伍豐宇, 鄒博坤, 李曉霞, 錢永強(qiáng)*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所, 北京 100091; 2.國家林業(yè)和草原局草原研究中心, 北京 100091)

植物新品種保護(hù)(Plant variety protection act,PVP)即植物育種者權(quán)利,是指國家有關(guān)審批機(jī)關(guān)按照相關(guān)認(rèn)定程序依法授予育種人或單位對該植物新品種的生產(chǎn)、銷售、使用的排他獨(dú)占權(quán)。PVP在保護(hù)育種者權(quán)利、促進(jìn)農(nóng)林業(yè)健康發(fā)展與持續(xù)創(chuàng)新、維護(hù)國家國際競爭力方面起到了重要作用[1]。為了更加有效地建立起植物鑒定與保護(hù)體系,推動世界植物新品種的發(fā)展,1961年在巴黎通過的《保護(hù)植物新品種國際公約》(后文簡稱公約)建立了一個(gè)政府間的國際組織:國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants,UPOV)。公約后于1972年、1978年、1991年進(jìn)行了補(bǔ)充修訂[2],我國于1999年加入U(xiǎn)POV,受1987年文本約束[3]。公約在促進(jìn)協(xié)約各成員國在法律與技術(shù)上的合作、加快植物新品種的繁育生產(chǎn)速度、加速建立國際植物知識產(chǎn)權(quán)體系、維持農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展與創(chuàng)新等方面起到了不可忽視的作用[4-5]。公約規(guī)定各簽約國需要依照公約制定植物新品種審定標(biāo)準(zhǔn),對申請的植物新品種進(jìn)行特異性、一致性和穩(wěn)定性(Distinctness,uniformity,stability,簡稱DUS)的測試,并且需要在協(xié)調(diào)各成員國之間政策、法律、測試步驟等的差異性與維持國際一致性下,授予植物新品種育種者個(gè)人或單位相關(guān)PVP權(quán)利,保護(hù)與協(xié)調(diào)育種者和用戶之間的利益合理分配[6-7]。

植物DUS測試是判定植物是否屬于新品種的重要依據(jù),而DUS測試指南則是植物DUS測試的基礎(chǔ)[8]。植物新品種DUS測試指南由UPOV或者各UPOV成員國依據(jù)本國法律法規(guī)和植物生長實(shí)際情況測試并制定,是對申請的植物新品種的描述以及審查標(biāo)準(zhǔn),并向社會公開[9]。截至2022年12月,UPOV共發(fā)布了338種/屬植物的測試指南[10],但是各國因國情不同制定的DUS測試指南在種類和數(shù)量上有所差別。截至2022年12月,我國林業(yè)新品種保護(hù)名錄共收錄293種/屬植物[11],農(nóng)業(yè)新品種保護(hù)名錄共收錄191種/屬植物[12]。其中已有的農(nóng)業(yè)植物DUS測試類型(植物類型按最常見類型統(tǒng)計(jì))不多且大部分局限于經(jīng)濟(jì)作物與觀賞類植物,關(guān)于牧草類植物的DUS測試指南制定的只有11種屬,其中禾本科有高羊茅(Festucaarundinacea)、草地羊茅(Festucapratensis)、狗牙根(Cynodondactylon)、黑麥草(Loliumperenne)、鴨茅(Dactylisglomerate)、結(jié)縷草屬(ZoysiaWilld.)、狼尾草屬(PennisetumRich.)7種,與UPOV發(fā)布的牧草類DUS測試指南數(shù)量的21種還有較大差距。由于必要的測試指南能夠更好地幫助種質(zhì)資源的合理利用并且禾本科在牧草植物中占重要地位,所以未來適合我國其他牧草的DUS測試指南的研發(fā)將會越來越被重視,補(bǔ)全其他牧草特別是禾本科牧草的DUS測試指南是目前我國牧草植物新品種保護(hù)的重中之重。

