白 晨 張 昊 盛宇飛 哈斯額爾敦* 敖長金 張喜勝

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室,呼和浩特 010018;2.錫林浩特市鼎安生物科技有限公司,錫林浩特 026000)

在畜禽營養(yǎng)研究中,飼用肽類的研究主要集中于植物源肽(如大豆肽等)或動物源肽對反芻動物瘤胃的調(diào)控以及對單胃動物免疫和抗氧化能力的調(diào)控等方面,并證實其具有抗菌、抗炎、提高生長性能和肉品質(zhì)等作用[1-5]。作為小麥蛋白的深加工產(chǎn)品,小麥低聚肽含有較高含量的谷氨酸和較為豐富的支鏈氨基酸,具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫機能、提高肉羊生長性能等作用[6-8],是一種較好的營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑。本課題前期研究表明,小麥低聚肽可以提高肉羊的日增重、降低料重比、提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率、改變小腸形態(tài)結(jié)構(gòu),并從營養(yǎng)物質(zhì)吸收的角度探討了小麥低聚肽對肉羊生長性能的影>響[8]。另有體外試驗表明,瘤胃液中添加小麥低聚肽可以提高氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白濃度,促進瘤胃發(fā)酵,提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率[9]。瘤胃微生物的群落變化直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化,進而影響肉羊的肉品質(zhì)、屠宰性能等重要指標,然而目前關(guān)于小麥低聚肽對肉羊瘤胃微生物群落的影響尚未見報道。本試驗擬通過分析飼喂小麥低聚肽對肉羊瘤胃微生物群落的改變,觀測其對屠宰性能和肉品質(zhì)的影響,旨在完善肉羊飼糧添加小麥低聚肽的系統(tǒng)性研究,為肉羊養(yǎng)殖中小麥低聚肽的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于2021年11月至2022年1月進行。采用單因素隨機試驗設(shè)計,選取4月齡、檢疫合格、平均體重35 kg、健康的小尾寒羊公羊30只,隨機分為2組,即對照組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)和試驗組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.3%小麥低聚肽),每組15只。飼喂量依據(jù)本課題組呂可欣等[9]的研究結(jié)果確定。羊只每日晨飼前將小麥低聚肽混于少量全混合日糧(TMR)中優(yōu)先飼喂,待采食完成后再補齊剩余TMR。試驗期共75 d,包括預試期15 d,正試期60 d。

試驗所用小麥低聚肽是以谷朊粉為原料進行酶解制備的成品,由錫林浩特市某公司提供,主要含有谷氨酸(28.78%)、亮氨酸(5.14%)、異亮氨酸(2.54%)、蛋氨酸(1.16%)、纈氨酸(2.82%)、苯丙氨酸(3.91%)、賴氨酸(1.14%)、甘氨酸(2.64%)。

試驗開始前,對羊舍進行分隔、消殺、清潔料槽、安裝飲水裝置,確保分圈飼養(yǎng)的2組條件、環(huán)境等一致。羊只每日08:00和16:00各飼喂1次,根據(jù)剩料情況及時調(diào)整下次供料量,羊只自由飲水。試驗期所用飼糧采用TMR形式進行飼喂,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1,飼糧營養(yǎng)水平符合《肉羊營養(yǎng)需要量》(NY/T 816—2021)的要求,飼糧中的粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)、總磷(TP)含量的測定依據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[10]。試驗期每天清理羊舍、料槽、水槽,早、晚各換水1次,保證羊舍衛(wèi)生條件和試驗羊只健康狀況。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 樣品采集與處理

在正試期第60天,每組選擇6只檢疫合格、體況相近的肉羊,禁食、稱重后屠宰。屠宰后稱胴體重,測定背膘厚度,描繪并計算眼肌面積,測定背最長肌pH。另取100 g左右的背最長肌樣品用于檢測其他肉品質(zhì)指標。羊只屠宰后取瘤胃內(nèi)容物,用4層紗布過濾得到瘤胃液,取20 mL瘤胃液分裝于2個10 mL凍存管內(nèi),迅速放入液氮保存,帶回實驗室后存放入-80 ℃冰箱保存,用于測定瘤胃菌群結(jié)構(gòu)。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 屠宰性能測定

