陳國榕, 李希來, 李成一, 楊鵬年, 佘延娣, 吳 勇

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院, 青海 西寧 810016; 2. 重慶文理學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 重慶 永川 402160)

黃河上游區(qū)高寒草甸是青藏高原的主要草地類型之一,在高原農(nóng)牧業(yè)、生物多樣性保護(hù)以及涵養(yǎng)水源等眾多方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。近幾十年來,全球氣候變化及過度放牧等自然和人為因素造成的青藏高原高寒草甸嚴(yán)重退化。在高原鼠兔暴發(fā)干擾下,高寒草甸呈現(xiàn)局部死亡和剝蝕現(xiàn)象,草甸土壤自然沉降形成塌陷坑,形成了斑塊狀植被群落分布格局[3]。退化斑塊隨著高原鼠兔的頻繁活動擴(kuò)大連通,最終形成裸露斑塊[4]。為了防止黃河上游區(qū)域高寒草甸斑塊化退化的進(jìn)一步發(fā)生,一般采取控制高原鼠兔數(shù)量進(jìn)行生態(tài)恢復(fù),使草地植物群落由裸露斑塊逐步演替形成為短期恢復(fù)斑塊(1—3年)、長期恢復(fù)斑塊(10年以上),最終恢復(fù)至健康高寒草甸[3,5]。目前,眾多研究主要關(guān)注高寒草甸修復(fù)過程中植物群落組成、地上及地下生物量、土壤理化性質(zhì)、微生物群落等變化,對地下土壤動物類群研究較少[5]。

土壤線蟲隸屬線蟲動物門,是一種分布廣泛、數(shù)量巨大的無脊椎動物[6],其群落特征和個體形態(tài)對環(huán)境擾動的響應(yīng)敏感,已被認(rèn)為是理想的環(huán)境指示生物,常用于評估土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能,有效地提升了地下生物多樣性和功能的精確化和可視化水平[7-8]?？蒲泄ぷ髡咔捌卺槍Σ莸赝嘶爸脖换謴?fù)等狀態(tài)下線蟲變化開展了一系列研究,發(fā)現(xiàn)線蟲群落組成與結(jié)構(gòu)隨著土壤環(huán)境和質(zhì)量發(fā)生顯著變化[9-10]。但是對黃河上游區(qū)不同類型退化斑塊的植被類型、土壤理化性質(zhì)變化研究較少,土壤線蟲群落組成和多樣性對不同類型退化斑塊的響應(yīng)更是尚未得到進(jìn)一步研究。

土壤線蟲形態(tài)學(xué)鑒定方法由于其鑒定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于土壤線蟲群落的組成、結(jié)構(gòu)及多樣性調(diào)查中[11]。該方法基于線蟲的形態(tài)學(xué)特征,在光學(xué)顯微鏡下對土壤中分離提取出的線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。然而,形態(tài)學(xué)鑒定方法的使用仍具有局限性,例如需要專業(yè)分析鑒定人員,鑒定耗時(shí)過長等問題[12]。隨著生物信息學(xué)及分子生物學(xué)的快速發(fā)展,近年來,高通量測序技術(shù)為快速開展線蟲群落研究提供了可能[13-14],已被廣泛應(yīng)用于森林、草地及農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)中[15-16]。例如,Kerfahi等[17]通過高通量測序技術(shù)對熱帶雨林和北極凍土帶土壤線蟲進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)前者線蟲群落多樣性更高;Darby等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過焚燒處理后的農(nóng)田土壤線蟲豐富度高于焚燒前;Gao等[19]通過高通量測序法分析了荒漠草原露天礦廢棄地土壤性質(zhì)和線蟲群落結(jié)構(gòu)與功能,得到該生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵土壤線蟲屬。高通量測序技術(shù)克服了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法的局限,具有較高的靈敏度,測序樣品量大且能夠提供更高的線蟲分辨率[20],但同時(shí)存在鑒定結(jié)果不穩(wěn)定,對營養(yǎng)類群分析有偏差,只能以相對多度表征物種數(shù)量等弊端[21]。目前,關(guān)于形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序分析結(jié)果的一致性研究仍在繼續(xù)。Treonis等[22-23]對比了兩種分析方法,發(fā)現(xiàn)二者的豐度結(jié)果不一致;而Du等[12]則提出二者在土壤線蟲營養(yǎng)類群多度和生物量結(jié)果上呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此,關(guān)于高通量測序技術(shù)的應(yīng)用及與形態(tài)學(xué)鑒定的差異性研究,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的討論。

