鄭會超 郭曉輝 蔣永清 孫富祥 孫 倫

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,杭州 310021;2.杭州蕭山富倫奶牛場,杭州 311251)

反芻動物瘤胃內(nèi)含有眾多微生物,包括細菌、原蟲和真菌,這些微生物可產(chǎn)生纖維素酶和半纖維素酶,并可降解反芻動物采食的飼料,其中細菌對將飼料轉化為揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白貢獻最多[1]。此前的一項研究表明,微生物附著在牧草上是牧草降解過程中的關鍵步驟,超過70%的瘤胃微生物附著在瘤胃的固態(tài)內(nèi)容物當中[2]。因此,研究飼料在瘤胃中黏附的細菌區(qū)系和降解曲線對于提高瘤胃飼料利用效率至關重要。許多研究表明,瘤胃微生物可迅速黏附于攝入的飼料顆粒并定植[3-4];另一些研究表明,飼料種類和培養(yǎng)時間對定植微生物群的多樣性、組成、結構和潛在功能有顯著影響[5-6]。然而,盡管黏附的瘤胃微生物群落受飼料種類的影響,但這些研究大多數(shù)沒有檢測宿主瘤胃微生物群落。燕麥草是奶牛的主要粗飼料來源之一,我國的燕麥草每年的進口量超過20萬t。目前已有關于稻草、麥秸、苜蓿、黑麥草及柳枝稷等在瘤胃中的動態(tài)降解與黏附細菌變化的研究[4,7-9],但鮮有燕麥草的相關研究報道。因此,本研究擬采用尼龍袋法研究燕麥草在瘤胃中的動態(tài)降解與黏附細菌變化情況,同時檢測宿主瘤胃微生物區(qū)系構成,以進一步豐富粗飼料降解過程中黏附細菌區(qū)系的基礎數(shù)據(jù)庫,為深入理解瘤胃微生物與飼料底物的互作機制以及提高反芻動物的飼料利用率提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗在杭州市臨安區(qū)正興牧業(yè)牧場進行,使用3頭經(jīng)產(chǎn)泌乳后期荷斯坦瘺管奶牛,拴系飼養(yǎng),并飼喂相同的飼糧[(15.2±0.9) kg/d全混合日糧(TMR)和(1.7±0.6) kg/d羊草)。TMR包含[干物質(DM)基礎]:14.0%玉米青貯飼料、10.0%啤酒糟、9.6%苜蓿干草、6.6%甜菜顆粒、5.9%燕麥草、6.6%稻草、20.6%玉米、11.8%豆粕、5.9%棉籽粕、2.5%膨化大豆、2.0%菜籽粕和4.5%預混料。每天08:00和15:00各飼喂奶牛1次,自由飲水。預試期30 d,正試期3 d。

1.2 試驗設計和樣品收集

將燕麥草在60 ℃下烘干,粉碎過10目的篩網(wǎng),將粉碎的燕麥草用分析天平稱重后放入8 cm×12 cm的尼龍袋中(5.0 g/袋),尼龍袋孔隙為38.5 μm。將108只尼龍袋均分成3份并放入用棉繩系好的大網(wǎng)袋(20 cm×30 cm)中,在晨飼前分別放入3頭瘺管牛的瘤胃中。分別在2、6、12、24、48和72 h從每頭瘺管牛瘤胃內(nèi)取出6只尼龍袋,將其中4只尼龍袋用自來水沖洗直到水變得清澈,然后用手擠壓尼龍袋以去除多余的水,并用于營養(yǎng)成分降解分析;剩余2只尼龍袋用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)沖洗以除去松散附著的微生物,分裝后置入液氮中冷凍保存。正試期第3天06:00、10:00、13:00和17:00共4個時間點通過瘺管人工采集瘤胃食糜2 kg左右,人工混合均勻后采樣,然后立即將樣本冷凍在液氮中。樣本轉入實驗室后存放在-80 ℃冰箱,直到提取DNA。

1.3 燕麥草及其降解殘渣營養(yǎng)成分分析

燕麥草及其降解殘渣的DM含量采用恒溫鼓風干燥箱在105 ℃下烘干測定,中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量分別通過中性和酸性洗滌溶液測定[10]。

