李 根, ?？e

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

在植物體可以利用的養(yǎng)分中,糖是生物體主要的碳源和能量來(lái)源[1],同時(shí)也是一種重要的信號(hào)分子。在高等植物的葉肉細(xì)胞中,葉綠體可以通過(guò)光合作用將二氧化碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳固定,使光合作用產(chǎn)生糖[2-4]。然而,糖不能通過(guò)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)獨(dú)立運(yùn)輸,需要適當(dāng)?shù)奶寝D(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)助[2],目前主要發(fā)現(xiàn)有三類蛋白,即單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Monosaccharide transporters,MSTs)[5],蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Sucrose transporters,SUTs)[6-7]和糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sugars will eventually be exported transporters,SWEETs)[8]。在過(guò)去的20年里,糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的前兩個(gè)基因家族MSTs和SUTs在高等植物中得到了廣泛的研究[9],而SWEETs基因家族是近些年來(lái)被確定為糖外排體,其成員在已糖或蔗糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[10],但是人們對(duì)其功能了解尚不完全。

SWEETs廣泛存在于真核與原核生物,是一類不依賴于環(huán)境pH值,僅利用細(xì)胞內(nèi)外的濃度差來(lái)實(shí)現(xiàn)糖類的雙向可逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族[10]。真核SWEETs蛋白通常由七個(gè)α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域(7α-helical transmembrane domain,7-TMs)組成,這些結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)3-TM結(jié)構(gòu)域(包含兩個(gè)保守的MtN3/saliva)串聯(lián)重復(fù)組成,由一個(gè)保守程度較低的跨膜螺旋連接,并使其分開(kāi),該跨膜螺旋結(jié)構(gòu)通常被稱為3-1-3TM SWEET結(jié)構(gòu)[11]。研究發(fā)現(xiàn),SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員能夠參與調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtSWEET15在葉片衰老和滲透脅迫(包括高鹽、寒冷和干旱)會(huì)受到脫落酸(Abscisic acid,ABA)信號(hào)誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)AtSWEET15會(huì)使植株葉片衰老加速,對(duì)高鹽脅迫敏感,而缺乏AtSWEET15的突變株對(duì)高鹽敏感性降低[12]。在寒冷脅迫下,在擬南芥中過(guò)表達(dá)茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.)O. Ktze.]CsSWEET1a和CsSWEET17,轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比,相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低,蔗糖轉(zhuǎn)化酶AtCWINVs和AtVACINVs基因的表達(dá)被抑制,從而有效提高擬南芥抗凍性[13]。擬南芥AtSWEET11和AtSWEET12與寒冷及干旱脅迫相應(yīng)有著密切聯(lián)系,AtSWEET11,AtSWEET12雙突變體比野生型和單突變體表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凍性[14]。

