陳國(guó)榕, 李希來(lái), 李成一, 楊鵬年, 佘延娣, 吳 勇

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院, 青海 西寧 810016; 2. 重慶文理學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 重慶 永川 402160)

黃河上游區(qū)高寒草甸是青藏高原的主要草地類(lèi)型之一,在高原農(nóng)牧業(yè)、生物多樣性保護(hù)以及涵養(yǎng)水源等眾多方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。近幾十年來(lái),全球氣候變化及過(guò)度放牧等自然和人為因素造成的青藏高原高寒草甸嚴(yán)重退化。在高原鼠兔暴發(fā)干擾下,高寒草甸呈現(xiàn)局部死亡和剝蝕現(xiàn)象,草甸土壤自然沉降形成塌陷坑,形成了斑塊狀植被群落分布格局[3]。退化斑塊隨著高原鼠兔的頻繁活動(dòng)擴(kuò)大連通,最終形成裸露斑塊[4]。為了防止黃河上游區(qū)域高寒草甸斑塊化退化的進(jìn)一步發(fā)生,一般采取控制高原鼠兔數(shù)量進(jìn)行生態(tài)恢復(fù),使草地植物群落由裸露斑塊逐步演替形成為短期恢復(fù)斑塊(1—3年)、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊(10年以上),最終恢復(fù)至健康高寒草甸[3,5]。目前,眾多研究主要關(guān)注高寒草甸修復(fù)過(guò)程中植物群落組成、地上及地下生物量、土壤理化性質(zhì)、微生物群落等變化,對(duì)地下土壤動(dòng)物類(lèi)群研究較少[5]。

土壤線(xiàn)蟲(chóng)隸屬線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物門(mén),是一種分布廣泛、數(shù)量巨大的無(wú)脊椎動(dòng)物[6],其群落特征和個(gè)體形態(tài)對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)敏感,已被認(rèn)為是理想的環(huán)境指示生物,常用于評(píng)估土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能,有效地提升了地下生物多樣性和功能的精確化和可視化水平[7-8]?？蒲泄ぷ髡咔捌卺槍?duì)草地退化及植被恢復(fù)等狀態(tài)下線(xiàn)蟲(chóng)變化開(kāi)展了一系列研究,發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)群落組成與結(jié)構(gòu)隨著土壤環(huán)境和質(zhì)量發(fā)生顯著變化[9-10]。但是對(duì)黃河上游區(qū)不同類(lèi)型退化斑塊的植被類(lèi)型、土壤理化性質(zhì)變化研究較少,土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成和多樣性對(duì)不同類(lèi)型退化斑塊的響應(yīng)更是尚未得到進(jìn)一步研究。

土壤線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定方法由于其鑒定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成、結(jié)構(gòu)及多樣性調(diào)查中[11]。該方法基于線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征,在光學(xué)顯微鏡下對(duì)土壤中分離提取出的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。然而,形態(tài)學(xué)鑒定方法的使用仍具有局限性,例如需要專(zhuān)業(yè)分析鑒定人員,鑒定耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題[12]。隨著生物信息學(xué)及分子生物學(xué)的快速發(fā)展,近年來(lái),高通量測(cè)序技術(shù)為快速開(kāi)展線(xiàn)蟲(chóng)群落研究提供了可能[13-14],已被廣泛應(yīng)用于森林、草地及農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)中[15-16]。例如,Kerfahi等[17]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)熱帶雨林和北極凍土帶土壤線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)前者線(xiàn)蟲(chóng)群落多樣性更高;Darby等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)焚燒處理后的農(nóng)田土壤線(xiàn)蟲(chóng)豐富度高于焚燒前;Gao等[19]通過(guò)高通量測(cè)序法分析了荒漠草原露天礦廢棄地土壤性質(zhì)和線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)與功能,得到該生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵土壤線(xiàn)蟲(chóng)屬。高通量測(cè)序技術(shù)克服了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法的局限,具有較高的靈敏度,測(cè)序樣品量大且能夠提供更高的線(xiàn)蟲(chóng)分辨率[20],但同時(shí)存在鑒定結(jié)果不穩(wěn)定,對(duì)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群分析有偏差,只能以相對(duì)多度表征物種數(shù)量等弊端[21]。目前,關(guān)于形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序分析結(jié)果的一致性研究仍在繼續(xù)。Treonis等[22-23]對(duì)比了兩種分析方法,發(fā)現(xiàn)二者的豐度結(jié)果不一致;而Du等[12]則提出二者在土壤線(xiàn)蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群多度和生物量結(jié)果上呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此,關(guān)于高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及與形態(tài)學(xué)鑒定的差異性研究,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的討論。