1.4 細菌DNA提取和實時熒光定量PCR

通過磁珠和苯酚-氯仿-異戊醇提取方法提取DNA[11]。采用50 mL Tris-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液洗脫DNA,并采用NanoDrop 1000分光光度計(Nyxor Biotech,法國)測定其濃度,然后采用ABI7300實時熒光定量PCR儀和SYBR試劑盒進行實時熒光定量PCR。本研究使用的通用細菌引物及序列如下[12]:上游引物,5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′;下游引物,5′-ATTACCGCGGCTGG-3′。每次試驗做3個重復,通過對細菌克隆的純化質粒DNA進行10倍的連續(xù)稀釋來制備外部標準品,結果以降解后的燕麥草殘渣每克鮮重標記基因拷貝數(shù)表示。

1.5 細菌Illumina MiSeq測序和數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Behrendt等[13]的研究,細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域的PCR擴增使用細菌通用引物(341F,5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′;806R,5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)進行。PCR擴增子測序在北京奧維森基因科技有限公司的Illumina MiSeq PE300平臺(Illumina,Inc.,美國)上進行。原始數(shù)據(jù)以登錄號為SRP110222的形式提交到NCBI序列讀取檔案,然后使用QIIME 1.80軟件包進行處理。經(jīng)過質量過濾和配對端連接后,使用uParse算法將序列聚類為操作分類單元(OTU)。利用Silva 128數(shù)據(jù)庫對OTU代表性序列從門到屬進行物種注釋,在QIIME 1.80軟件中進行alpha多樣性指數(shù)分析,并在RStudio(http://www.rstudio.org)中進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

干物質降解率(DMD)、中性洗滌纖維降解率(NDFD)和酸性洗滌纖維降解率(ADFD)數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0的一般線性模型(GLM)程序進行分析,不同時間點降解率通過Duncan氏法進行多重比較。同樣,通過單因素方差分析,衡量細菌基因拷貝數(shù)和alpha多樣性指數(shù)隨時間的線性變化。采用RStudio(http://www.rstudio.org)中Kruskal-Wallis檢驗的非參數(shù)Scheirer-Ray-Hare擴展對不同時間點細菌群落相對豐度進行多重比較,顯著性定義為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 燕麥草的營養(yǎng)成分與瘤胃降解率

本試驗采用的燕麥草在風干條件下營養(yǎng)成分如下:DM含量為89.0%,粗蛋白質(CP)含量為5.8%,NDF含量為55.4%,ADF含量為33.6%,粗灰分含量為6.0%。燕麥草在瘤胃中的動態(tài)降解率見表1,培養(yǎng)時間顯著影響燕麥草DMD、NDFD和ADFD(P<0.05)。其中,燕麥草DM在2 h時快速降解23.4%,之后隨著時間延長,DMD逐漸提高,至72 h時燕麥草DMD近49%。燕麥草NDF和ADF降解曲線略有不同,NDFD在2～6h和6～12 h無顯著差異(P<0.05),出現(xiàn)滯后期;ADFD在6～12 h出現(xiàn)滯后期;但是NDFD和ADFD在12 h后各時間點均有顯著差異(P<0.05)。綜上可知,燕麥草的DM降解呈現(xiàn)2個階段,NDF和ADF的降解則呈現(xiàn)3個階段。

表1 燕麥草在瘤胃中的動態(tài)降解率Table 1 Dynamic degradation rate of oat grass in rumen %

2.2 定植在燕麥草及瘤胃的細菌群落

由表2可知,瘤胃內(nèi)定植的細菌總數(shù)(細菌拷貝數(shù))以及alpha多樣性指數(shù)大于定植在燕麥草上的細菌總數(shù)。由表3可知,在燕麥草上定植的微生物群落與在瘤胃內(nèi)定植的微生物群落有所不同,瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌門是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes),而燕麥草上的優(yōu)勢菌門是變形菌門(Proteobacteria)。進一步分析發(fā)現(xiàn),定植在瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1),其次是理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、瘤胃球菌屬1(Ruminococcus_1)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)和Saccharofermentans,相對豐度分別為8.7%、8.7%、6.2%、5.9%、3.7%和2.5%,相對豐度>1.0%的瘤胃菌屬還包括瘤胃球菌科UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、毛螺菌科NK3A20群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)、密螺旋體屬(Treponema)和丁酸弧菌屬2(Butyrivibrio_2)等;而定植在燕麥草上的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛生菌屬(Pantoea)、Bromus_tectorum、Solitalea、明串珠菌屬(Leuconostoc)、Rosenbergiella、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),相對豐度分別為17.3%、17.2%、10.4%、8.2%、3.2%、2.3%、1.9%和1.7%。