小黑麥(×Triticosecale)是一種由人類創(chuàng)制的自花授粉的谷類作物,是由小麥(Triticumspp.)和黑麥(Secalecereale)雜交而成的新物種,在世界各地廣泛種植。它結(jié)合了小麥優(yōu)越的農(nóng)業(yè)形態(tài)、最終利用品質(zhì)特征和黑麥的強(qiáng)適應(yīng)性、高活力、對(duì)非生物和生物脅迫的優(yōu)質(zhì)抗性,作為優(yōu)良的一年生糧飼兼用作物在世界范圍內(nèi)廣泛種植[15-17],為緩解牧區(qū)草畜矛盾,保護(hù)生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮了重要作用。但其在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也同樣易受到環(huán)境脅迫,嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響牧草的飼用品質(zhì)及產(chǎn)量。因此,培育高產(chǎn)抗逆的優(yōu)質(zhì)小黑麥品種十分必要。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,草類植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)理研究已從最初的形態(tài)、生理水平逐漸發(fā)展到轉(zhuǎn)錄、翻譯及大分子物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作調(diào)控等分子機(jī)制層面[18]。截至目前,很多研究表明SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與生物及非生物脅迫響應(yīng)聯(lián)系密切,但小黑麥SWEETs家族參與響應(yīng)非生物脅迫的研究較少。因此,本研究對(duì)小黑麥SWEETs基因家族進(jìn)行了鑒定,并系統(tǒng)分析了SWEET基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、保守基序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等基本特征,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了TwSWEETs在近源及模式植物間的進(jìn)化關(guān)系,同時(shí)對(duì)其在小黑麥葉片和根部在不同逆境脅迫下的基因表達(dá)情況進(jìn)行了深入分析。本研究為進(jìn)一步了解SWEETs基因在調(diào)節(jié)植物發(fā)育過(guò)程中糖的積累和分配及它們?cè)诜巧锩{迫中發(fā)揮的作用奠定理論基礎(chǔ),進(jìn)而有助于優(yōu)良基因資源的挖掘和新品種培育。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用‘石大一號(hào)’品種小黑麥,由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1小黑麥TwSWEETs基因家族的鑒定 擬南芥、水稻(OryzasativaL.)、小麥(TriticumaestivumL.)和玉米(ZeamaysL.)的SWEETs基因蛋白序列可直接從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并根據(jù)擬南芥和水稻的SWEET蛋白序列作為鑒定小黑麥TwSWEETs的請(qǐng)求序列,以本課題組已有的多個(gè)小黑麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。使用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件進(jìn)行搜索比對(duì),Program選擇‘tblastn’,Expectation Value:E-20,搜索比對(duì)小黑麥的SWEET基因家族蛋白序列。

1.2.2小黑麥TwSWEETs蛋白序列理化性質(zhì)分析 使用在線ExPAsy-ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析小黑麥TwSWEETs蛋白序列的理化性質(zhì),包括氨基酸數(shù)量、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)和總平均親水性[19];使用TMHMM在線工具預(yù)測(cè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(TMHMM 2.0-DTU Health Tech-Bioinformatic Services)[20];使用ProtComp v. 9.0在線工具[Plant-mPLoc server(sjtu.edu.cn)]初步預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位[21];使用SOPMA在線工具對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[NPS@:SOPMA secondary structure prediction (ibcp.fr)];使用SWEISS MODEL在線工具對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(https://swissmodel.expasy.org/)[22-26]。

1.2.3小黑麥TwSWEETs蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及保守基序分析 利用在線工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)對(duì)小黑麥的SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析[27]。利用MEGA 11.0軟件中的最大似然法構(gòu)建16條小黑麥、59條小麥、17條擬南芥、21條水稻和29條玉米的基序系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4小黑麥幼苗生長(zhǎng)條件及非生物脅迫處理 采用土培法育苗,將小黑麥‘石大一號(hào)’種子用無(wú)菌水過(guò)夜浸泡,沖洗數(shù)次后進(jìn)行消毒處理,然后種植于育苗缽中,放置在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院生長(zhǎng)室中。晝夜溫度為25℃/20℃,每天光周期循環(huán)14 h,相對(duì)濕度為50%。待生長(zhǎng)14天后,選擇長(zhǎng)勢(shì)均一的幼苗進(jìn)行非生物脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)置3組處理,每組處理4個(gè)重復(fù)。對(duì)照處理(CK)為正常純凈水澆灌;干旱處理為20% PEG6000澆灌種植土壤,處理后放置于生長(zhǎng)室中;低溫處理設(shè)置溫度為4℃,放置于低溫光照培養(yǎng)箱。分別于處理3 h,6 h,12 h和24 h采集葉片和根系并放入液氮中快速冷凍,保存于-80℃冰箱。

1.2.5RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析 RNA提取使用天根生物科技有限公司(中國(guó))的總RNA提取試劑盒(離心柱型),貨號(hào)#DP419。然后使用寶生物(Takara)大連有限公司的PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,貨號(hào)R047A。具體試驗(yàn)步驟按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。