本研究選擇黃河上游區(qū)門(mén)源縣不同類(lèi)型高寒草甸恢復(fù)斑塊的土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落作為研究對(duì)象,采用形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析,并輔以高通量測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)水平上對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)群落多樣性進(jìn)行調(diào)查,目的在于比較土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落在兩種分析方法下的差異,為后續(xù)土壤線(xiàn)蟲(chóng)的鑒定方法與研究提供科學(xué)思路。同時(shí)探討高寒草甸土壤理化性質(zhì)和其退化對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成的影響,為深入理解土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成在不同類(lèi)型斑塊化退化高寒草甸下的變化規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持,也為高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的草地管理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究地點(diǎn)位于青海省海北藏族自治州門(mén)源縣東部黃河二級(jí)支流大通河境內(nèi)(37°46′57″N,101°19′57″E),選取海拔介于3 115～3 128 m的高寒草甸進(jìn)行取樣。門(mén)源縣年平均氣溫0.8℃,年降水量350～600 mm,該區(qū)域內(nèi)草地類(lèi)型為高寒草甸,主要優(yōu)勢(shì)植物有矮生嵩草(Kobresiahumilis)、針茅(Stipacapillata)、和黑褐苔草(Carexsupina)等。

1.2 樣地選擇

2022年8月,在門(mén)源縣研究區(qū),采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),隨機(jī)選取裸露斑塊及其他不同類(lèi)型恢復(fù)斑塊。斑塊的分類(lèi)以植被類(lèi)型和植被總蓋度為依據(jù),一般分為裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊等3類(lèi)斑塊。裸露斑塊為高原鼠兔頻繁活動(dòng)區(qū),土壤裸露疏松,植被蓋度幾乎為0;短期恢復(fù)斑塊為禁止高原鼠兔活動(dòng)后形成的斑塊,具有少量如密花香薷(Elsholtziadensa)和細(xì)葉亞菊(Ajaniatenuifolia)等雜類(lèi)草植物,植被蓋度在20%～40%;長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊為短期恢復(fù)斑塊進(jìn)一步演替所形成,主要以矮生嵩草為優(yōu)勢(shì)物種,植被蓋度大于40%,詳見(jiàn)宋梓涵和孫華芳[5,24]的研究。植被調(diào)查在不同斑塊類(lèi)型高寒草甸內(nèi),采用50 cm × 50 cm的樣方重復(fù)測(cè)量3次。調(diào)查樣地裸露斑塊植被總蓋度基本為0,短期恢復(fù)斑塊植被總蓋度約為39%,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊約為62%,高寒草甸約為86%。

1.3 樣品采集與分析方法

在3種退化斑塊及高寒草甸內(nèi)各隨機(jī)選取3個(gè)50 cm×50 cm的樣方,用直徑5 cm的土鉆,通過(guò)五點(diǎn)取樣法分別挖取0～15 cm土壤混合裝入自封袋中,同種斑塊類(lèi)型均可以得到 3個(gè)土壤樣品。采集的土壤樣品過(guò)5 mm篩后分為3份,1份置于冰箱于4℃冷藏,用于形態(tài)鑒定法下分離和提取土壤線(xiàn)蟲(chóng);1份在-80℃冷凍保存,用于土壤線(xiàn)蟲(chóng)的高通量測(cè)序分析;1份帶回實(shí)驗(yàn)室陰干備用,用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。采用重量分析法測(cè)定土壤含水量,利用AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全氮(Total nitrogen,TN)、全磷(Total phosphorus,TP),利用火焰光度法測(cè)定土壤全鉀(Total potassium,TK),利用電位法測(cè)定土壤pH值。

1.4 土壤線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)學(xué)分離鑒定方法

利用改良的貝爾曼漏斗法在30 g濕潤(rùn)的土壤樣品中分離線(xiàn)蟲(chóng)48 h,用無(wú)水甘油和酒精溶液固定并制片,在顯微鏡下根據(jù)每條線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)特征,參照尹文英[25]和Bongers[26]對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類(lèi)并計(jì)數(shù)。從每個(gè)樣品中隨機(jī)抽取100條線(xiàn)蟲(chóng)(不足100條的全部鑒定)進(jìn)行科屬鑒定,本文根據(jù)線(xiàn)蟲(chóng)的頭部形態(tài)學(xué)特征和取食生境將土壤線(xiàn)蟲(chóng)鑒定到屬水平。每個(gè)樣品中線(xiàn)蟲(chóng)的總數(shù)量可以轉(zhuǎn)換為每100 g干土中線(xiàn)蟲(chóng)的條數(shù)。依據(jù)線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)特征進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群分類(lèi),將土壤線(xiàn)蟲(chóng)劃分為5個(gè)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群:植食線(xiàn)蟲(chóng)(Plant feeders)、食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)(Bacterivores)、食真菌線(xiàn)蟲(chóng)(Fungivores)、捕食線(xiàn)蟲(chóng)(Predators)和雜食線(xiàn)蟲(chóng)(Omnivores),并依據(jù)線(xiàn)蟲(chóng)的生活史確定其c-p值,取值范圍為1～5之間[27]。