表2 定植在燕麥草及瘤胃的細菌群落16S rRNA拷貝數(shù)和alpha多樣性指數(shù)Table 2 16S rRNA copy number and alpha diversity indices of bacterial communities colonized in oat grass and rumen

表3 定植在燕麥草及瘤胃的細菌在門水平上的相對豐度Table 3 Relative abundance of bacteria colonized in oat grass and rumen at phylum level %

2.3 燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌群落動態(tài)分析

30個樣品經(jīng)質量過濾后共保留了1 811 310條序列,其中大多數(shù)序列長度在400～440 bp;最終共鑒定出4 050個OTU,而相對豐度高于0.1%的OTU有225個。由表4可知,Good’s覆蓋度均大于0.97,表明獲得了合理的測序深度水平;培養(yǎng)時間會影響燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌群落的alpha多樣性,觀測物種數(shù)和Chao指數(shù)在72 h時低于2和6 h時(P>0.05);與燕麥草緊密黏附的細菌的Shannon指數(shù)在各時間點上無顯著差異(P>0.05)。

表4 燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌群落alpha多樣性Table 4 Alpha diversity of bacterial community attached to oat grass during rumen degradation

由表3和圖1可知,細菌16S rRNA高通量測序數(shù)據(jù)顯示,燕麥草在瘤胃降解2 h時,其上定植的變形菌門和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度大幅下降且降至較低的水平,而一些菌群如厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度則提升到較高的水平。如圖1-a所示,在門水平上,有10個門的菌群相對豐度超過0.1%;所有樣本中相對豐度最高的菌門是厚壁菌門和擬桿菌門,分別占(49.2±5.5)%和(40.9±3.8)%,其余8個門相對豐度相對較低。此外,厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長保持著相對穩(wěn)定,而變形菌門、軟壁菌門(Tenericutes)和SR1_Absconditabacteria的相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長而降低,纖維桿菌門(Fibrobacteres)和螺旋菌門(Spirochaetae)的相對豐度則隨著培養(yǎng)時間的延長而提高。

圖1 燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌在門(a)和科(b)水平上的相對豐度Fig.1 Relative abundances of bacteria attached to oat grass during rumen degradation at phylum (a) and family (b) levels

在科水平上,燕麥草在瘤胃降解過程中至少有28個科的相對豐度超過0.1%。這28個科的總相對豐度為(99.3±0.1)%,且包括26個分類科和2個未確定的科,其中未確定的科的相對豐度為(3.1±1.0)%。如圖1-b所示,瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)相對豐度在2～24 h保持穩(wěn)定,72 h時相對豐度則分別提高和降低;腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和未鑒定(unidentified)科在6 h時降低,而在6～72 h保持穩(wěn)定;氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)和琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長先保持穩(wěn)定,然后出現(xiàn)降低;擬桿菌目BS11腸道群(Bacteroidales_BS11_gut_group)和理研菌科(Rikenellaceae)相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先降低后提高的變化趨勢;韋榮氏菌科(Veillonellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先提高后降低的變化趨勢;克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長基本沒有變化。

由表5可知,在屬水平上,共鑒定出31個屬的相對豐度超過0.5%,而未鑒定屬相對豐度占(19.8±3.5)%。其中,相對豐度最豐富的屬是普雷沃氏菌屬1,其次主要是克里斯滕森菌科R-7群、理研菌科RC9腸道群、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃球菌屬1、解琥珀酸菌屬、丁酸弧菌屬2、Saccharofermentans、琥珀酸弧菌科UCG-002(Succinivibrionaceae_UCG-002)、密螺旋體屬2(Treponema_2)和毛螺菌科NK3A20群等。黏附在燕麥草殘渣上的主要菌屬與定植在燕麥草和瘤胃的菌屬相比對發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)菌屬來源于瘤胃內(nèi)容物。

表5 燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌在屬水平上相對豐度的變化Table 5 Changes in relative abundances of bacteria attached to oat grass during rumen degradation at genus level %