野牛草(Buchloedactyloides)是原產(chǎn)于北美草原的多年生暖季型牧草,在美國原產(chǎn)地草原的染色體倍型中有二倍體、四倍體和六倍體三種,其中六倍體分布最廣[13],五倍體野牛草在自然界不存在,為人工培育而成[14]。野牛草為異花授粉植物,雌雄多異株少同株;株叢高度一般在15～35 cm左右,葉片細(xì)軟,長度可達(dá)10～30 cm,寬度約1～2 mm,整體呈綠色或灰綠色;雄花呈穗狀花序排列成總狀,于穗軸一側(cè)分兩排生長,單一穗軸上雄花小穗大概10個(gè),長度約3～6 mm,整個(gè)花軸高出株叢約5～15 cm;雌花呈球狀花序,花軸較植株株叢高度矮,每顆穎果包裹著1～5顆種子;匍匐莖發(fā)達(dá),在充足光照下,能快速進(jìn)行營養(yǎng)繁殖并覆蓋土壤,對土壤要求較低,沙壤土以及輕度鹽堿土均能較好適應(yīng)[15];種子存在休眠機(jī)制,若進(jìn)行種子繁殖,在進(jìn)行處理后才能進(jìn)行播種,一般在4—5月土壤溫度適宜時(shí)進(jìn)行播種;在華北地區(qū)返青期為4月下旬,枯黃期為10月下旬或11月上旬,綠期為180天左右[16]。

野牛草是禾本科野牛草屬下唯一種,由于其抗旱屬性被作為草坪草而被美國干旱地區(qū)廣泛使用。我國曾于20世紀(jì)40年代在甘肅首先引種野牛草,后野牛草被當(dāng)作生態(tài)修復(fù)草種和抗性草坪草在西北華北等地區(qū)廣泛種植[17]。目前我國市場上使用的野牛草品種主要以美國進(jìn)口品種為主,少量為自主培育品種。自上世紀(jì)以來我國各地培育了許多野牛草品系以及品種,但長期以來我國野牛草優(yōu)良的種質(zhì)資源尚未得到合理利用,大量優(yōu)秀品系以及品種未得到保護(hù),而UPOV以及我國均無野牛草的DUS測試指南。為了加快推進(jìn)野牛草新品種保護(hù)工作,促進(jìn)鼓勵個(gè)人與企業(yè)對野牛草草種的育種和研發(fā),制定適應(yīng)我國的野牛草DUS測試指南勢在必行。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本試驗(yàn)測試品種為市場上部分野牛草商業(yè)品種、本課題組自主培育并申請注冊的野牛草新品種以及山東莒縣地區(qū)野牛草育種基地中無性繁殖培育多年的野牛草穩(wěn)定品系(穩(wěn)定品系來源于北美大草原不同地區(qū)野生種);總計(jì)56個(gè)材料,分別為8個(gè)進(jìn)口商業(yè)品種、7個(gè)自主培育新品種以及41個(gè)多年穩(wěn)定品系(品系名為數(shù)字加英文例如1-2c)。

1.2 測試方法

本試驗(yàn)在山東莒縣野牛草育種基地(118.783 90° E,35.562 04° N)進(jìn)行,采用單株種植方法,株行距5 cm,每個(gè)參試材料分別種植于4.0 m×2.0 m田間地塊,所有材料均進(jìn)行大田養(yǎng)護(hù)管理,于2021年和2022年兩年間對參試野牛草材料的31個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行測試。每個(gè)個(gè)體觀測的植株取樣點(diǎn)為1個(gè),取樣數(shù)至少為10個(gè);群體觀測則應(yīng)觀測整個(gè)植株品種的群體表現(xiàn)。

野牛草物候期生育階段表如表1,其中編號代表不同生育階段;野牛草測試各性狀名稱類別以及測試方法和分級如表2,各性狀均選取最適宜測試時(shí)期。

表1 野牛草屬生育階段表Table 1 List of growth stages of buffalo grass

表2 野牛草新品種DUS測試指南性狀表Table 2 Characteristics table of DUS test guide for new buffalo grass varieties

1.3 分組性狀的選擇

選擇“性別”“植株株高”“葉色澤”以及“種包千粒重”為分組性狀,其中“植株株高”“種包千粒重”為數(shù)量性狀,“性別”為質(zhì)量性狀,“葉色澤”為假質(zhì)量性狀。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品種的選擇

標(biāo)準(zhǔn)品種原則上應(yīng)該選擇公知公用且較易獲得的品種,這些品種應(yīng)該通過特異性、一致性與穩(wěn)定性的測試,每個(gè)品種盡可能代表多個(gè)性狀。由于UPOV以及我國均無野牛草DUS測試指南,也無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品種研究內(nèi)容,因此本研究按照標(biāo)準(zhǔn)品種選擇原則,從試驗(yàn)品種中選擇11個(gè)品種作為標(biāo)準(zhǔn)品種,其中包括4個(gè)美國進(jìn)口品種,7個(gè)自主培育品種(表3)。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品種表Table 3 Standard varieties

