECs中過表達(dá)mtr-miR156a,與mimic NC處理相比,mtr-miR156a mimic處理極顯著降低丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)、核糖體蛋白S6激酶beta-1(S6K1)、真核翻譯起始因子4B(eIF4B)、核糖體蛋白S6(RPS6)、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物亞基2(TSC2)、腦富集Ras同源物(RHEB)、mTOR和真核翻譯起始因子4E(eIF4E)相對表達(dá)量(P<0.01),極顯著提高蛋白激酶B1(Akt1)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(EIF4EBP1)相對表達(dá)量(P<0.01)。這表明mtr-miR156a通過靶向結(jié)合PPP2R5D和PIK3R2會(huì)影響PI3K/Akt/mTOR信號通路中PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、Akt1、TSC2、RHEB、mTOR、eIF4E和EIF4EBP1等基因的表達(dá)。

2.8 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs中酪蛋白基因表達(dá)的影響

進(jìn)一步探究過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs中酪蛋白基因表達(dá)的影響,將mtr-miR156 mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染BMECs 48 h后,通過qRT-PCR檢測酪蛋白基因的表達(dá),結(jié)果如圖10所示。與mimic NC處理相比,mtr-miR156a mimic處理極顯著提高酪蛋白alpha S1(CSN1S1)、酪蛋白alpha S2(CSN1S2)、酪蛋白beta(CSN2)和酪蛋白kappa(CSN3)相對表達(dá)量(P<0.01),這表明在BMECs中,過表達(dá)mtr-miR156a會(huì)促進(jìn)α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白在mRNA水平上的表達(dá)。

CSN1S1:酪蛋白alpha S1 casein alpha S1;CSN1S2:酪蛋白alpha S2 casein alpha S2;CSN2:酪蛋白beta casein beta;CSN3:酪蛋白kappa casein kappa。圖10 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs中酪蛋白基因表達(dá)的影響Fig.10 Effects of overexpression of mtr-miR156a on expression of casein genes in BMECs

2.9 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs培養(yǎng)液上清液中酪蛋白含量的影響

進(jìn)一步檢測過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs培養(yǎng)液上清液中酪蛋白含量的影響,通過ELISA法檢測α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白含量,結(jié)果如圖11所示,與mimic NC處理相比,mtr-miR156a mimic處理顯著提高上清液中α酪蛋白和β酪蛋白含量(P<0.05),極顯著提高上清液中κ酪蛋白含量(P<0.01),這與mRNA水平上的表達(dá)趨勢一致,表明mtr-miR156a會(huì)促進(jìn)BMECs中α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白的合成。

圖11 過表達(dá)mtr-miR156a對BMECs培養(yǎng)液上清液中酪蛋白含量的影響Fig.11 Effects of overexpression of mtr-miR156a on casein contents in supernatant of BMECs culture medium

3 討 論

奶牛泌乳期乳腺上皮細(xì)胞的代謝活動(dòng),受乳汁合成及分泌機(jī)制的即時(shí)調(diào)整,并受一些重要的泌乳基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響[4]。miRNA在BMECs生長和乳蛋白合成及泌乳階段起著重要的調(diào)控作用,但外源性植物miRNA的具體調(diào)控機(jī)制尚未得到深入研究,因此探索苜蓿miR156a在BMECs的靶基因及其對乳蛋白合成的調(diào)控具有重要意義,可為優(yōu)質(zhì)乳生產(chǎn)營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)提供新思路。

3.1 mtr-miR156a在BMECs中靶基因PPP2R5D和PIK3R2的發(fā)現(xiàn)