使用在線工具Primer BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)了小黑麥TwSWEETs基因的特異引物,由西安擎科生物科技有限公司合成。qRT-PCR使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal RreMix Plus(SYBR Green)熒光定量試劑盒,貨號(hào)FP206-02。20 μL反應(yīng)總體積包括5 μL稀釋模板(20 μL cDNA用180 μL ddH2O稀釋20倍)、3 μL ddH2O,1 μL上游和1 μL下游引物(10 μmol·L-1)和10 μL 2×SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)。反應(yīng)過(guò)程在LightCycler?96儀器(中國(guó)上海Roche)上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性15 min,PCR反應(yīng)為95℃變性10 s和58℃退火30 s,40次循環(huán),熔解曲線分析保留默認(rèn),為95℃持續(xù)1 s,65℃持續(xù)15 s,95℃持續(xù)1 s。每個(gè)處理設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置4次技術(shù)重復(fù),去掉極端數(shù)值。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)值[28]。選用Actin(ACT)作內(nèi)參基因,除TwSWEET6b-1和TwSWEET6b-2沒(méi)有合適的引物以外,其余14條小黑麥TwSWEETs基因特異性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列表Table 1 Primers used in this study for qPCR

1.2.6數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 24.0 Windows版(SPSS Inc.,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果,對(duì)照組與不同時(shí)間的處理組采用t檢驗(yàn),采用GraphPad Prism 8.0.2軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑麥TwSWEET基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)對(duì)比分析在小黑麥本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得16條序列,并將其命名為T(mén)wSWEET1a,TwSWEET1b,TwSWEET2a,TwSWEET2b,TwSWEET3a,TwSWEET4,TwSWEET6a,TwSWEET6b-1,TwSWEET6b-2,TwSWEET11,TwSWEET12,TwSWEET13,TwSWEET14,TwSWEET15,TwSWEET16和TwSWEET17。

如表2所示,16條小黑麥TwSWEETs蛋白序列編碼的氨基酸數(shù)目在231(TwSWEET2b)到311(TwSWEET12)之間,平均約270個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量在25.428 KD到33.913 KD之間。除TwSWEET1a/12/17的理論等電點(diǎn)(Theoretical isoelectric point,pI)小于7外,其余蛋白的pI都大于7,屬于堿性蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)是否大于40可將其分為穩(wěn)定蛋白(小于40)和不穩(wěn)定蛋白(大于40)。分析發(fā)現(xiàn),16條小黑麥TwSWEETs蛋白中有10條屬于穩(wěn)定蛋白,6種屬于不穩(wěn)定蛋白。另外,16條小黑麥TwSWEETs蛋白脂肪指數(shù)在108.86到123.40之間,親水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)均大于零,說(shuō)明它們都是疏水性蛋白。對(duì)TwSWEETs蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(Transmembrane helices,TMH)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),小黑麥TwSWEETs家族包含6～7個(gè)TMHs,約70%的成員擁有7個(gè)TMHs;此外,對(duì)這些蛋白的亞細(xì)胞定位初步預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),它們多數(shù)都定位于質(zhì)膜(Plasma membrane,PM)上,少數(shù)SWEETs基因存在多種定位結(jié)果。

表2 小黑麥TwSWEETs蛋白序列理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties analysis of TwSWEETs protein sequence in triticale

2.2 小黑麥TwSWEETs編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

如表3和圖1所示,16條TwSWEETs編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋結(jié)構(gòu)、無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和延伸鏈組成,但各結(jié)構(gòu)所占比例有所差異。在所有TwSWEETs蛋白質(zhì)中,絕大多數(shù)蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)相比其他結(jié)構(gòu)所占比例最高,除TwSWEET3a/4/6a/6b-1/11/12/13外,其余TwSWEETs的α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例均高于40%。無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例在27.71%～40.84%之間,平均為34.45%,β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在四種結(jié)構(gòu)中所占比例最低,其中,TwSWEET11的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比為2.64%,在所有小黑麥TwSWEETs家族成員中占比最低,TwSWEET16的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比最高,為5.02%。延伸鏈在16條TwSWEETs家族成員中的占比有所浮動(dòng),在12.37%～25.91%之間。綜合分析發(fā)現(xiàn),α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是小黑麥TwSWEETs家族成員基因結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件。