本研究選擇黃河上游區(qū)門源縣不同類型高寒草甸恢復(fù)斑塊的土壤線蟲群落作為研究對象,采用形態(tài)學(xué)鑒定對線蟲群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析,并輔以高通量測序技術(shù)在分子生物學(xué)水平上對線蟲群落多樣性進(jìn)行調(diào)查,目的在于比較土壤線蟲群落在兩種分析方法下的差異,為后續(xù)土壤線蟲的鑒定方法與研究提供科學(xué)思路。同時(shí)探討高寒草甸土壤理化性質(zhì)和其退化對土壤線蟲群落組成的影響,為深入理解土壤線蟲群落組成在不同類型斑塊化退化高寒草甸下的變化規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持,也為高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的草地管理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究地點(diǎn)位于青海省海北藏族自治州門源縣東部黃河二級支流大通河境內(nèi)(37°46′57″N,101°19′57″E),選取海拔介于3 115～3 128 m的高寒草甸進(jìn)行取樣。門源縣年平均氣溫0.8℃,年降水量350～600 mm,該區(qū)域內(nèi)草地類型為高寒草甸,主要優(yōu)勢植物有矮生嵩草(Kobresiahumilis)、針茅(Stipacapillata)、和黑褐苔草(Carexsupina)等。

1.2 樣地選擇

2022年8月,在門源縣研究區(qū),采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),隨機(jī)選取裸露斑塊及其他不同類型恢復(fù)斑塊。斑塊的分類以植被類型和植被總蓋度為依據(jù),一般分為裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊等3類斑塊。裸露斑塊為高原鼠兔頻繁活動區(qū),土壤裸露疏松,植被蓋度幾乎為0;短期恢復(fù)斑塊為禁止高原鼠兔活動后形成的斑塊,具有少量如密花香薷(Elsholtziadensa)和細(xì)葉亞菊(Ajaniatenuifolia)等雜類草植物,植被蓋度在20%～40%;長期恢復(fù)斑塊為短期恢復(fù)斑塊進(jìn)一步演替所形成,主要以矮生嵩草為優(yōu)勢物種,植被蓋度大于40%,詳見宋梓涵和孫華芳[5,24]的研究。植被調(diào)查在不同斑塊類型高寒草甸內(nèi),采用50 cm × 50 cm的樣方重復(fù)測量3次。調(diào)查樣地裸露斑塊植被總蓋度基本為0,短期恢復(fù)斑塊植被總蓋度約為39%,長期恢復(fù)斑塊約為62%,高寒草甸約為86%。

1.3 樣品采集與分析方法

在3種退化斑塊及高寒草甸內(nèi)各隨機(jī)選取3個50 cm×50 cm的樣方,用直徑5 cm的土鉆,通過五點(diǎn)取樣法分別挖取0～15 cm土壤混合裝入自封袋中,同種斑塊類型均可以得到 3個土壤樣品。采集的土壤樣品過5 mm篩后分為3份,1份置于冰箱于4℃冷藏,用于形態(tài)鑒定法下分離和提取土壤線蟲;1份在-80℃冷凍保存,用于土壤線蟲的高通量測序分析;1份帶回實(shí)驗(yàn)室陰干備用,用于測定土壤理化性質(zhì)。采用重量分析法測定土壤含水量,利用AA3連續(xù)流動分析儀測定土壤全氮(Total nitrogen,TN)、全磷(Total phosphorus,TP),利用火焰光度法測定土壤全鉀(Total potassium,TK),利用電位法測定土壤pH值。

1.4 土壤線蟲形態(tài)學(xué)分離鑒定方法

利用改良的貝爾曼漏斗法在30 g濕潤的土壤樣品中分離線蟲48 h,用無水甘油和酒精溶液固定并制片,在顯微鏡下根據(jù)每條線蟲的形態(tài)特征,參照尹文英[25]和Bongers[26]對線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類并計(jì)數(shù)。從每個樣品中隨機(jī)抽取100條線蟲(不足100條的全部鑒定)進(jìn)行科屬鑒定,本文根據(jù)線蟲的頭部形態(tài)學(xué)特征和取食生境將土壤線蟲鑒定到屬水平。每個樣品中線蟲的總數(shù)量可以轉(zhuǎn)換為每100 g干土中線蟲的條數(shù)。依據(jù)線蟲形態(tài)特征進(jìn)行營養(yǎng)類群分類,將土壤線蟲劃分為5個營養(yǎng)類群:植食線蟲(Plant feeders)、食細(xì)菌線蟲(Bacterivores)、食真菌線蟲(Fungivores)、捕食線蟲(Predators)和雜食線蟲(Omnivores),并依據(jù)線蟲的生活史確定其c-p值,取值范圍為1～5之間[27]。