羊只禁食12 h后屠宰,屠宰前稱重為宰前活重(kg);羊只屠宰放血后剝?nèi)ッ?去除頭、蹄和臟器,保留腎臟及腎周脂肪后稱重為胴體重(kg);屠宰率為胴體重和宰前活重之比,即:屠宰率(%)=胴體重/宰前活重×100;采用游標卡尺測定第12～13根肋骨間眼肌中部正上方脂肪組織厚度,即為背膘厚度(mm);采用硫酸紙畫出胴體第12～13根肋骨間對應(yīng)的腰椎橫斷面眼肌的輪廓,再計算輪廓面積,即為眼肌面積(cm2)。

1.3.2 羊肉品質(zhì)測定

pH測定:羊只屠宰后45 min,選擇每只試驗羊背最長肌相同部位樣品,用無菌手術(shù)刀在樣品上劃一小口,然后將校準后的pH計的玻璃電極插入測定pH,即pH45 min;將樣品放置于4 ℃的冰箱保存24 h后,采用相同方法測定相同位置的pH,即pH24 h。每個樣品測定3次,取平均值。

肉色分析:取每只試驗羊相同部位的背最長肌,選擇3個點使用OPTO-STAR肉色測定儀測定亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值。各樣品測定3次后取平均值。

剪切力測定:采用CL-ML3肌肉嫩度儀進行測定。取各羊只相同部位背最長肌樣品,置于4 ℃冰箱過夜后,將筋膜和脂肪除去,切成3 cm3左右的肉塊,在80 ℃水浴鍋中加熱30 min,待中心溫度達到70 ℃后取出樣品,將表面水分用濾紙吸干并冷卻至室溫,使用圓形取樣器取樣,測定剪切力。每個樣品重復測定3次,取平均值。

蒸煮損失測定:取各羊只相同部位背最長肌30 g左右,將肌外膜和脂肪剔除,稱重并記錄。將樣品在80 ℃水浴鍋中加熱30 min,取出樣品冷卻30 min后稱重并記錄。按照如下公式計算蒸煮損失:

蒸煮損失(%)=[(煮前樣品重-煮后
樣品重)/煮前樣品重]×100。

失水率測定:取各羊只相同部位背最長肌樣品,平置后用直徑5 cm的圓形取樣器于樣品中心部位取厚約1 cm的樣品,稱重并記錄。樣品上下各放置12層中性濾紙,保證樣品處于中央位置,在35 kg的壓力下持續(xù)5 min,撤去外力,稱重并記錄。按照如下公式計算失水率:

失水率(%)=[(樣品重-失水后樣品重)/
樣品重]×100。

1.3.3 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析委托上海中科新生命科技有限公司進行。對瘤胃液微生物DNA進行提取,并進行純度和濃度檢測。對選定的V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進行質(zhì)檢,文庫質(zhì)檢合格后,使用Illumina MiSeq平臺進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2019進行初步整理后,使用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計分析,采用t檢驗進行組間差異顯著性分析,定義P<0.05為差異顯著,0.05≤P≤0.10為差異有顯著的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥低聚肽對小尾寒羊屠宰性能的影響

由表2可知,與對照組相比,飼糧中添加小麥低聚肽對小尾寒羊的宰前活重、胴體重和屠宰率無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比,試驗組背膘厚度顯著增加(P<0.05),眼肌面積無顯著變化(P>0.05)。

表2 小麥低聚肽對小尾寒羊屠宰性能的影響Table 2 Effects of wheat oligopeptides on slaughter performance of small-tailed Han sheep

2.2 小麥低聚肽對小尾寒羊肉品質(zhì)的影響

由表3可知,試驗組背最長肌肉色b*值顯著高于對照組(P<0.05),L*和a*值與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。背最長肌pH45 min、pH24 h在2組間無顯著差異(P>0.05)。對照組背最長肌剪切力和失水率顯著高于試驗組(P<0.05),試驗組蒸煮損失有低于對照組的趨勢(P=0.09)。

表3 小麥低聚肽對小尾寒羊肉品質(zhì)的影響Table 3 Effects of wheat oligopeptides on meat quality of small-tailed Han sheep

2.3 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 操作分類單元(OTU)維恩(Venn)圖

由圖1可知,在相似度97%的水平下,2組樣品中總共含有2 791個OTU,其中共有OTU為1 927個,占OTU總數(shù)的69.04%,對照組獨有OTU為405個,試驗組獨有OTU為459個,分別占OTU總數(shù)的14.51%和16.45%;相比于對照組,試驗組OTU數(shù)目相對較多。

C代表對照組,T代表試驗組。C represents the control group, and T represents the experimental group.圖1 操作分類單元Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU

2.3.2 alpha多樣性分析

由表4可知,與對照組相比,試驗組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)均無顯著變化(P>0.05)。