圖1 小黑麥TwSWEETs編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein secondary structure encoded by TwSWEETs in triticale注:藍(lán)色為α-螺旋;綠色為β-折疊;黃色為無(wú)規(guī)則卷曲;紅色為延伸鏈Note:Blue,Alpha helix;green,Beta turn;yellow,Random coil;red,Extended strand

表3 小黑麥TwSWEETs編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of protein secondary structure encoded by triticale TwSWEETs

小黑麥TwSWEETs家族成員蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖2),TwSWEET1a和TwSWEET1b的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本相同,TwSWEET2a和TwSWEET2b的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果也基本一致。TwSWEET6a/6b-1/6b-2的三級(jí)結(jié)構(gòu)有較大的相似程度。TwSWEET12/13/14/15/16/17的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大,但α-螺旋結(jié)構(gòu)仍然是主要的組成結(jié)構(gòu)原件。

2.3 小黑麥TwSWEETs蛋白序列的保守基序(motif)分析

基于保守基序分析發(fā)現(xiàn),16小黑麥TwSWEETs蛋白由10個(gè)motif組成(圖3),16條TwSWEETs蛋白質(zhì)均含有motif 1/2/3/4/5,保守性較強(qiáng)。motif 6在TwSWEET6a/6b-1/6b-2中出現(xiàn)。motif 7在TwSWEET1a/1b/4/6a/6b-1/6b-2/13/14中出現(xiàn),但位置有所不同。motif 8在TwSWEET4/6a/6b-1/6b-2中出現(xiàn)。

如圖4所示,基序的長(zhǎng)度范圍在8～50個(gè)氨基酸之間,其中motif1和motif2的基序長(zhǎng)度均為50個(gè)氨基酸,且均含多個(gè)保守的氨基酸殘基位點(diǎn),如motif 1中的甘氨酸(G,1,3)、脯氨酸(P,15,35)、亮氨酸(L,40)、酪氨酸(Y,36,49)和蘇氨酸(T,18);motif 2中的脯氨酸(P,3,20,49)、纈氨酸(V,10,16)、酪氨酸(Y,37)、谷氨酸(E,17)、亮氨酸(L,23)、絲氨酸(S,24)和天冬氨酸(D,43)。motif 3和motif 6的基序?qū)挾染鶠?9個(gè)氨基酸,motif4,5,7,8,9,10的基序?qū)挾确謩e為22,21,8,10,18,17個(gè)氨基酸。其中,motif6,motif 8和motif 10含有較多個(gè)保守的氨基酸殘基位點(diǎn),如motif6中的賴氨酸(K,1,2,3)、纈氨酸(V,6,23,25,27)和谷氨酸(E,7,28)等;motif8中的甲硫氨酸(M,1)、纈氨酸(V,2)和絲氨酸(S,3)等;motif10中的纈氨酸(V,6,8,9,12)、甘氨酸(G,11,15)和亮氨酸(L,13,14)等。此外,motif3/4/5/7/9所含有的保守氨基酸殘基位點(diǎn)較少,其中motif3/4/5各含有1個(gè)保守位點(diǎn),motif7和motif9各含有2個(gè)保守位點(diǎn)。motif1/2/6/8/10包含多個(gè)保守的氨基酸殘基,由此推斷它們可能在小黑麥的糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖4 MEME程序鑒定的TwSWEETs蛋白的十個(gè)基序的序列標(biāo)志Fig.4 Sequence markers of ten motifs of TwSWEETs protein identified by MEME program注:在每個(gè)位點(diǎn)都以字母(氨基酸殘基)排列的方式展示。氨基酸堆疊的總高度以位表示基序中該位點(diǎn)的“信息含量”。堆棧中每個(gè)字母的高度代表該位置的氨基酸的保守程度。X軸為基序的長(zhǎng)度;Y軸為該位點(diǎn)的字母Note:Each site is displayed in alphabetical (amino acid residue) order. The total height of the amino acid stacking represents the information content of the site in the motif. The height of each letter in the stack represents the degree of conservation of the amino acids at that position. The X axis is the length of the motif, the Y axis is the site of the letter