1.5 土壤線(xiàn)蟲(chóng)DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

使用Power Soil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)試劑盒提取各樣地不同類(lèi)型退化斑塊總DNA,并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。采用18S通用引物(5′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′)和(5′-AGCGACGGGCGGTGTGTACAAA-3′)擴(kuò)增18S rDNA的V4可變區(qū),擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?NF1-18Sr2b),PCR擴(kuò)增總體系為25 μL。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小(170 V,30 min),并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒(Beckman Coulter,Kraemer Boulevard Brea,CA,USA)純化?；赑CR產(chǎn)物建立線(xiàn)蟲(chóng)群落測(cè)序文庫(kù),在Illumina MiSeq平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。以上過(guò)程均委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)后,根據(jù)條形碼序列在QIIME(v1.8.0)軟件中對(duì)樣本進(jìn)行分割,并通過(guò)Trimmomatic(v0.36)和Pear(v0.9.6)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,以去除得分低于 20、含有模糊堿基和引物錯(cuò)配的序列[28]。然后,用Flash(v1.20)和Pear(v0.9.6)軟件對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,拼接時(shí)最小overlap設(shè)置為10 bp,錯(cuò)配率為 0.1[29]。使用Vsearch(v2.7.1)軟件中的的denovo方法去除短序列和嵌合體序列。在Vsearch(v2.7.1)軟件中,根據(jù)uparse算法,以 97% 的相似性閾值(Edgar,2013 年)對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units)聚類(lèi)。在NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中,設(shè)置1e-5的閾值,通過(guò)Blast算法獲得了與物種相對(duì)應(yīng)的每個(gè)OTU的分類(lèi)信息[30]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)分析采用以下指標(biāo):

物種數(shù)(S):

S= the total number of taxa in each plot

均勻度指數(shù)(J′)[31]:

J′=H′/lnS

(1)

香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H′)[32]:

H′=-∑Pi(lnPi)

(2)

辛普森(Simpson)[33]:

(3)

式中Pi為第i類(lèi)群中的個(gè)體數(shù)占線(xiàn)蟲(chóng)群落所有類(lèi)群的個(gè)體總數(shù)的比例,式中S為類(lèi)群數(shù)。

成熟度指數(shù)(MI)[27]:

MI=∑ci×fi

(4)

該指數(shù)用于描述土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和受干擾影響的程度。式中,ci為自由生活線(xiàn)蟲(chóng)的生活史c-p值,fi為土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落中自由生活線(xiàn)蟲(chóng)所占的比例。

線(xiàn)蟲(chóng)通路比(NCR)[8]:

NCR=Ba/(Ba+Fu)

(5)

該指數(shù)用于描述分解通道中食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)和食真菌線(xiàn)蟲(chóng)的重要性,反映土壤有機(jī)質(zhì)分解途徑。式中,Ba為食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量,Fu為食真菌線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量。

富集指數(shù)(EI)[34]:

EI=100×(e/(e+b)

(6)

該指數(shù)用于描述外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入的水平。式中,e=3.2Ba1+0.8Fu2,b=0.8(Ba2+Fu2)。

結(jié)構(gòu)指數(shù)(SI)[35]:

SI=100×(s/(s+b)

(7)

該指數(shù)用于描述示土壤食物網(wǎng)的連通性和食物鏈的長(zhǎng)度。式中,

s=(Ban×Wn)+(Fun×Wn)+(Opn×Wn),n=3,4,5;W3=1.8,W4=3.2,W5=5.0。

本研究采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析(One-Way ANOVA)用于比較不同斑塊化退化高寒草甸下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落特征的差異(P<0.05),平均值多重比較采用LSD法。采用Origin 2019軟件對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)群落進(jìn)行主成分分析,解釋不同恢復(fù)斑塊類(lèi)型下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類(lèi)型斑塊土壤理化性質(zhì)特征

門(mén)源縣不同類(lèi)型斑塊化草甸及高寒草甸理化性質(zhì)如表1所示。pH值隨植被恢復(fù)程度的增加而降低,在裸露斑塊中達(dá)到最大值7.74,顯著高于其他三類(lèi)草甸(P<0.05)。土壤含水量、全氮的結(jié)果與pH值相反,在高寒草甸中顯著高于其他裸露斑塊和其他兩類(lèi)恢復(fù)斑塊(P<0.05)。全磷含量隨著斑塊的恢復(fù)增高,但低于高寒草甸含量(1.45 g·kg-1)。全鉀在短期恢復(fù)斑塊中含量最高,為2.72%,顯著高于裸露斑塊和其他兩類(lèi)草甸(P<0.05)。

表1 不同斑塊化退化高寒草甸土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of different patches of degraded alpine meadow soil

2.2 土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落多度 在形態(tài)學(xué)鑒定方法下,從門(mén)源縣不同斑塊類(lèi)型及高寒草甸土壤中分離提取線(xiàn)蟲(chóng)平均密度為1 074條·100 g-1干土。調(diào)查結(jié)果表明,門(mén)源縣不同類(lèi)型斑塊化土壤線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量變化趨勢(shì)為:裸露斑塊<短期恢復(fù)斑塊<長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊<高寒草甸(圖1)。其中,短期恢復(fù)斑塊和長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊土壤線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量之間無(wú)顯著差異,但顯著高于裸露斑塊(P<0.05),而高寒草甸土壤線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量與長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊之間無(wú)顯著差異,但顯著高于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊(P<0.05)。

圖1 形態(tài)學(xué)鑒定下不同斑塊類(lèi)型線(xiàn)蟲(chóng)群落數(shù)量(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸Fig.1 Total abundance of soil nematode communities in different degraded patches with morphological identification method (mean+SE). BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows

通過(guò)高通量測(cè)序法只能比較不同采樣地的線(xiàn)蟲(chóng)序列數(shù)量,獲得土壤線(xiàn)蟲(chóng)的相對(duì)多度,無(wú)法獲得土壤線(xiàn)蟲(chóng)的絕對(duì)多度。裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊及高寒草甸通過(guò)高通量測(cè)序獲得隸屬于線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)分別為6 419,7 480,1 286及2 199條。土壤樣品序列數(shù)由高到低依次為短期恢復(fù)斑塊、裸露斑塊、高寒草甸、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊,這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果變化趨勢(shì)不一致。

2.2.2屬組成 通過(guò)形態(tài)學(xué)分離鑒定,共得到土壤線(xiàn)蟲(chóng)42屬,其中有29個(gè)屬在高通量測(cè)序法中也被鑒定到(表2),在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定27,24,28和33屬。三類(lèi)恢復(fù)斑塊及高寒草甸上優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)多度>10%)和常見(jiàn)屬(相對(duì)多度>1%)數(shù)量占線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)的比例達(dá)到93%以上,稀有線(xiàn)蟲(chóng)屬(相對(duì)多度<1%)為別為15,9,9和15個(gè)。不同斑塊化退化草甸下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成存在明顯差異(圖2)。裸露斑塊的優(yōu)勢(shì)屬為Cylindrolaimus,Diploseapter,Eucephalobus和Teratocephalus,其個(gè)體數(shù)量分別占總體的21.23%,15.14%,12.42%和11.11%;短期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢(shì)屬為Chiloplacus,Mesorhabditis和Rhabdolaimus,分別占總體的16.76%,11.64%和19.56%;長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢(shì)屬為Acrobeloides,Cervidellus和Plectus,其數(shù)量分別占總體的11.31%,10.32%和11.51%;高寒草甸的優(yōu)勢(shì)屬為Caenorhabditis和Cervidellus,占比分別為11.09%和11.42%。對(duì)不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成進(jìn)行主成分分析,前兩軸分別解釋了29.8%和21.2%的變異信息(累計(jì)達(dá)51.0%)(圖3a),結(jié)果表明土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落在屬水平上的組成格局具有差異。與短期恢復(fù)斑塊相比,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊、高寒草甸土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成與裸露斑塊差異更顯著(圖3a)。

圖2 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊土壤線(xiàn)蟲(chóng)屬水平相對(duì)豐度。a:形態(tài)學(xué)鑒定法;b:高通量測(cè)序法;BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸Fig.2 Relative abundance of Nematode at genus level under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River under morphological identification a and HTS b. BP,SP,LP and AM represent bare patches,short-term recovery patches,long-term recovery patches and alpine meadows,respectively

圖3 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的主成分分析。a,形態(tài)學(xué)鑒定法;b,高通量測(cè)序法Fig.3 Principal component analysis of soil nematode communities under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River. a,Morphological identification method;b,High-throughput sequencing method

表2 基于形態(tài)學(xué)鑒定法和高通量測(cè)序法測(cè)定的黃河上游區(qū)斑塊化退化斑塊土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落屬相對(duì)多度Table 2 Relative abundance of soil nematode genera under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River based on morphological identification and high-throughput sequencing.

利用高通量測(cè)序鑒定到100屬,裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定87,83,85和90屬(表2),顯著高于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。在高通量測(cè)序中,優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)多度> 10%)和常見(jiàn)屬(相對(duì)多度> 1%)的數(shù)量占線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)的比例達(dá)到81%以上。相較于形態(tài)學(xué)鑒定方法,高通量測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)稀有屬(相對(duì)多度< 1%)方面有更大的優(yōu)勢(shì),裸露斑塊、恢復(fù)斑塊及高寒草甸中有65～74個(gè)稀有線(xiàn)蟲(chóng)屬,其中部分屬的相對(duì)多度甚至小于0.1%。不同斑塊化退化草甸下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成也存在明顯差異(圖2)。其中,裸露斑塊的優(yōu)勢(shì)屬為Hemicriconemoides,Paratylenchus和Prismatolaimus,相對(duì)多度占比依次為13.65%,30.53%和12.69%;短期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢(shì)屬為Dorylaimellus,Filenchus,Helicotylenchus和Prismatolaimus,相對(duì)多度占比分別為10.84%,11.52%,29.70%和12.30%;高寒草甸的優(yōu)勢(shì)屬Helicotylenchus,相對(duì)多度為13.26%。基于高通量測(cè)序法,對(duì)不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成進(jìn)行主成分分析,前兩軸分別解釋了27.7%和20.3%的變異信息(累計(jì)達(dá)48.0%)(圖3b),結(jié)果表明高通量測(cè)序技術(shù)下土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落在屬水平上的組成格局相似度較高(圖3b)。