1.5 土壤線蟲DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

使用Power Soil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)試劑盒提取各樣地不同類型退化斑塊總DNA,并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。采用18S通用引物(5′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′)和(5′-AGCGACGGGCGGTGTGTACAAA-3′)擴(kuò)增18S rDNA的V4可變區(qū),擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?NF1-18Sr2b),PCR擴(kuò)增總體系為25 μL。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增目的條帶大小(170 V,30 min),并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒(Beckman Coulter,Kraemer Boulevard Brea,CA,USA)純化?；赑CR產(chǎn)物建立線蟲群落測序文庫,在Illumina MiSeq平臺上機(jī)測序。以上過程均委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

獲得原始測序數(shù)據(jù)后,根據(jù)條形碼序列在QIIME(v1.8.0)軟件中對樣本進(jìn)行分割,并通過Trimmomatic(v0.36)和Pear(v0.9.6)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,以去除得分低于 20、含有模糊堿基和引物錯配的序列[28]。然后,用Flash(v1.20)和Pear(v0.9.6)軟件對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,拼接時(shí)最小overlap設(shè)置為10 bp,錯配率為 0.1[29]。使用Vsearch(v2.7.1)軟件中的的denovo方法去除短序列和嵌合體序列。在Vsearch(v2.7.1)軟件中,根據(jù)uparse算法,以 97% 的相似性閾值(Edgar,2013 年)對優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units)聚類。在NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中,設(shè)置1e-5的閾值,通過Blast算法獲得了與物種相對應(yīng)的每個OTU的分類信息[30]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)分析采用以下指標(biāo):

物種數(shù)(S):

S= the total number of taxa in each plot

均勻度指數(shù)(J′)[31]:

J′=H′/lnS

(1)

香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(H′)[32]:

H′=-∑Pi(lnPi)

(2)

辛普森(Simpson)[33]:

(3)

式中Pi為第i類群中的個體數(shù)占線蟲群落所有類群的個體總數(shù)的比例,式中S為類群數(shù)。

成熟度指數(shù)(MI)[27]:

MI=∑ci×fi

(4)

該指數(shù)用于描述土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和受干擾影響的程度。式中,ci為自由生活線蟲的生活史c-p值,fi為土壤線蟲群落中自由生活線蟲所占的比例。

線蟲通路比(NCR)[8]:

NCR=Ba/(Ba+Fu)

(5)

該指數(shù)用于描述分解通道中食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲的重要性,反映土壤有機(jī)質(zhì)分解途徑。式中,Ba為食細(xì)菌線蟲的數(shù)量,Fu為食真菌線蟲的數(shù)量。

富集指數(shù)(EI)[34]:

EI=100×(e/(e+b)

(6)

該指數(shù)用于描述外界營養(yǎng)物質(zhì)輸入的水平。式中,e=3.2Ba1+0.8Fu2,b=0.8(Ba2+Fu2)。

結(jié)構(gòu)指數(shù)(SI)[35]:

SI=100×(s/(s+b)

(7)

該指數(shù)用于描述示土壤食物網(wǎng)的連通性和食物鏈的長度。式中,

s=(Ban×Wn)+(Fun×Wn)+(Opn×Wn),n=3,4,5;W3=1.8,W4=3.2,W5=5.0。

本研究采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析(One-Way ANOVA)用于比較不同斑塊化退化高寒草甸下土壤線蟲群落特征的差異(P<0.05),平均值多重比較采用LSD法。采用Origin 2019軟件對線蟲群落進(jìn)行主成分分析,解釋不同恢復(fù)斑塊類型下土壤線蟲群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型斑塊土壤理化性質(zhì)特征

門源縣不同類型斑塊化草甸及高寒草甸理化性質(zhì)如表1所示。pH值隨植被恢復(fù)程度的增加而降低,在裸露斑塊中達(dá)到最大值7.74,顯著高于其他三類草甸(P<0.05)。土壤含水量、全氮的結(jié)果與pH值相反,在高寒草甸中顯著高于其他裸露斑塊和其他兩類恢復(fù)斑塊(P<0.05)。全磷含量隨著斑塊的恢復(fù)增高,但低于高寒草甸含量(1.45 g·kg-1)。全鉀在短期恢復(fù)斑塊中含量最高,為2.72%,顯著高于裸露斑塊和其他兩類草甸(P<0.05)。

表1 不同斑塊化退化高寒草甸土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of different patches of degraded alpine meadow soil