2.4 小黑麥、小麥、擬南芥、水稻和玉米SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用最大似然法(ML)構(gòu)建了小黑麥、擬南芥、水稻和玉米的SWEETs蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。結(jié)果表明,小黑麥TwSWEETs蛋白家族成員可分為四個(gè)主要分支(Clade I,Clade II,Clade III和Clade IV),其中,Clade I包括TwSWEET1a/1b/2a/2b/3a,Clade II包括TwSWEET4/6a/6b-1/6b-2,Clade III包括Tw-SWEET11/12/13/14/15,Clade IV包括TwSWEE-T16和TwSWEET17。除此之外,16條小麥的TwSWEETs與單子葉植物小麥TaSWEETs、水稻OsSWEETs和玉米ZmSWEETs具有較高的同源性,而雙子葉植物擬南芥的多條AtSWEETs蛋白獨(dú)立于TwSWEETs,TaSWEETs,OsSWEETs和ZmSWEETs分布,與單子葉植物中的SWEETs基因家族的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖5 小黑麥、小麥、擬南芥、水稻和玉米SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of SWEETs sugar transporter sequences in triticale,wheat,Arabidopsis,rice and maize注:SWEETs蛋白被分為四個(gè)分支Note:SWEETs protein is divided into four branches

2.5 TwSWEETs在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

2.5.1干旱脅迫 如圖6所示,干旱處理后,葉片和根中多個(gè)TwSWEETs基因的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)。脅迫6 h內(nèi),TwSWEET1b/2a/6a基因的表達(dá)在葉片中顯著上調(diào),TwSWEET3a基因表達(dá)未受影響,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),TwSWEET1b和SWEET6a基因的相對(duì)表達(dá)量仍顯著上調(diào),于脅迫24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別高達(dá)4.98和74.65,極顯著高于對(duì)照水平(P<0.01),TwSWEET12在葉片中的表達(dá)量呈現(xiàn)出干旱脅迫延長(zhǎng)后表達(dá)量顯著增強(qiáng)的趨勢(shì),而TwSWEET1a/2b/11/13/14/15/16/17在整個(gè)脅迫過(guò)程中葉片相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照(除TwSWEET14,12 h;TwSWEET17,3 h)(P<0.05)。根系表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),TwSWEET1b和TwSWEET12基因在脅迫12 h內(nèi)顯著下調(diào),24 h時(shí)極顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)。根系TwSWEET4/11基因表達(dá)量在脅迫3 h時(shí)極顯著上調(diào)(P<0.01),后隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)下調(diào)或恢復(fù)到與對(duì)照組相近水平。TwSWEET6a和TwSWEET16基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫24 h內(nèi)均顯著高于對(duì)照水平,于脅迫 24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別為70.44和3.50。

圖6 干旱脅迫下小黑麥TwSWEETs基因的表達(dá)模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of TwSWEETs genes in triticale under drought stress注:*和**表示脅迫前后差異顯著(P<0.05,P<0.01)。下同Note:The difference before and after stress was significant (*P<0.05,**P<0.01). The same as below

2.5.2低溫脅迫 如圖7所示,低溫脅迫3 h時(shí),葉片TwSWEET2a/2b/3a/14/16的相對(duì)表達(dá)量和對(duì)照CK相比顯著升高(P<0.05),其中TwSWEET2a/2b/14的相對(duì)表達(dá)量分別為4.84,10.32,2.32,極顯著高于對(duì)照水平(P<0.01),且TwSWEET16在低溫脅迫24 h內(nèi)均表現(xiàn)為積極的上調(diào)響應(yīng),葉片TwSWEET2b/16在脅迫24 h后的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,分別約為對(duì)照組CK的35倍和15倍(P<0.01);而葉片TwSWEET1a/11/13/17(除TwSWEET1a,3 h;TwSWEET13,3 h;TwSWEET1a,3 h;TwSWEET17,3/h、6 h;)的表達(dá)在低溫脅迫下受明顯抑制。低溫脅迫下各基因在根系中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),TwSWEET1a/2b/6a/11/14/16基因在脅迫期間的多個(gè)時(shí)間段內(nèi)絕大多數(shù)都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),其中,根系TwSWEET6a和TwSWEET16在脅迫24 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,分別約為對(duì)照組CK的25倍和17倍,極顯著高于對(duì)照水平(P<0.01)。而根系TwSWEET2a/4/12/13/15基因的表達(dá)均受到低溫脅迫的顯著抑制(除TwSWEET15,24 h外)。