此外,普雷沃氏菌屬1相對豐度在2～24 h保持穩(wěn)定(P>0.05),而在72 h時顯著降低(P<0.05);解琥珀酸菌屬相對豐度起初保持穩(wěn)定,然后隨著培養(yǎng)時間的延長而顯著降低(P<0.05);聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)和理研菌科RC9腸道群相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長而出現(xiàn)顯著變化(P<0.05),呈現(xiàn)先降低后提高的變化趨勢;瘤胃球菌科菌屬相對豐度隨著培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)出不同的變化趨勢,其中瘤胃球菌科NK4A214群相對豐度在2～24 h保持穩(wěn)定,而瘤胃球菌屬1相對豐度在12～24 h達到峰值;克里斯滕森菌科R-7群、丁酸弧菌屬2、Candidatus_Saccharimonas和毛螺菌科XPB1014群(Lachnospiraceae_XPB1014_group)等相對豐度在2～72 h保持穩(wěn)定,變化不顯著(P>0.05)。

基于OTU水平對燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌群落進行PLS-DA,結果發(fā)現(xiàn):可根據(jù)降解時間對燕麥草上黏附的細菌群落進行分離,共鑒定出4個組(圖2)。燕麥草在瘤胃降解72 h時黏附的細菌群落與其他降解時間群落完全分離,24 h時黏附的細菌群落與2和6 h時完全分離,而燕麥草在瘤胃降解2、6和12 h時黏附的細菌群落未完全分離。

圖2 基于 OTU水平的燕麥草在瘤胃降解過程中黏附的細菌群落PLS-DAFig.2 PLS-DA of bacterial community attached to oat grass during rumen degradation based on OTU levels

2.4 燕麥草DM、NDF和ADF含量與細菌群落的相關性

對燕麥草降解過程中的DM、NDF和ADF含量與優(yōu)勢菌屬相關豐度進行相關分析,結果如圖3所示,在屬水平上,密螺旋體屬2、Saccharofermentans、毛螺菌科AC2044群(Lachnospiraceae_AC2044_group)和丁酸弧菌屬2與DM、NDF和ADF含量均呈顯著負相關(P<0.05);理研菌科RC9腸道群相對豐度與NDF含量呈顯著負相關(P<0.05);毛螺菌科XPB1014群相對豐度與ADF含量呈顯著負相關(P<0.05);解琥珀酸菌屬、琥珀酸弧菌科UCG-002、普雷沃氏菌屬1、普雷沃氏菌科UCG-001和Candidatus_Saccharimonas相對豐度與DM、NDF和ADF含量呈顯著正相關(P<0.05);月形單胞菌屬1(Selenomonas_1)相對豐度與NDF含量呈顯著正相關(P<0.05)。

根據(jù)Pearson相關系數(shù)對單元格進行著色,紅色表示正相關,藍色表示負相關。*表示顯著相關(P<0.05),**表示極顯著相關(P<0.01)。Cells were colored based on Pearson correlation coefficient, and red color and blue color indicated positive and negative correlation, respectively. * mean significantly correlated (P<0.05), and ** mean extremely significantly correlated (P<0.01).圖3 燕麥草在瘤胃降解過程中營養(yǎng)成分含量與優(yōu)勢黏附菌屬相對豐度的相關分析Fig.3 Correlation analysis between nutrient contents of oat grass and relative abundances of dominant attached genera during rumen degradation.

3 討 論

在本研究中,燕麥草的NDF和ADF降解表現(xiàn)出3個階段,且定植在燕麥草上的細菌群落隨培養(yǎng)時間的延長發(fā)生顯著變化。有研究表明,干稻草和苜蓿干草的降解時間曲線相似[4],但與新鮮多年生黑麥草的降解時間曲線明顯不同[8]。干牧草降解的停滯期比新鮮牧草長。

許多研究表明,黏附在飼料表面的變形菌門在瘤胃內(nèi)快速被厚壁菌門和擬桿菌門取代[4,7]。本研究也證實了這些轉變。本研究還觀察到細菌群落的時間變化與飼料降解之間存在正相關關系。隨著飼料降解,細菌群落第2次轉變的時間有所不同,具體取決于飼料種類。對于稻草和苜蓿草,在發(fā)酵6 h后觀察到第2次轉變[4];而對于柳枝稷,則在16 h后發(fā)生[7]。在本研究中,第2次轉變發(fā)生在6 h后,第3次轉變發(fā)生在24 h后,這大約是快速降解第2階段的中間點。Jin等[9]也觀察到小麥秸稈在24 h后的第3次轉變。