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,特異性的研究主要通過統(tǒng)計(jì)分析數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀以及假質(zhì)量性狀的變異系數(shù),并通過聚類分析研究各性狀的相關(guān)性;一致性的研究則計(jì)算各品種內(nèi)和品種間的一致性比例,分析各性狀的一致性情況;穩(wěn)定性的分析則通過研究部分野牛草品種連續(xù)兩年的表型性狀的分布情況以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。特異性與一致性的判斷需要統(tǒng)計(jì)分析數(shù)量性狀數(shù)據(jù)的方差(V)、標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(CV),計(jì)算公式分別是:

(1)

(2)

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 DUS測試指南性狀

DUS測試性狀的選擇應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)要求:性狀容易被定義且能準(zhǔn)確定義;品種間特異性強(qiáng),能夠有足夠的差異進(jìn)行分類鑒別;一致性與穩(wěn)定性較強(qiáng),能夠穩(wěn)定表達(dá)[18]。根據(jù)GB/T 19557.1《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》[19]以及GB 6142-2008《禾本科草種子質(zhì)量分級》[20]對參試野牛草進(jìn)行兩個(gè)生長周期的測試。第一個(gè)生長周期選擇31個(gè)測試性狀,經(jīng)過第二個(gè)周期的測試通過特異性、一致性與穩(wěn)定性的分析最終選擇了雄花序長度、匍匐莖花青苷顯色等28個(gè)測試性狀,其中必測性狀24個(gè),輔助測試性狀4個(gè);必測性狀中數(shù)量性狀13個(gè),質(zhì)量性狀5個(gè),假質(zhì)量性狀6個(gè)。從性狀類別來看,數(shù)量性狀所占比例為53.57%,可見數(shù)量性狀是野牛草主要性狀類型,是鑒定分類野牛草品種必不可少的判斷依據(jù);從性狀選擇部位來看,植株的性狀、花部的性狀、葉部的性狀、匍匐莖的性狀、果實(shí)的性狀、物候期的性狀分別為5個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、3個(gè)、1個(gè)和2個(gè),花部和葉部分別占比為32.14%和28.57%,花葉共同占比為60.71%,說明野牛草性狀在花葉上呈現(xiàn)出較大差別,本測試指南也傾向于野牛草花葉性狀的測試。

2.2 數(shù)量性狀變異分析及分級

用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)并分析所測試野牛草材料的15個(gè)數(shù)量性狀(表4),結(jié)果表明野牛草15個(gè)數(shù)量性狀的變異系數(shù)處于11.66%～35.13%之間,說明野牛草各數(shù)量性狀在各品種之間有較大的變異,數(shù)量性狀具有品種分類的潛力。葉寬度和雄花序?qū)挾茸儺愊禂?shù)較小,分別為11.66%和12.88%;而雌花高度變異系數(shù)最大,為35.13%。以往對野牛草的性狀測試多局限于葉部性狀,本試驗(yàn)花部性狀除雄花高度外變異系數(shù)均較大,適用于品種間的分類鑒別,說明花部性狀也是性狀測試中不可缺少的。

表4 數(shù)量性狀變異分析表Table 4 Variation analysis table of quantitative characteristics

表5 野牛草數(shù)量性狀的分點(diǎn)值和對應(yīng)代碼Table 5 Suggested point values and corresponding codes for quantitative characteristics of buffalo grass

2.3 性狀相關(guān)性分析

利用SPSS 26.0對野牛草雌雄株共有的必測性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,從表6中可以看出,野牛草自然高度與葉長度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與葉寬度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與葉色澤呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05);匍匐莖節(jié)間直徑與葉寬度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01);葉長度與葉色澤呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05);上表皮茸毛與下表皮茸毛呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與生長習(xí)性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01);下表皮茸毛與生長習(xí)性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05);生長習(xí)性與葉質(zhì)地呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

其中上表皮茸毛與下表皮茸毛具有極強(qiáng)相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)性大于0.800),是因?yàn)榇蟛糠忠芭２荻急磉_(dá)出上、下表皮茸毛性狀;自然高度與葉長度、葉寬度具有較強(qiáng)相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)性大于0.300),符合植株生長長高的自然規(guī)律;匍匐莖節(jié)間直徑與葉寬度具有較強(qiáng)相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)性大于0.300),是否與實(shí)際生產(chǎn)情況相符以及具體原因仍需要研究;生長習(xí)性與葉質(zhì)地相關(guān)性較強(qiáng)(皮爾遜相關(guān)性大于0.300),且呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,符合植株生長規(guī)律,葉片質(zhì)地會影響草本植物的生長習(xí)性;上表皮茸毛與生長習(xí)性相關(guān)性較強(qiáng)(皮爾遜相關(guān)性大于0.300),可能是不同器官表現(xiàn)出的偶然現(xiàn)象;其他性狀之間如自然高度與葉色澤等雖然表現(xiàn)出相關(guān)性但相關(guān)性不強(qiáng)。綜上,野牛草性狀除少部分具有相關(guān)性外大部分性狀之間的相關(guān)性不強(qiáng),各性狀之間特異性較強(qiáng),利于品種的鑒別與分類。