圖7 低溫脅迫下小黑麥TwSWEETs基因的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression pattern analysis of TwSWEETs genes in triticale under low temperature stress

3 討論

糖不僅是植物生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝的能量和碳源,也是重要的信號(hào)分子[29-30]。SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族不僅可以控制細(xì)胞內(nèi)外及細(xì)胞器間糖的供應(yīng)和分布,影響植物的“庫(kù)-源”運(yùn)輸,而且在協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中也發(fā)揮重要作用[31-32]。本研究共鑒定到16條小黑麥TwSWEETs家族蛋白,較小麥、水稻、玉米等禾本科植物的成員數(shù)目少一些。一方面可能是因?yàn)樾『邴溕袩o(wú)全基因組,試驗(yàn)所采用的數(shù)據(jù)庫(kù)僅為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),可能查找不全;另一方面可能是由于小黑麥自身在進(jìn)化和親本雜交的過(guò)程中基因組發(fā)生了丟失現(xiàn)象[33]。對(duì)TMHs預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),11個(gè)TwSWEETs蛋白有7個(gè)TMHs結(jié)構(gòu),約占TwSWEETs基因總數(shù)的70%。5個(gè)TwSWEETs蛋白的TMHs少于7個(gè),其中,TwSWEET1a/1b/6a/6b-2/17具有6個(gè)TMHs。研究表明,基因在不斷的進(jìn)化過(guò)程中會(huì)伴隨外顯子化、丟失和插入等情況的發(fā)生,這可能是造成SWEET基因的TMHs少于7個(gè)的原因,Zhang等人[34]對(duì)草地早熟禾(Poapratensis)的SWEET家族分析發(fā)現(xiàn),PpSWEETs家族成員存在4～7個(gè)TMHs[34-35],與本文的研究結(jié)果一致。

本研究基于SWEETs蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析,可將其根據(jù)蛋白質(zhì)的同源性分為4個(gè)分支。前人研究結(jié)果表明,SWEETs家族不同分支運(yùn)輸不同的糖。Clade I(SWEET1/2/3)和Clade II(SWEET 4/5/6/7/8)主要用于運(yùn)輸葡萄糖和果糖,也可以運(yùn)輸蔗糖;Clade III(SWEET9/10/11/12/13/14/15)主要用于蔗糖的高效轉(zhuǎn)運(yùn)[36],最近的一項(xiàng)研究結(jié)果表明,如SWEET14和SWEET15能夠參與激素信號(hào)調(diào)控,可調(diào)節(jié)對(duì)赤霉素的反應(yīng)[37];Clade IV(SWEET16/17)是一種液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,研究發(fā)現(xiàn)其主要用于運(yùn)輸葉片和根液泡膜中果糖[38]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),小黑麥TwSWEETs家族也被分為4個(gè)分支,與前人研究結(jié)果一致,通常情況下,相似的結(jié)構(gòu)意味著相似的功能,因此可推斷出小黑麥中不同蛋白成員轉(zhuǎn)運(yùn)的糖類及功能不同,但每條蛋白具體的功能還需進(jìn)一步深入研究。此外,研究發(fā)現(xiàn),小黑麥TwSWEETs與禾本科其他作物同源性較高,且與雙子葉植物擬南芥相比,禾本科作物均沒(méi)有SWEET8和SWEET9,說(shuō)明SWEET基因家族在單、雙子葉植物進(jìn)化上存在差異。