本研究發(fā)現(xiàn),普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9腸道群、克里斯滕森菌科R-7群、瘤胃球菌屬1和解琥珀酸菌屬在發(fā)酵燕麥草上的細菌群落中占主導地位。這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結果[4]部分一致,即普雷沃氏菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和密螺旋體屬在瘤胃消化的水稻秸稈和苜蓿中占主導地位。Piao等[7]在新鮮多年生黑麥草定植的細菌群落中觀察到普雷沃氏菌屬、丁酸弧菌屬、瘤胃球菌屬和纖維桿菌屬的相對豐度很高。這些研究表明,飼料類型顯著影響附著在其上的微生物群落的組成和結構。值得注意的是,本研究的瘤胃優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬1、理研菌科RC9腸道群、克里斯滕森菌科R-7群、瘤胃球菌屬1、解琥珀酸菌屬和Saccharofermentans,說明宿主瘤胃細菌群落也發(fā)揮了重要作用。

有研究表明,半纖維素、淀粉、木聚糖、果膠和蛋白質的降解均與普雷沃氏菌屬有關[14-15]。有報道表明,瘤胃球菌屬可在瘤胃中產(chǎn)生最大比例的纖維素酶以及大量的半纖維素酶和寡糖降解酶[14],其因高纖維降解能力而得名[16]。理研菌科是一個相對較新的細菌科,迄今為止對其在瘤胃中的代謝功能研究較少。之前的一項研究發(fā)現(xiàn),在高脂肪飲食和高劑量染料木黃酮小鼠組中,理研菌科RC9腸道群相對豐度顯著提高,表明其可能在脂質代謝中發(fā)揮重要作用[17]。

克里斯滕森菌科R-7群和丁酸弧菌屬2的持續(xù)高豐度表明它們在飼料降解中起著重要作用?？死锼闺坪投∷峄【鷮倥c甲烷排放量呈負相關,與可消化DM攝入量和可消化有機物攝入量呈正相關[18]?？死锼闺芌-7群與參與氨基酸生物合成和能量底物代謝的代謝物呈正相關[19]。丁酸弧菌屬還與牛瘤胃中寡糖的降解有關[14],該屬還具有蛋白質水解和多糖降解活性[20-21]。

解琥珀酸菌屬是本研究中另一個豐富的屬,其與淀粉降解有關[22]。解琥珀酸菌屬可以將琥珀酸轉化為丙酸[23],因此其在瘤胃微生物群落中的高豐度表明會產(chǎn)生大量的琥珀酸。琥珀酸弧菌科也與淀粉降解有關[24],并且它被認為是一種生物標志物,表征反芻動物的腸道甲烷排放因子較低[25]。據(jù)報道,Saccharofermentans和密螺旋體屬與纖維素降解有關[26-27]。密螺旋體屬的出現(xiàn)可能與果膠的降解有關[28]。一些研究表明,在毛螺菌科和乙酸之間存在正相關關系[29]。

Fuma等[30]研究發(fā)現(xiàn),纖維桿菌屬是瘤胃中的主要纖維素分解菌。Liu等[4]觀察到纖維桿菌屬相對豐度與NDF含量呈正相關。而在本研究中,纖維桿菌的相對豐度相對較低。Jin等[9]也觀察到經(jīng)瘤胃發(fā)酵后小麥秸稈上定植的纖維桿菌的相對豐度相對較低。造成這種差異的原因可能是由于宿主瘤胃細菌中的纖維桿菌相對豐度較低。在飼喂高纖維飼糧的奶牛中,與飼喂其他纖維含量較低飼糧的動物相比,纖維溶解和纖維素分解細菌[如毛螺菌科、瘤胃球菌科和纖維桿菌科(Fibrobacteraceae)]的相對豐度較高[31]。此外,本研究發(fā)現(xiàn),燕麥草殘渣黏附主要菌屬絕大多數(shù)來源于瘤胃內(nèi)容物,可見宿主瘤胃細菌群落對飼料降解過程黏附菌落具有一定影響。

在本研究中,未鑒定屬相對豐度接近20%。這些未鑒定屬的功能仍然不清楚。隨著細菌鑒定工作的不斷推進,對這些未分類細菌的進一步了解將有助于提高反芻動物的飼料養(yǎng)分利用率。

4 結 論

① 在瘤胃中定植的細菌總數(shù)和alpha多樣性均高于燕麥草干草。

② 燕麥草上的優(yōu)勢菌門迅速被瘤胃微生物取代,宿主瘤胃細菌群落影響飼料上附著的細菌種類和數(shù)量。

③ 黏附在燕麥草上的細菌群落組成和結構隨著培養(yǎng)時間的推移發(fā)生了顯著變化,且與燕麥草殘渣營養(yǎng)成分組成呈強相關。