2.2.3營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群組成 通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法共得到植食線(xiàn)蟲(chóng)8屬,食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)17屬,食真菌線(xiàn)蟲(chóng)7屬,捕食線(xiàn)蟲(chóng)4屬,雜食線(xiàn)蟲(chóng)6屬(表2),不同斑塊高寒草甸下線(xiàn)蟲(chóng)群落營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群結(jié)構(gòu)不同,但無(wú)顯著性差異(圖4a)。植食線(xiàn)蟲(chóng)在裸露斑塊、恢復(fù)斑塊和高寒草甸上的變化趨勢(shì)為高寒草甸>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)則為長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>高寒草甸;食真菌線(xiàn)蟲(chóng)在高寒草甸中最多,裸露斑塊次之,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊最少;捕食線(xiàn)蟲(chóng)在三類(lèi)斑塊類(lèi)型和高寒草甸上的變化趨勢(shì)為裸露斑塊>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊;雜食線(xiàn)蟲(chóng)多度由高到低依次為短期恢復(fù)斑塊、裸露斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊及高寒草甸?？傮w來(lái)看,形態(tài)學(xué)鑒定中土壤線(xiàn)蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群數(shù)量排序?yàn)槭臣?xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)>植食線(xiàn)蟲(chóng)>食真菌線(xiàn)蟲(chóng)>雜食線(xiàn)蟲(chóng)>捕食線(xiàn)蟲(chóng)(圖4a)。

圖4 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊下土壤線(xiàn)蟲(chóng)各營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群的相對(duì)多度(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.4 Relative abundance (mean + SE) of soil nematode communities under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River注:a,形態(tài)學(xué)鑒定法;b,高通量測(cè)序法。BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸。Pf,植食線(xiàn)蟲(chóng);Ba,食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng);Fu,食真菌線(xiàn)蟲(chóng);Pr,捕食線(xiàn)蟲(chóng);Om,雜食線(xiàn)蟲(chóng)Note:a,Morphological identification method;b,High-throughput sequencing method. BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows. Pf,Plant-feeding nematodes;Ba,bacterivores;Fu,fungivores;Pr,predators;Om,omnivores

在高通量測(cè)序技術(shù)中共得到植食線(xiàn)蟲(chóng)50屬,食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)19屬,食真菌線(xiàn)蟲(chóng)12屬,捕食線(xiàn)蟲(chóng)10屬,雜食線(xiàn)蟲(chóng)9屬(表2),同形態(tài)學(xué)鑒定法,不同斑塊高寒草甸下線(xiàn)蟲(chóng)群落營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群結(jié)構(gòu)不同,但無(wú)顯著性差異(圖4b)。植食線(xiàn)蟲(chóng)在三類(lèi)斑塊類(lèi)型和高寒草甸上的變化趨勢(shì)為高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊;食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)則為裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>高寒草甸;食真菌線(xiàn)蟲(chóng)在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊中最多,裸露斑塊次之,短期恢復(fù)斑塊最少;捕食線(xiàn)蟲(chóng)在三類(lèi)斑塊類(lèi)型和高寒草甸上的變化趨勢(shì)為長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;雜食線(xiàn)蟲(chóng)多度由高到低依次為長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊、高寒草甸、裸露斑塊及短期恢復(fù)斑塊。總體來(lái)看,高通量測(cè)序技術(shù)中土壤線(xiàn)蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群數(shù)量排序?yàn)橹彩尘€(xiàn)蟲(chóng)>食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)>食真菌線(xiàn)蟲(chóng)>雜食線(xiàn)蟲(chóng)>捕食線(xiàn)蟲(chóng)(圖4b)。

2.3 斑塊類(lèi)型對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生態(tài)功能的影響

在形態(tài)學(xué)鑒定下,土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能指數(shù)受到不同斑塊類(lèi)型的影響(表3)。在線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)方面,不同斑塊類(lèi)型下物種數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.001),均勻度指數(shù)和辛普森指數(shù)出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。具體來(lái)看,物種數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)在不同斑塊類(lèi)型和高寒草甸的變化趨勢(shì)一致,為高寒草甸>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;均勻度指數(shù)和辛普森指數(shù)在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊中最高,高寒草甸次之,裸露斑塊最低(圖5),這表明長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸顯著提高了土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落多樣性。在不同斑塊類(lèi)型下,生態(tài)功能指數(shù)除了線(xiàn)蟲(chóng)通路比無(wú)顯著性差異,成熟度指數(shù)、富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)均為及顯著差異(P<0.001)。形態(tài)學(xué)鑒定中,成熟度指數(shù)的變化趨勢(shì)為裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>高寒草甸,富集指數(shù)則在高寒草甸中最高,短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊次之,裸露斑塊中最低;線(xiàn)蟲(chóng)通路比均大于0.5,這說(shuō)明所有樣地中土壤食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量高于食真菌線(xiàn)蟲(chóng)(圖5)。

圖5 形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序技術(shù)下不同恢復(fù)斑塊類(lèi)型對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)物種數(shù)(a)、均勻度指數(shù)(b)、香農(nóng)-威納指數(shù)(c)、辛普森指數(shù)(d)、成熟度指數(shù)(e)、線(xiàn)蟲(chóng)通路比(f)、富集指數(shù)(g)和結(jié)構(gòu)指數(shù)(h)的影響(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.5 Effect of different recovery patches on Spices (a),Pielou(b),Shannon-wiener(c),Simpson(d),Maturity Index(e),Nematode Channel Ratio(f),Enrichment Index(g),and Structure Index(h) (mean + SE) of total nematodes under Morphological identification method and High-throughput sequencing method注:BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸。不同小寫(xiě)字母表示樣地間差異顯著(P<0.05)Note:BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