表4 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃菌群alpha多樣性的影響Table 4 Effects of wheat oligopeptides on rumen microflora alpha diversity of small-tailed Han sheep

2.3.3 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃菌群組成的影響

從本試驗樣本細菌中共檢出21個門、32個綱、59個目、107個科、235個屬、115個種。

由表5可知,在細菌門水平上,對照組相對豐度占比在1%以上的菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)和變形菌門(Proteobacteria),試驗組相對豐度在1%以上的菌門有擬桿菌門、厚壁菌門和螺旋體門;試驗組擬桿菌門的相對豐度有高于對照組的趨勢(P=0.08),藍菌門的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05),其余菌門的相對豐度在2組間均無顯著差異(P>0.05)。

表5 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃主要菌門相對豐度的影響Table 5 Effects of wheat oligopeptides on relative abundances of major bacterial phyla in rumen of small-tailed Han sheep %

由表6可知,在細菌屬水平上,對照組和試驗組相對豐度較高的菌屬均是理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae RC9 gut group)和普雷沃氏菌屬1(Prevotella1);試驗組丁酸弧菌屬2(Butyrivibrio2)的相對豐度有低于對照組的趨勢(P=0.10),其他菌屬的相對豐度在2組間無顯著差異(P>0.05)。

表6 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃主要菌屬相對豐度的影響Table 6 Effects of wheat oligopeptides on relative abundances of major bacterial genera in rumen of small-tailed Han sheep %

3 討 論

3.1 小麥低聚肽對小尾寒羊屠宰性能和肉品質(zhì)的影響

低聚肽類物質(zhì)含有2～10氨基酸,由于分子質(zhì)量較小,易于消化[11],是提高飼料利用效率、促進高精料條件下反芻動物瘤胃微生物活性的有效飼料添加劑[3]。目前關(guān)于植物來源肽的研究較為廣泛。前人研究表明,棉籽蛋白來源肽顯著提高了育肥牦牛的平均日增重,顯著降低了料重比[5];大豆肽顯著提高了泌乳奶牛的產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量[2];大豆肽還顯著提高了肉雞胸肌的pH,降低了失水率,改善了肉色[12]。小麥低聚肽具有較好的調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)等作用[6,13]。本研究結(jié)果表明,小麥低聚肽具有改善小尾寒羊屠宰性能與肉品質(zhì)的作用。

本試驗中,飼喂小麥低聚肽雖沒有顯著影響小尾寒羊的宰前活重、胴體重、屠宰率,但顯著增加了背膘厚度。此外,與對照組相比,試驗組小尾寒羊背最長肌蒸煮損失有降低的趨勢,失水率顯著降低,綜合失水率與蒸煮損失指標可以反映肌肉的保水能力[14],說明小麥低聚肽增強了肌肉的保水能力,對肉的保鮮具有促進作用。包志碧[15]指出,肉羊胴體背膘厚度的增加有助于降低肌肉水分的流失,本試驗結(jié)果也間接證明了此觀點。失水率也是反映肉風味的重要指標,失水率升高導致水分流失增加,則會降低肉的風味[16]。剪切力是反映肉嫩度的指標,也與肉的保水能力相關(guān),剪切力降低則嫩度提高。研究表明,飼糧添加8 g/d抗菌肽顯著降低了荷斯坦公牛背最長肌的剪切力[17]。本試驗中,飼喂小麥低聚肽顯著降低了小尾寒羊背最長肌的剪切力,說明小麥低聚肽有助于提高羊肉的嫩度。

肉色指標不僅體現(xiàn)了肌肉的外觀及理化特性,還可反映肌肉的營養(yǎng)特性。肉色指標中的L*值反映了肌肉的光澤、亮度,并與肌肉的保水性呈負相關(guān)[18],a*值反映了肌肉中肌紅蛋白的含量,b*值反映了肌肉中脂肪以及色素的沉積情況。本試驗中,飼喂小麥低聚肽并未顯著改變小尾寒羊背最長肌的L*值,但其在數(shù)值上有降低的趨勢,可能與肌肉的保水性增加有關(guān)。背最長肌a*值未發(fā)生顯著變化但b*值顯著增加,提示小麥低聚肽雖未影響肌肉肌紅蛋白的代謝,但可能影響肌肉脂肪酸的氧化,從而降低羊肉品質(zhì);羊肉pH45 min未受飼喂小麥低聚肽的影響,且2組羊肉的pH45 min均在正常剛屠宰肉的pH范圍內(nèi)[19],同時小麥低聚肽并未影響羊肉的pH24 h,且2組羊肉的pH24 h均符合屠宰24 h時pH的正常范圍[20]。