miRNA作用方式主要是通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合到靶基因mRNA的3′ UTR上,導(dǎo)致mRNA發(fā)生翻譯抑制或脫腺苷化和降解[5]。本研究主要通過聯(lián)川生物云平臺(tái)和TargentScan 2個(gè)在線網(wǎng)站,預(yù)測mtr-miR156a在牛體內(nèi)的靶基因,初步篩選出了mtr-miR156a的17個(gè)參與蛋白質(zhì)合成代謝的候選靶基因,并通過RNAhybrid發(fā)現(xiàn)了8個(gè)候選靶基因mRNA,其中有的基因沒有與mtr-miR156a的種子區(qū)全部結(jié)合,或者最小結(jié)合自由能值較大,結(jié)合不穩(wěn)定,這為靶基因鑒定過程增加了難度。最終篩選出PPP2R5D和PIK3R2進(jìn)行驗(yàn)證,通過雙熒光素酶報(bào)告基因鑒定發(fā)現(xiàn),PPP2R5D和PIK3R2可以與mtr-miR156a靶向結(jié)合,進(jìn)一步通過qRT-PCR試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)mtr-miR156a顯著抑制了PPP2R5D和PIK3R2在mRNA水平上的表達(dá),因此確定了PPP2R5D和PIK3R2是mtr-miR156a在BMECs中的靶基因。

PPP2R5D位于牛第23號染色體上,全長23 307 bp,包含16個(gè)外顯子,mRNA全長2 965 bp,編碼DNA序列(CDS)全長1 803 bp,編碼600個(gè)氨基酸。PPP2R5D參與人神經(jīng)發(fā)育障礙等[6-7]。PIK3R2位于牛第7號染色體上,全長12 618 bp,包含16個(gè)外顯子,mRNA全長3 705 bp,CDS全長2 175 bp,編碼724個(gè)氨基酸。PIK3R2是PI3K的一種普遍存在的亞型[8]。PIK3R2被認(rèn)為是腫瘤驅(qū)動(dòng)因子,可以作為多種癌癥的標(biāo)志物[9]。PPP2R5D和PIK3R2都位于PI3K/Akt/mTOR信號通路。PI3K/Akt/mTOR信號通路對動(dòng)物乳蛋白合成與分泌發(fā)揮著調(diào)控作用[10],但在奶牛乳蛋白合成的研究中,尚未見PPP2R5D和PIK3R2調(diào)控機(jī)制方面的研究報(bào)道,有待進(jìn)一步的研究與挖掘。

PI3K/Akt/mTOR信號通路與乳蛋白合成密切相關(guān)。如卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體1(OGR1)可以通過阻斷山羊乳腺上皮細(xì)胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路來抑制山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖并下調(diào)β酪蛋白的合成[11];chi-miR3031可通過下調(diào)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5)表達(dá)水平激活PI3K/Akt/mTOR通路并改善β酪蛋白的表達(dá)[12];miR-574-5p通過下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶9(MAP3K9)和蛋白激酶B3(Akt3)抑制PI3K/Akt/mTOR通路的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn),進(jìn)而減少山羊乳腺上皮細(xì)胞中β酪蛋白的合成[13]。本試驗(yàn)通過雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了外源植物mtr-miR156a可以跨界靶向PPP2R5D和PIK3R2這2個(gè)位于PI3K/Akt/mTOR信號通路的基因,而在PI3K/Akt/mTOR信號通路中,PPP2R5D和PIK3R2作為Akt1、EIF4EBP1、PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、TSC2、RHEB、mTOR和eIF4E的上游基因,也會(huì)調(diào)控其基因的表達(dá)最終調(diào)控BMECs中乳蛋白的合成。這為進(jìn)一步探究外源植物mtr-miR156對奶牛乳蛋白的調(diào)控作用的分子機(jī)制提供了可進(jìn)一步深入研究的信號通路。