2.2 土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1土壤線蟲群落多度 在形態(tài)學(xué)鑒定方法下,從門源縣不同斑塊類型及高寒草甸土壤中分離提取線蟲平均密度為1 074條·100 g-1干土。調(diào)查結(jié)果表明,門源縣不同類型斑塊化土壤線蟲數(shù)量變化趨勢為:裸露斑塊<短期恢復(fù)斑塊<長期恢復(fù)斑塊<高寒草甸(圖1)。其中,短期恢復(fù)斑塊和長期恢復(fù)斑塊土壤線蟲數(shù)量之間無顯著差異,但顯著高于裸露斑塊(P<0.05),而高寒草甸土壤線蟲數(shù)量與長期恢復(fù)斑塊之間無顯著差異,但顯著高于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊(P<0.05)。

圖1 形態(tài)學(xué)鑒定下不同斑塊類型線蟲群落數(shù)量(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸Fig.1 Total abundance of soil nematode communities in different degraded patches with morphological identification method (mean+SE). BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows

通過高通量測序法只能比較不同采樣地的線蟲序列數(shù)量,獲得土壤線蟲的相對多度,無法獲得土壤線蟲的絕對多度。裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊及高寒草甸通過高通量測序獲得隸屬于線蟲動物門的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)分別為6 419,7 480,1 286及2 199條。土壤樣品序列數(shù)由高到低依次為短期恢復(fù)斑塊、裸露斑塊、高寒草甸、長期恢復(fù)斑塊,這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果變化趨勢不一致。

2.2.2屬組成 通過形態(tài)學(xué)分離鑒定,共得到土壤線蟲42屬,其中有29個屬在高通量測序法中也被鑒定到(表2),在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定27,24,28和33屬。三類恢復(fù)斑塊及高寒草甸上優(yōu)勢屬(相對多度>10%)和常見屬(相對多度>1%)數(shù)量占線蟲總數(shù)的比例達(dá)到93%以上,稀有線蟲屬(相對多度<1%)為別為15,9,9和15個。不同斑塊化退化草甸下土壤線蟲群落的組成存在明顯差異(圖2)。裸露斑塊的優(yōu)勢屬為Cylindrolaimus,Diploseapter,Eucephalobus和Teratocephalus,其個體數(shù)量分別占總體的21.23%,15.14%,12.42%和11.11%;短期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢屬為Chiloplacus,Mesorhabditis和Rhabdolaimus,分別占總體的16.76%,11.64%和19.56%;長期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢屬為Acrobeloides,Cervidellus和Plectus,其數(shù)量分別占總體的11.31%,10.32%和11.51%;高寒草甸的優(yōu)勢屬為Caenorhabditis和Cervidellus,占比分別為11.09%和11.42%。對不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸土壤線蟲群落組成進(jìn)行主成分分析,前兩軸分別解釋了29.8%和21.2%的變異信息(累計(jì)達(dá)51.0%)(圖3a),結(jié)果表明土壤線蟲群落在屬水平上的組成格局具有差異。與短期恢復(fù)斑塊相比,長期恢復(fù)斑塊、高寒草甸土壤線蟲群落組成與裸露斑塊差異更顯著(圖3a)。

圖2 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊土壤線蟲屬水平相對豐度。a:形態(tài)學(xué)鑒定法;b:高通量測序法;BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸Fig.2 Relative abundance of Nematode at genus level under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River under morphological identification a and HTS b. BP,SP,LP and AM represent bare patches,short-term recovery patches,long-term recovery patches and alpine meadows,respectively

圖3 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊下土壤線蟲群落的主成分分析。a,形態(tài)學(xué)鑒定法;b,高通量測序法Fig.3 Principal component analysis of soil nematode communities under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River. a,Morphological identification method;b,High-throughput sequencing method

表2 基于形態(tài)學(xué)鑒定法和高通量測序法測定的黃河上游區(qū)斑塊化退化斑塊土壤線蟲群落屬相對多度Table 2 Relative abundance of soil nematode genera under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River based on morphological identification and high-throughput sequencing.

利用高通量測序鑒定到100屬,裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定87,83,85和90屬(表2),顯著高于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。在高通量測序中,優(yōu)勢屬(相對多度> 10%)和常見屬(相對多度> 1%)的數(shù)量占線蟲總數(shù)的比例達(dá)到81%以上。相較于形態(tài)學(xué)鑒定方法,高通量測序技術(shù)在檢測稀有屬(相對多度< 1%)方面有更大的優(yōu)勢,裸露斑塊、恢復(fù)斑塊及高寒草甸中有65～74個稀有線蟲屬,其中部分屬的相對多度甚至小于0.1%。不同斑塊化退化草甸下土壤線蟲群落的組成也存在明顯差異(圖2)。其中,裸露斑塊的優(yōu)勢屬為Hemicriconemoides,Paratylenchus和Prismatolaimus,相對多度占比依次為13.65%,30.53%和12.69%;短期恢復(fù)斑塊的優(yōu)勢屬為Dorylaimellus,Filenchus,Helicotylenchus和Prismatolaimus,相對多度占比分別為10.84%,11.52%,29.70%和12.30%;高寒草甸的優(yōu)勢屬Helicotylenchus,相對多度為13.26%。基于高通量測序法,對不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸土壤線蟲群落組成進(jìn)行主成分分析,前兩軸分別解釋了27.7%和20.3%的變異信息(累計(jì)達(dá)48.0%)(圖3b),結(jié)果表明高通量測序技術(shù)下土壤線蟲群落在屬水平上的組成格局相似度較高(圖3b)。