表3 形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序技術(shù)下斑塊類(lèi)型對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的影響Table 3 Effects of different recovery patches on nematode communities structure and Nematode community ecological function under morphological identification and high-throughput sequencing methods

在高通量測(cè)序技術(shù)下,僅有均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)在不同斑塊類(lèi)型下出現(xiàn)顯著性差異(P<0.001),變化趨勢(shì)為長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊,與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果基本一致,表明斑塊化退化高寒草甸的恢復(fù)顯著提高了土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落豐富度(圖5)。不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸中的物種數(shù)均高于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊和高寒草甸中變化趨勢(shì)同均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)一致,但物種數(shù)在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊中最低。成熟度指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊和長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊中趨勢(shì)一致,具體表現(xiàn)為裸露斑塊>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊,高寒草甸的成熟度指數(shù)最低,但結(jié)構(gòu)指數(shù)僅次于長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊。同樣在所有斑塊類(lèi)型下的線(xiàn)蟲(chóng)通路比均大于0.5,這說(shuō)明所有樣地中土壤食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量高于食真菌線(xiàn)蟲(chóng),這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。富集指數(shù)隨著斑塊的恢復(fù)逐漸增大,在高寒草甸中最高。

3 討論

3.1 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測(cè)序法的土壤線(xiàn)蟲(chóng)多度比較

形態(tài)學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確獲得土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的絕對(duì)多度,而高通量測(cè)序技術(shù)只能通過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)序列數(shù)量獲得線(xiàn)蟲(chóng)群落的相對(duì)多度[36]。分析結(jié)果表明,兩種分析方法測(cè)得的土壤線(xiàn)蟲(chóng)多度在退化斑塊恢復(fù)演替過(guò)程(裸露斑塊—短期恢復(fù)斑塊—長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊—高寒草甸)中發(fā)生了明顯的變化,且變化趨勢(shì)基本不一致,具體表現(xiàn)為:形態(tài)學(xué)鑒定方法中,裸露斑塊中的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量最低,短期恢復(fù)斑塊和長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊逐漸增加,在高寒草甸中達(dá)到最高,該結(jié)論與Wang等[37-38]的結(jié)論一致;在高通量測(cè)序中不同斑塊類(lèi)型高寒草甸的土壤線(xiàn)蟲(chóng)多度變化趨勢(shì)為短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>高寒草甸>長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊。導(dǎo)致兩種方法下線(xiàn)蟲(chóng)多度趨勢(shì)不同的原因可能是由于高通量測(cè)序技術(shù)下線(xiàn)蟲(chóng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善。在本研究中,基于形態(tài)學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)土壤線(xiàn)蟲(chóng)多度與pH值、土壤含水量、全氮和全鉀含量的變化趨勢(shì)有關(guān)(表1)。其中,土壤線(xiàn)蟲(chóng)多度隨著土壤含水量、全氮和全鉀的升高而增加,pH值的變化趨勢(shì)則相反,該結(jié)果與Wang等人的研究一致[39-40]。這可能是由于隨著斑塊化退化高寒草甸的恢復(fù),植物地上、地下物種多樣性增加,土壤營(yíng)養(yǎng)元素含量升高,顯著改善了輸入土壤的資源與數(shù)量[41],為線(xiàn)蟲(chóng)提供了更為多樣化的食物資源[42]。

3.2 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測(cè)序法的土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落組成和結(jié)構(gòu)比較

形態(tài)學(xué)鑒定方法與高通量測(cè)序技術(shù)相比,二者的區(qū)別還在于高通量測(cè)序技術(shù)具有更高的分類(lèi)學(xué)分辨率[23]。形態(tài)學(xué)鑒定法一般將線(xiàn)蟲(chóng)鑒定到屬水平,且需要花費(fèi)大量時(shí)間,而高通量測(cè)序技術(shù)可以短時(shí)間內(nèi)提供線(xiàn)蟲(chóng)在物種水平上的信息。此外,高通量測(cè)序技術(shù)較形態(tài)學(xué)鑒定方法來(lái)說(shuō),可以注釋到更多的線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)群數(shù)[22]。通過(guò)形態(tài)學(xué)分離鑒定,共得到土壤線(xiàn)蟲(chóng)43屬,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定21,18,19和25屬。利用高通量測(cè)序鑒定到101屬,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定90,92,85和91屬。通過(guò)兩種分析方法鑒定出的線(xiàn)蟲(chóng)屬數(shù)量差異較大的原因可能是由于在形態(tài)學(xué)鑒定中,采用貝爾曼漏斗法,通常利用線(xiàn)蟲(chóng)自身的重量和趨水性分離提取線(xiàn)蟲(chóng),故受外部環(huán)境溫度以及線(xiàn)蟲(chóng)的活性影響比較大,導(dǎo)致部分線(xiàn)蟲(chóng)損失[43]。而高通量測(cè)序技術(shù)則是通過(guò)引物擴(kuò)增DNA,可以獲得更多的線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)群,尤其是稀有線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)群(相對(duì)多度<1%)的獲得[12]。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù),測(cè)得地中有65～76個(gè)稀有線(xiàn)蟲(chóng)屬,其中部分屬的相對(duì)多度甚至小于0.1%。