3.2 小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

本試驗經(jīng)過16S rRNA高通量測序共得到1 154 592條序列,序列平均長度為420 bp,試驗組與對照組的Coverage指數(shù)均超過了99%,說明測序深度合理,能夠準確地反映出瘤胃中細菌群落結(jié)構(gòu)和種類的多樣性[21]。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以用來評價瘤胃菌群的多樣性,Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以用來評價瘤胃菌群的豐富度。本試驗結(jié)果提示,飼喂小麥低聚肽對小尾寒羊瘤胃菌群的alpha多樣性無顯著影響。這與前人研究結(jié)果相近,黎凌鑠等[22]利用小肽與酵母培養(yǎng)物飼喂牦牛,對牦牛瘤胃微生物Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù)無顯著影響。

擬桿菌門和厚壁菌門是反芻動物瘤胃中的優(yōu)勢菌門[1,23]。本試驗結(jié)果表明,擬桿菌門和厚壁菌門均為各組小尾寒羊瘤胃中的優(yōu)勢菌門,說明小麥低聚肽并未改變小尾寒羊瘤胃優(yōu)勢菌門的構(gòu)成。擬桿菌門對瘤胃內(nèi)非纖維物質(zhì)降解具有重要作用[24],飼喂小麥低聚肽使瘤胃中擬桿菌門的相對豐度呈上升趨勢,推測小麥低聚肽可能具有促進飼糧中非纖維物質(zhì)降解的作用。陳蕓[25]在山羊飼糧中添加復合菌肽,發(fā)現(xiàn)復合菌肽能夠通過提高擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度,綜合提高瘤胃對飼料的降解率。有研究指出,與蛋白質(zhì)和碳水化合物降解有關(guān)的普雷沃氏菌屬是瘤胃中的主要優(yōu)勢菌屬[26]。本試驗中,對照組與試驗組小尾寒羊瘤胃內(nèi)的第一優(yōu)勢菌屬均為理研菌科RC9腸道群,第二優(yōu)勢菌屬均為普雷沃氏菌屬1。該結(jié)果與杜紅喜[27]的研究發(fā)現(xiàn)一致,即小尾寒羊瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌屬為理研菌科RC9腸道群和普雷沃氏菌屬1。此外,小麥低聚肽并未改變小尾寒羊瘤胃內(nèi)優(yōu)勢菌屬的相對豐度和順序。但有研究表明,飼糧中添加大豆肽顯著增加了奶牛瘤胃中理研菌科RC9腸道群的相對豐度[2]。另有研究指出,在育肥湖羊飼糧中添加800 g/t蜜蜂肽,瘤胃內(nèi)的第一優(yōu)勢菌屬由普雷沃氏菌屬1變?yōu)槔硌芯芌C9腸道群,而低劑量(200和400 g/t)添加800 g/t蜜蜂肽并無此現(xiàn)象[28]。本試驗與上述研究結(jié)果不一致的可能原因是肽的來源與氨基酸組成不同。

瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的變化與畜禽生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)的改變緊密相關(guān)[14]。理研菌科RC9腸道群是促乙酸產(chǎn)生菌,與結(jié)構(gòu)性碳水化合物發(fā)酵相關(guān)[29]。本試驗中,添加小麥低聚肽后,小尾寒羊瘤胃中理研菌科RC9腸道群的相對豐度未發(fā)生顯著變化,加之擬桿菌門的相對豐度呈上升趨勢,表明小麥低聚肽可能通過調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)來加強瘤胃對非纖維類物質(zhì)的消化。結(jié)合本課題前期研究發(fā)現(xiàn)的小麥低聚肽可提高小尾寒羊的營養(yǎng)物質(zhì)消化率,增加育肥前期的平均日增重并降低料重比[8],加之本試驗中小麥低聚肽的添加增加了背膘厚度,而背膘厚度體現(xiàn)了機體脂肪的沉積情況,與機體瘦肉率呈負相關(guān),提示小麥低聚肽可能通過調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)進而改善小尾寒羊的生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)沉積代謝規(guī)律。由于本試驗未觀測機體脂肪沉積情況,因此上述推測尚需進一步研究證實。

4 結(jié) 論

飼糧中添加小麥低聚肽可增加小尾寒羊的背膘厚度,改善羊肉的嫩度和保水能力,同時有提高瘤胃中擬桿菌門相對豐度的趨勢。