2.2.3營養(yǎng)類群組成 通過形態(tài)學(xué)鑒定方法共得到植食線蟲8屬,食細(xì)菌線蟲17屬,食真菌線蟲7屬,捕食線蟲4屬,雜食線蟲6屬(表2),不同斑塊高寒草甸下線蟲群落營養(yǎng)類群結(jié)構(gòu)不同,但無顯著性差異(圖4a)。植食線蟲在裸露斑塊、恢復(fù)斑塊和高寒草甸上的變化趨勢為高寒草甸>長期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;食細(xì)菌線蟲則為長期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>高寒草甸;食真菌線蟲在高寒草甸中最多,裸露斑塊次之,長期恢復(fù)斑塊最少;捕食線蟲在三類斑塊類型和高寒草甸上的變化趨勢為裸露斑塊>長期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊;雜食線蟲多度由高到低依次為短期恢復(fù)斑塊、裸露斑塊、長期恢復(fù)斑塊及高寒草甸?？傮w來看,形態(tài)學(xué)鑒定中土壤線蟲營養(yǎng)類群數(shù)量排序?yàn)槭臣?xì)菌線蟲>植食線蟲>食真菌線蟲>雜食線蟲>捕食線蟲(圖4a)。

圖4 黃河上游區(qū)不同恢復(fù)斑塊下土壤線蟲各營養(yǎng)類群的相對多度(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.4 Relative abundance (mean + SE) of soil nematode communities under different recovery patches of Alpine Meadow in the upper Yellow River注:a,形態(tài)學(xué)鑒定法;b,高通量測序法。BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸。Pf,植食線蟲;Ba,食細(xì)菌線蟲;Fu,食真菌線蟲;Pr,捕食線蟲;Om,雜食線蟲Note:a,Morphological identification method;b,High-throughput sequencing method. BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows. Pf,Plant-feeding nematodes;Ba,bacterivores;Fu,fungivores;Pr,predators;Om,omnivores

在高通量測序技術(shù)中共得到植食線蟲50屬,食細(xì)菌線蟲19屬,食真菌線蟲12屬,捕食線蟲10屬,雜食線蟲9屬(表2),同形態(tài)學(xué)鑒定法,不同斑塊高寒草甸下線蟲群落營養(yǎng)類群結(jié)構(gòu)不同,但無顯著性差異(圖4b)。植食線蟲在三類斑塊類型和高寒草甸上的變化趨勢為高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>長期恢復(fù)斑塊;食細(xì)菌線蟲則為裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>長期恢復(fù)斑塊>高寒草甸;食真菌線蟲在長期恢復(fù)斑塊中最多,裸露斑塊次之,短期恢復(fù)斑塊最少;捕食線蟲在三類斑塊類型和高寒草甸上的變化趨勢為長期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;雜食線蟲多度由高到低依次為長期恢復(fù)斑塊、高寒草甸、裸露斑塊及短期恢復(fù)斑塊。總體來看,高通量測序技術(shù)中土壤線蟲營養(yǎng)類群數(shù)量排序?yàn)橹彩尘€蟲>食細(xì)菌線蟲>食真菌線蟲>雜食線蟲>捕食線蟲(圖4b)。

2.3 斑塊類型對線蟲生態(tài)功能的影響

在形態(tài)學(xué)鑒定下,土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能指數(shù)受到不同斑塊類型的影響(表3)。在線蟲群落結(jié)構(gòu)方面,不同斑塊類型下物種數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.001),均勻度指數(shù)和辛普森指數(shù)出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。具體來看,物種數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)在不同斑塊類型和高寒草甸的變化趨勢一致,為高寒草甸>長期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊;均勻度指數(shù)和辛普森指數(shù)在長期恢復(fù)斑塊中最高,高寒草甸次之,裸露斑塊最低(圖5),這表明長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸顯著提高了土壤線蟲群落多樣性。在不同斑塊類型下,生態(tài)功能指數(shù)除了線蟲通路比無顯著性差異,成熟度指數(shù)、富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)均為及顯著差異(P<0.001)。形態(tài)學(xué)鑒定中,成熟度指數(shù)的變化趨勢為裸露斑塊>短期恢復(fù)斑塊>長期恢復(fù)斑塊>高寒草甸,富集指數(shù)則在高寒草甸中最高,短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊次之,裸露斑塊中最低;線蟲通路比均大于0.5,這說明所有樣地中土壤食細(xì)菌線蟲數(shù)量高于食真菌線蟲(圖5)。