盡管高通量測(cè)序技術(shù)可以獲得更多的線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)群,但在本研究中通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定方法任有13個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)屬無(wú)法通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)鑒定到。例如食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)的廣桿屬(Caenorhabditis)、頭葉屬(Cephalobus)、鹿角唇屬(Cervidellus)、板唇屬(Chiloplacus)、鉤唇屬(Diploseapter)、中桿屬(Mesorhabditis)和原桿屬(Protorhabditis),食真菌線(xiàn)蟲(chóng)的莖屬(Ditylenchus),捕食線(xiàn)蟲(chóng)的狹咽屬(Discolaimium)、真矛線(xiàn)屬(Eudorylaimus)、厚唇屬(Labronema)及雜食線(xiàn)蟲(chóng)的異矛線(xiàn)屬(Allodorylaimus)、庫(kù)氏線(xiàn)屬(Coomansinema),導(dǎo)致通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得的食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)、捕食線(xiàn)蟲(chóng)的相對(duì)多度有所下降。此外,高通量測(cè)序技術(shù)獲得植食線(xiàn)蟲(chóng)50屬,顯著高于形態(tài)學(xué)鑒定方法得到的8屬。這些結(jié)果表明,兩種方法獲得的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群有差異,高通量測(cè)序在植食線(xiàn)蟲(chóng)的獲得方面具有優(yōu)勢(shì),而形態(tài)學(xué)鑒定易于獲得更多的食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng),這與Gao等[14,44]的研究結(jié)果一致。造成兩種方法在線(xiàn)蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)類(lèi)群鑒定方面產(chǎn)生差異的主要原因可能是:(1)在形態(tài)學(xué)鑒定中處于不同發(fā)育階段的線(xiàn)蟲(chóng)鑒定起來(lái)存在困難[45-46];(2)在高通量測(cè)序技術(shù)中,目前使用到的數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的線(xiàn)蟲(chóng)序列多集中在植食線(xiàn)蟲(chóng),且部分線(xiàn)蟲(chóng)在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有已知的匹配項(xiàng),導(dǎo)致無(wú)法識(shí)別[12]。因此在未來(lái)的研究中有必要補(bǔ)充和改進(jìn)參考數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序技術(shù)可以加速不同規(guī)模和生態(tài)系統(tǒng)中線(xiàn)蟲(chóng)群落的研究。

兩種分析方法的PCA分析結(jié)果表明:形態(tài)學(xué)鑒定下,裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊與長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊及高寒草甸間土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成存在顯著差異(圖3a),表現(xiàn)在不同種類(lèi)斑塊的優(yōu)勢(shì)屬不同(圖2a);高通量測(cè)序技術(shù)中,不同斑塊類(lèi)型及高寒草甸中土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成差異性不大(圖3b)?？傮w來(lái)看,在形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序技術(shù)中,土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的優(yōu)勢(shì)屬由食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)化為植食線(xiàn)蟲(chóng)。具體看來(lái),在形態(tài)學(xué)鑒定中,植食線(xiàn)蟲(chóng)多度隨斑塊的恢復(fù)逐漸增加(圖5a),這可能是由于植被的恢復(fù)為植食線(xiàn)蟲(chóng)提供了更多食物資源[47]。捕食線(xiàn)蟲(chóng)和雜食線(xiàn)蟲(chóng)分別在裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊中相對(duì)多度最高(圖5a),可能是由于補(bǔ)償機(jī)制的出現(xiàn),導(dǎo)致耐受性捕-雜食線(xiàn)蟲(chóng)種群在該類(lèi)斑塊類(lèi)型下增加[48]。高通量測(cè)序技術(shù)中,植食線(xiàn)蟲(chóng)在高寒草甸中最大(圖5b),結(jié)果與形態(tài)學(xué)一致。捕食線(xiàn)蟲(chóng)、雜食線(xiàn)蟲(chóng)和食真菌線(xiàn)蟲(chóng)在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊中相對(duì)多度最高(圖5b),表明在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊下,生態(tài)系統(tǒng)最為穩(wěn)定。

3.3 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測(cè)序法的土壤線(xiàn)蟲(chóng)生態(tài)指數(shù)比較

線(xiàn)蟲(chóng)群落生態(tài)指數(shù)反映了線(xiàn)蟲(chóng)群落的組成結(jié)構(gòu)、多樣性及食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能特征,對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境具有指示作用[27,49]。本研究表明在兩種分析方法下,土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)生態(tài)功能指數(shù)會(huì)受到斑塊類(lèi)型的影響(表3)。在形態(tài)學(xué)鑒定中,斑塊類(lèi)型的不同,極顯著的影響了門(mén)源縣的物種數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、成熟度指數(shù)富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù),均勻度指數(shù)、辛普森指數(shù)也在三類(lèi)退化斑塊和高寒草甸中有顯著性差異。而在高通量測(cè)序技術(shù)中,僅有均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)及辛普森指數(shù)受到斑塊類(lèi)型的影響,其他生態(tài)指數(shù)未出現(xiàn)顯著性差異。