3.2 mtr-miR156a可促進(jìn)奶牛牛奶中乳蛋白的合成

牛奶是人類重要的營養(yǎng)物質(zhì),提高牛奶品質(zhì)已是家畜遺傳改良的重要目標(biāo)之一,表觀遺傳學(xué)修飾已被證明與乳腺發(fā)育有關(guān),但其影響的潛在機(jī)制尚且未知。乳蛋白在生物體內(nèi)的來源主要有2種,一種是由乳腺上皮細(xì)胞利用血液中游離氨基酸或小肽從頭合成[14],這部分占乳蛋白中的絕大多數(shù),包括酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白[15];另一種則是經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來,如免疫球蛋白和血清蛋白[16]。泌乳奶牛乳腺具有很高的代謝活性,乳腺中蛋白質(zhì)合成量約占整個(gè)機(jī)體全部蛋白質(zhì)合成量的40%以上。影響泌乳奶牛乳中蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量的因素有很多,但主要受到遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境和管理等因素影響。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)乳蛋白合成受到一個(gè)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控,主要包括氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)、乳蛋白合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)及翻譯調(diào)控系統(tǒng)[17]。在相關(guān)的研究中,miRNA也被發(fā)現(xiàn)參與了奶牛乳腺的發(fā)育和泌乳功能[18-20]。miRNA可以作用于泌乳相關(guān)激素受體的靶基因后調(diào)控乳蛋白合成,如在BMECs中miR-15a可以通過與生長激素受體(GHR)的mRNA結(jié)合并抑制其表達(dá),進(jìn)而抑制BMECs的增殖和酪蛋白的合成[21]。此外,miRNA還可以直接調(diào)控編碼乳成分合成基因的表達(dá)。在對奶山羊的酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3的3′ UTR進(jìn)行重測序后發(fā)現(xiàn)了5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),并且這些位點(diǎn)正好位于預(yù)測的多種miRNA種子序列的互補(bǔ)區(qū)[22]。miRNA可能通過與此區(qū)域的突變相互作用,調(diào)節(jié)乳中各種酪蛋白。酪蛋白在奶牛乳蛋白成分中所占的比例較高,有研究通過收集細(xì)胞上清液使用β酪蛋白ELISA試劑盒進(jìn)行β酪蛋白含量檢測[23]。因此,本研究也選擇通過檢測酪蛋白基因的表達(dá)和含量來探究mtr-miR156a對奶牛乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)mtr-miR156a會(huì)促進(jìn)BMECs中CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3 mRNA的表達(dá)和提高BMECs培養(yǎng)液中酪蛋白的含量,由此發(fā)現(xiàn)mtr-miR156a可以促進(jìn)BMECs中酪蛋白的合成。另有研究表明,一些內(nèi)源性的miRNA也會(huì)調(diào)控奶牛乳蛋白的合成,如miR-29可以靶向BMECs中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)促進(jìn)酪蛋白、乳脂和乳糖的標(biāo)志基因表達(dá),對BMECs的泌乳能力具有積極的作用[24]。miR-486可以靶向磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)刺激BMECs增殖并分泌酪蛋白、乳脂和乳糖,促進(jìn)奶牛乳蛋白的合成和分泌[25]。miR-139通過靶向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)5/Akt/mTOR信號通路中GHR和胰島素樣生長因子1受體(IGF1R),抑制BMECs中酪蛋白的合成和表達(dá)[26]。miR-221通過靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路和Janus激酶(JAK)/STAT信號通路中的關(guān)鍵基因STAT5a和胰島素受體底物1(IRS1),抑制BMECs的增殖,參與奶牛乳蛋白的合成與乳腺的發(fā)育[27]。

乳蛋白不僅是影響乳品質(zhì)的關(guān)鍵因素,也是育種的主要目標(biāo)性狀,乳蛋白的合成涉及多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn),mtr-miR156a可提高牛奶中酪蛋白編碼基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá),一方面可為揭示苜蓿分子提高奶牛乳蛋白調(diào)控機(jī)制和進(jìn)一步高效利用苜蓿分子提高奶牛乳蛋白含量提供科學(xué)依據(jù);另一方面,也可為深入研究其他外源性飼料miRNA調(diào)控奶牛乳品質(zhì)形成提供參考。

4 結(jié) 論

① 本研究發(fā)現(xiàn)了mtr-miR156a在BMECs中的PPP2R5D和PIK3R2這2個(gè)靶基因,且這2個(gè)靶基因位于PI3K/Akt/mTOR信號通路。

② 過表達(dá)mtr-miR156a可極顯著上調(diào)Akt1和EIF4EBP1表達(dá),極顯著下調(diào)PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、TSC2、RHEB、mTOR和eIF4E等表達(dá)。

③ 過表達(dá)mtr-miR156a會(huì)極顯著上調(diào)酪蛋白編碼基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3在mRNA水平上的表達(dá),促進(jìn)α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白的合成。