圖5 形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)下不同恢復(fù)斑塊類型對線蟲物種數(shù)(a)、均勻度指數(shù)(b)、香農(nóng)-威納指數(shù)(c)、辛普森指數(shù)(d)、成熟度指數(shù)(e)、線蟲通路比(f)、富集指數(shù)(g)和結(jié)構(gòu)指數(shù)(h)的影響(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.5 Effect of different recovery patches on Spices (a),Pielou(b),Shannon-wiener(c),Simpson(d),Maturity Index(e),Nematode Channel Ratio(f),Enrichment Index(g),and Structure Index(h) (mean + SE) of total nematodes under Morphological identification method and High-throughput sequencing method注:BP,裸露斑塊;SP,短期恢復(fù)斑塊;LP,長期恢復(fù)斑塊;AM,高寒草甸。不同小寫字母表示樣地間差異顯著(P<0.05)Note:BP,Bare patches;SP,Short-term recovery patches;LP,Long-term recovery patches;AM,Alpine meadows. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

表3 形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)下斑塊類型對線蟲群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的影響Table 3 Effects of different recovery patches on nematode communities structure and Nematode community ecological function under morphological identification and high-throughput sequencing methods

在高通量測序技術(shù)下,僅有均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)在不同斑塊類型下出現(xiàn)顯著性差異(P<0.001),變化趨勢為長期恢復(fù)斑塊>高寒草甸>短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊,與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果基本一致,表明斑塊化退化高寒草甸的恢復(fù)顯著提高了土壤線蟲群落豐富度(圖5)。不同恢復(fù)斑塊及高寒草甸中的物種數(shù)均高于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊和高寒草甸中變化趨勢同均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)一致,但物種數(shù)在長期恢復(fù)斑塊中最低。成熟度指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊和長期恢復(fù)斑塊中趨勢一致,具體表現(xiàn)為裸露斑塊>長期恢復(fù)斑塊>短期恢復(fù)斑塊,高寒草甸的成熟度指數(shù)最低,但結(jié)構(gòu)指數(shù)僅次于長期恢復(fù)斑塊。同樣在所有斑塊類型下的線蟲通路比均大于0.5,這說明所有樣地中土壤食細(xì)菌線蟲數(shù)量高于食真菌線蟲,這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。富集指數(shù)隨著斑塊的恢復(fù)逐漸增大,在高寒草甸中最高。

3 討論

3.1 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測序法的土壤線蟲多度比較

形態(tài)學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確獲得土壤線蟲群落的絕對多度,而高通量測序技術(shù)只能通過線蟲序列數(shù)量獲得線蟲群落的相對多度[36]。分析結(jié)果表明,兩種分析方法測得的土壤線蟲多度在退化斑塊恢復(fù)演替過程(裸露斑塊—短期恢復(fù)斑塊—長期恢復(fù)斑塊—高寒草甸)中發(fā)生了明顯的變化,且變化趨勢基本不一致,具體表現(xiàn)為:形態(tài)學(xué)鑒定方法中,裸露斑塊中的線蟲數(shù)量最低,短期恢復(fù)斑塊和長期恢復(fù)斑塊逐漸增加,在高寒草甸中達(dá)到最高,該結(jié)論與Wang等[37-38]的結(jié)論一致;在高通量測序中不同斑塊類型高寒草甸的土壤線蟲多度變化趨勢為短期恢復(fù)斑塊>裸露斑塊>高寒草甸>長期恢復(fù)斑塊。導(dǎo)致兩種方法下線蟲多度趨勢不同的原因可能是由于高通量測序技術(shù)下線蟲基因數(shù)據(jù)庫不夠完善。在本研究中,基于形態(tài)學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)土壤線蟲多度與pH值、土壤含水量、全氮和全鉀含量的變化趨勢有關(guān)(表1)。其中,土壤線蟲多度隨著土壤含水量、全氮和全鉀的升高而增加,pH值的變化趨勢則相反,該結(jié)果與Wang等人的研究一致[39-40]。這可能是由于隨著斑塊化退化高寒草甸的恢復(fù),植物地上、地下物種多樣性增加,土壤營養(yǎng)元素含量升高,顯著改善了輸入土壤的資源與數(shù)量[41],為線蟲提供了更為多樣化的食物資源[42]。