已有研究表明,退化高寒草甸的恢復(fù)能夠顯著提高土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性[50-52]。在本研究中也得到了一致的結(jié)論,即長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸的物種數(shù)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)及辛普森指數(shù)均顯著高于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊,這也再次證實(shí)了隨著黃河上游區(qū)斑塊化高寒草甸的恢復(fù)改善了線(xiàn)蟲(chóng)生活環(huán)境[53],提升了進(jìn)入土壤的資源數(shù)量和土壤質(zhì)量,導(dǎo)致土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性得到顯著提高[42]。在高通量測(cè)序中,物種數(shù)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)的結(jié)果與形態(tài)學(xué)相似,即在長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊和高寒草甸中均大于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊,這也再次證實(shí)了長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊顯著改善了土壤食物資源,表明兩種群落分析方法在土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落多樣性對(duì)退化斑塊的響應(yīng)上結(jié)果一致。

在兩種分析方法中,成熟度指數(shù)基本隨著斑塊化高寒草甸的恢復(fù)逐漸降低,并在高寒草甸中達(dá)到最低值。裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊成熟度指數(shù)較大的原因可能是由于隨著高寒草甸退化程度的增大,土壤孔隙度增大,捕食線(xiàn)蟲(chóng)和雜食線(xiàn)蟲(chóng)的比例增加,導(dǎo)致在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊中出現(xiàn)通過(guò)捕食線(xiàn)蟲(chóng)、雜食線(xiàn)蟲(chóng)驅(qū)動(dòng)的下行效應(yīng)調(diào)控[11]。線(xiàn)蟲(chóng)通路比(NCR)反映了土壤有機(jī)質(zhì)分解途徑,用于評(píng)估土壤有機(jī)質(zhì)分解中細(xì)菌通道和真菌通道的相對(duì)重要性[8]。兩種分析方法結(jié)果表明不同退化斑塊高寒草甸的土壤線(xiàn)蟲(chóng)NCR指數(shù)均大于0.5,說(shuō)明黃河上游區(qū)退化斑塊土壤食物網(wǎng)有機(jī)質(zhì)的分解以細(xì)菌通道為主。線(xiàn)蟲(chóng)富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)分別用于指示土壤食物網(wǎng)的復(fù)雜性和評(píng)估食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)和食真菌線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)環(huán)境的敏感程度。在形態(tài)學(xué)鑒定中,短期恢復(fù)斑塊、長(zhǎng)期恢復(fù)斑塊及高寒草甸富集指數(shù)大于50,這表明上述兩種斑塊及高寒草甸土壤養(yǎng)分富集狀況較好,而其裸露斑塊土壤富集狀況相對(duì)較差[8]。然而,在高通量測(cè)序技術(shù)中,僅有高寒草甸線(xiàn)蟲(chóng)富集指數(shù)高于50。兩種分析方法所獲得的結(jié)構(gòu)指數(shù)均高于50,表明退化斑塊土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性較好,土壤食物網(wǎng)的連通性和復(fù)雜性較高[27]。

4 結(jié)論

土壤線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明隨著退化斑塊的自然恢復(fù),土壤線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量逐漸增加,與高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)果不一致。兩種分析方法的生態(tài)指數(shù)測(cè)定結(jié)果均表明隨著退化斑塊的恢復(fù),土壤線(xiàn)蟲(chóng)生物多樣性增加。綜合比較,形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測(cè)序技術(shù)在線(xiàn)蟲(chóng)群落特征調(diào)查各有利弊,形態(tài)學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確獲得土壤線(xiàn)蟲(chóng)群落的絕對(duì)多度,而高通量測(cè)序技術(shù)只能通過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)序列數(shù)量獲得線(xiàn)蟲(chóng)群落的相對(duì)多度,但高通量測(cè)序技術(shù)具有更高的分類(lèi)學(xué)分辨率,可以短時(shí)間內(nèi)提供線(xiàn)蟲(chóng)在物種水平上的信息。此外,高通量測(cè)序技術(shù)可以注釋到更多的線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)群數(shù)。相較于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果以食細(xì)菌線(xiàn)蟲(chóng)為主,高通量測(cè)序技術(shù)則以植食線(xiàn)蟲(chóng)為主,這有助于探索退化草甸恢復(fù)過(guò)程中植食線(xiàn)蟲(chóng)隨植被恢復(fù)的變化,同時(shí)也會(huì)過(guò)度放大植食線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。盡管高通量測(cè)序技術(shù)為快速洞察線(xiàn)蟲(chóng)多樣性提供了有效的技術(shù)手段,但仍存在一些局限性導(dǎo)致其測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性、與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的一致性較差。因此,高通量測(cè)序在線(xiàn)蟲(chóng)多樣性研究中的應(yīng)用在未來(lái)需要不斷驗(yàn)證和更新,以期為線(xiàn)蟲(chóng)群落快速鑒定和評(píng)價(jià)斑塊化退化高寒草甸提供有力支持。