2.4 聚類分析

利用SPSS 26.0對所有雄性野牛草材料進(jìn)行Q聚類分析,結(jié)果如圖1所示;對所有雌性野牛草材料進(jìn)行Q聚類分析,結(jié)果如圖2所示。由圖1可知,當(dāng)相對距離為15的時(shí)候,30種雄性野牛草材料被聚為9大類,當(dāng)相對距離為10的時(shí)候則有13個(gè)聚類節(jié)點(diǎn)出現(xiàn),說明受試雄性野牛草材料之間相對獨(dú)立,特異性較強(qiáng)便于材料間的分類。由圖2可知,當(dāng)相對距離為15的時(shí)候,26種雌性野牛草材料被聚為4大類,當(dāng)相對距離為10的時(shí)候則有6個(gè)聚類節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)。雌性野牛草測試性狀少于雄性野牛草,其分類類別也相對較少,但其特異性仍然適用于品種間的分類。

圖2 野牛草雌性品種Q型聚類分析結(jié)果Fig.2 Q-type cluster analysis results of female species of buffalo grass

3 討論

野牛草自從上世紀(jì)40年代引進(jìn)我國以來一直在我國園林綠化以及生態(tài)修復(fù)方面有著較為廣泛的使用。作為一種常見的草坪草,以往對其表型性狀方面的研究多集中于其整體植株特性以及坪用性方面[22],對其花葉研究較少,而通過本試驗(yàn)得知,野牛草花葉性狀由于其特異性、一致性以及穩(wěn)定性方面表現(xiàn)較好,是分類鑒別必不可少的性狀,因此本測試指南加入其花葉性狀,以期從一個(gè)較為全面的角度總結(jié)概括野牛草的表型性狀,從而研制出DUS測試指南。目前暫無對野牛草DUS測試性狀的相關(guān)研究,前期對野牛草表型性狀方面的研究主要集中在種質(zhì)資源方面,一般以植株性狀以及葉部性狀作為判定標(biāo)準(zhǔn)[23],而本研究野牛草新品種DUS測試指南包括測試性狀、測試方法、測試時(shí)期以及各性狀分級代碼,其中測試性狀包括植株的性狀、花部的性狀、葉部的性狀、匍匐莖的性狀、果實(shí)的性狀、物候期的性狀,表型性狀描述較為全面。成凱凱等[24]以工具測試以及目測作為測試方法對30份野牛草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)分析,因此本測試指南中測試方法包括工具測試以及目測,盡量簡化的測試方法有利于測試指南的推廣以及增加實(shí)際操作的可行性[25];參考野牛草的物候期特征以及喬葭月等[26]在對野牛草種質(zhì)資源的評價(jià)研究中測試期選擇春夏時(shí)期,本研究中測試時(shí)期主要是集中在春夏兩季野牛草開花結(jié)果時(shí)期,具體各性狀測試時(shí)期均在表1標(biāo)注。孫建軍等[27]對紫云英DUS測試的研究以及蔣林峰等[28]對鴨茅DUS測試的研究表明植株物候期的差異對測試結(jié)果會造成影響,本研究中也發(fā)現(xiàn)由于各個(gè)野牛草植株的物候期稍有差異,在不同的物候期表型性狀的表現(xiàn)又會有所區(qū)別,因此在實(shí)際操作過程需要測試人員根據(jù)實(shí)際情況靈活選擇各個(gè)性狀的測試時(shí)間。

目前UPOV與我國均無野牛草新品種DUS測試指南,本文首次研制出野牛草新品種DUS測試指南,可以為UPOV及其成員國的野牛草DUS測試指南的研制提供參考;有助于完善國內(nèi)野牛草新品種DUS測試的內(nèi)容,加快推進(jìn)野牛草新品種保護(hù)工作,促進(jìn)鼓勵個(gè)人與企業(yè)對野牛草草種的育種和研發(fā),為野牛草種質(zhì)資源的合理利用與保護(hù)做出貢獻(xiàn);對野牛草表型性狀的系統(tǒng)性研究以及對花葉等部位的全面統(tǒng)計(jì)研究為今后野牛草新品種數(shù)據(jù)庫的建立提供了依據(jù)。