3.2 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測序法的土壤線蟲群落組成和結(jié)構(gòu)比較

形態(tài)學(xué)鑒定方法與高通量測序技術(shù)相比,二者的區(qū)別還在于高通量測序技術(shù)具有更高的分類學(xué)分辨率[23]。形態(tài)學(xué)鑒定法一般將線蟲鑒定到屬水平,且需要花費(fèi)大量時(shí)間,而高通量測序技術(shù)可以短時(shí)間內(nèi)提供線蟲在物種水平上的信息。此外,高通量測序技術(shù)較形態(tài)學(xué)鑒定方法來說,可以注釋到更多的線蟲類群數(shù)[22]。通過形態(tài)學(xué)分離鑒定,共得到土壤線蟲43屬,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定21,18,19和25屬。利用高通量測序鑒定到101屬,在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸上分別鑒定90,92,85和91屬。通過兩種分析方法鑒定出的線蟲屬數(shù)量差異較大的原因可能是由于在形態(tài)學(xué)鑒定中,采用貝爾曼漏斗法,通常利用線蟲自身的重量和趨水性分離提取線蟲,故受外部環(huán)境溫度以及線蟲的活性影響比較大,導(dǎo)致部分線蟲損失[43]。而高通量測序技術(shù)則是通過引物擴(kuò)增DNA,可以獲得更多的線蟲類群,尤其是稀有線蟲類群(相對多度<1%)的獲得[12]。通過高通量測序技術(shù),測得地中有65～76個稀有線蟲屬,其中部分屬的相對多度甚至小于0.1%。

盡管高通量測序技術(shù)可以獲得更多的線蟲類群,但在本研究中通過形態(tài)學(xué)鑒定方法任有13個線蟲屬無法通過高通量測序技術(shù)鑒定到。例如食細(xì)菌線蟲的廣桿屬(Caenorhabditis)、頭葉屬(Cephalobus)、鹿角唇屬(Cervidellus)、板唇屬(Chiloplacus)、鉤唇屬(Diploseapter)、中桿屬(Mesorhabditis)和原桿屬(Protorhabditis),食真菌線蟲的莖屬(Ditylenchus),捕食線蟲的狹咽屬(Discolaimium)、真矛線屬(Eudorylaimus)、厚唇屬(Labronema)及雜食線蟲的異矛線屬(Allodorylaimus)、庫氏線屬(Coomansinema),導(dǎo)致通過高通量測序技術(shù)獲得的食細(xì)菌線蟲、捕食線蟲的相對多度有所下降。此外,高通量測序技術(shù)獲得植食線蟲50屬,顯著高于形態(tài)學(xué)鑒定方法得到的8屬。這些結(jié)果表明,兩種方法獲得的營養(yǎng)類群有差異,高通量測序在植食線蟲的獲得方面具有優(yōu)勢,而形態(tài)學(xué)鑒定易于獲得更多的食細(xì)菌線蟲,這與Gao等[14,44]的研究結(jié)果一致。造成兩種方法在線蟲營養(yǎng)類群鑒定方面產(chǎn)生差異的主要原因可能是:(1)在形態(tài)學(xué)鑒定中處于不同發(fā)育階段的線蟲鑒定起來存在困難[45-46];(2)在高通量測序技術(shù)中,目前使用到的數(shù)據(jù)庫中收集的線蟲序列多集中在植食線蟲,且部分線蟲在數(shù)據(jù)庫中沒有已知的匹配項(xiàng),導(dǎo)致無法識別[12]。因此在未來的研究中有必要補(bǔ)充和改進(jìn)參考數(shù)據(jù)庫,同時(shí)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)可以加速不同規(guī)模和生態(tài)系統(tǒng)中線蟲群落的研究。

兩種分析方法的PCA分析結(jié)果表明:形態(tài)學(xué)鑒定下,裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊與長期恢復(fù)斑塊及高寒草甸間土壤線蟲群落的組成存在顯著差異(圖3a),表現(xiàn)在不同種類斑塊的優(yōu)勢屬不同(圖2a);高通量測序技術(shù)中,不同斑塊類型及高寒草甸中土壤線蟲群落的組成差異性不大(圖3b)?？傮w來看,在形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)中,土壤線蟲群落的優(yōu)勢屬由食細(xì)菌線蟲轉(zhuǎn)化為植食線蟲。具體看來,在形態(tài)學(xué)鑒定中,植食線蟲多度隨斑塊的恢復(fù)逐漸增加(圖5a),這可能是由于植被的恢復(fù)為植食線蟲提供了更多食物資源[47]。捕食線蟲和雜食線蟲分別在裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊中相對多度最高(圖5a),可能是由于補(bǔ)償機(jī)制的出現(xiàn),導(dǎo)致耐受性捕-雜食線蟲種群在該類斑塊類型下增加[48]。高通量測序技術(shù)中,植食線蟲在高寒草甸中最大(圖5b),結(jié)果與形態(tài)學(xué)一致。捕食線蟲、雜食線蟲和食真菌線蟲在長期恢復(fù)斑塊中相對多度最高(圖5b),表明在長期恢復(fù)斑塊下,生態(tài)系統(tǒng)最為穩(wěn)定。