糖是生物體維持正常生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、代謝活動(dòng)不可缺少的基礎(chǔ)組分。非生物脅迫會(huì)干擾植物體的代謝和光合活動(dòng),導(dǎo)致糖穩(wěn)態(tài)被破壞。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,植物在脅迫環(huán)境下,體內(nèi)會(huì)積累大量可溶性糖,以此來(lái)降低體內(nèi)滲透勢(shì),維持正常生長(zhǎng),提高了植物抗逆能力[39]。SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠參與細(xì)胞器間、細(xì)胞間和組織器官間的糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,同時(shí)積極參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[40]。

姚利娜對(duì)茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn),AtSWEET4過(guò)表達(dá)植株中也積累了大量的葡萄糖和果糖,提高了植物的抗凍性[13]。在本研究中,干旱脅迫3 h時(shí),葉片和根系TwSWEET4均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá),低溫脅迫下,TwSWEET4表達(dá)均受到抑制,表明TwSWEET4參與了干旱和低溫脅迫的應(yīng)答,但響應(yīng)機(jī)制有所差異。Chen等對(duì)擬南芥進(jìn)行滲透脅迫發(fā)現(xiàn),其蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSWEET11/12會(huì)在干旱和ABA處理下被迅速磷酸化,該磷酸化會(huì)增強(qiáng)SWEETs蛋白的寡聚化和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性,從而使植物的根中含有更高的蔗糖含量,促進(jìn)了根部生長(zhǎng),從而增強(qiáng)了植物在干旱脅下干旱抗性和增加了根冠比[31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下葉片TwSWEET11相對(duì)表達(dá)量相比對(duì)照顯著下調(diào),而根系中的顯著上調(diào),表明根系可能積累了大量蔗糖從而增加了小黑麥的抗寒性。

徐磊等人[40]研究結(jié)果表明,小麥TaSWEET6基因在低溫、干旱、鹽脅迫處理下均上調(diào)表達(dá),本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),干旱及低溫脅迫處理12 h后,TwSWEET6a在葉片及根部的表達(dá)水平顯著升高,極顯著高于對(duì)照水平,與小麥中的研究結(jié)果基本一致。此外,其他課題組有研究發(fā)現(xiàn),干旱脅迫能夠上調(diào)擬南芥葉片和根中AtSWEET11/12的表達(dá)水平,促進(jìn)了從葉到根的碳循環(huán)[38],本研究中小黑麥葉片TwSWEET12基因在干旱和低溫脅迫過(guò)程中表現(xiàn)為先降低再升高(低溫脅迫時(shí)在12 h后相對(duì)表達(dá)量會(huì)再次降低),但是TwSWEET11并沒(méi)有與TwSWEET12保持顯著的一致性,此外葉片中TwSWEET11在干旱和低溫脅長(zhǎng)時(shí)間脅迫后期表達(dá)水平持續(xù)下調(diào),這表明TwSWEET11/12基因在作物小黑麥中的調(diào)控模式有別于模式植物擬南芥。

本研究發(fā)現(xiàn)TwSWEET2a/6a/12/16在干旱和低溫處理后,葉片及根部表達(dá)量會(huì)發(fā)生急劇升高或下降,可將它們作為研究小黑麥對(duì)非生物脅迫脅迫響應(yīng)的候選基因,如TwSWEET2a/6a/12/16可作為干旱脅迫候選基因,TwSWEET6a/16可作為寒冷脅迫候選基因。本研究為進(jìn)一步揭示作物逆境生理代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及優(yōu)良品種選育提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從小黑麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定得到16條TwSWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。所有TwSWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均是疏水性蛋白,包含6～7個(gè)TMHs,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示多數(shù)TwSWEETs蛋白定位在質(zhì)膜上,少數(shù)TwSWEETs存在多種定位結(jié)果。蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示α-螺旋結(jié)構(gòu)是主要的組成原件。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將其分為四個(gè)亞族,家族成員與禾本科多個(gè)作物的SWEET蛋白家族同源性高,保守性較強(qiáng)。TwSWEETs基因積極參與了小黑麥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程,其中,TwSWEET2a/6a/12/16在干旱或低溫脅迫下呈現(xiàn)出顯著差異表達(dá),可將它們作為研究小黑麥對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)的重要候選基因。