3.3 基于形態(tài)學(xué)鑒定與高通量測序法的土壤線蟲生態(tài)指數(shù)比較

線蟲群落生態(tài)指數(shù)反映了線蟲群落的組成結(jié)構(gòu)、多樣性及食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能特征,對土壤生態(tài)環(huán)境具有指示作用[27,49]。本研究表明在兩種分析方法下,土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)生態(tài)功能指數(shù)會受到斑塊類型的影響(表3)。在形態(tài)學(xué)鑒定中,斑塊類型的不同,極顯著的影響了門源縣的物種數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、成熟度指數(shù)富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù),均勻度指數(shù)、辛普森指數(shù)也在三類退化斑塊和高寒草甸中有顯著性差異。而在高通量測序技術(shù)中,僅有均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)及辛普森指數(shù)受到斑塊類型的影響,其他生態(tài)指數(shù)未出現(xiàn)顯著性差異。

已有研究表明,退化高寒草甸的恢復(fù)能夠顯著提高土壤線蟲多樣性[50-52]。在本研究中也得到了一致的結(jié)論,即長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸的物種數(shù)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)及辛普森指數(shù)均顯著高于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊,這也再次證實(shí)了隨著黃河上游區(qū)斑塊化高寒草甸的恢復(fù)改善了線蟲生活環(huán)境[53],提升了進(jìn)入土壤的資源數(shù)量和土壤質(zhì)量,導(dǎo)致土壤線蟲多樣性得到顯著提高[42]。在高通量測序中,物種數(shù)、均勻度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)的結(jié)果與形態(tài)學(xué)相似,即在長期恢復(fù)斑塊和高寒草甸中均大于裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊,這也再次證實(shí)了長期恢復(fù)斑塊顯著改善了土壤食物資源,表明兩種群落分析方法在土壤線蟲群落多樣性對退化斑塊的響應(yīng)上結(jié)果一致。

在兩種分析方法中,成熟度指數(shù)基本隨著斑塊化高寒草甸的恢復(fù)逐漸降低,并在高寒草甸中達(dá)到最低值。裸露斑塊和短期恢復(fù)斑塊成熟度指數(shù)較大的原因可能是由于隨著高寒草甸退化程度的增大,土壤孔隙度增大,捕食線蟲和雜食線蟲的比例增加,導(dǎo)致在裸露斑塊、短期恢復(fù)斑塊中出現(xiàn)通過捕食線蟲、雜食線蟲驅(qū)動的下行效應(yīng)調(diào)控[11]。線蟲通路比(NCR)反映了土壤有機(jī)質(zhì)分解途徑,用于評估土壤有機(jī)質(zhì)分解中細(xì)菌通道和真菌通道的相對重要性[8]。兩種分析方法結(jié)果表明不同退化斑塊高寒草甸的土壤線蟲NCR指數(shù)均大于0.5,說明黃河上游區(qū)退化斑塊土壤食物網(wǎng)有機(jī)質(zhì)的分解以細(xì)菌通道為主。線蟲富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)分別用于指示土壤食物網(wǎng)的復(fù)雜性和評估食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲對環(huán)境的敏感程度。在形態(tài)學(xué)鑒定中,短期恢復(fù)斑塊、長期恢復(fù)斑塊及高寒草甸富集指數(shù)大于50,這表明上述兩種斑塊及高寒草甸土壤養(yǎng)分富集狀況較好,而其裸露斑塊土壤富集狀況相對較差[8]。然而,在高通量測序技術(shù)中,僅有高寒草甸線蟲富集指數(shù)高于50。兩種分析方法所獲得的結(jié)構(gòu)指數(shù)均高于50,表明退化斑塊土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性較好,土壤食物網(wǎng)的連通性和復(fù)雜性較高[27]。

4 結(jié)論

土壤線蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明隨著退化斑塊的自然恢復(fù),土壤線蟲數(shù)量逐漸增加,與高通量測序技術(shù)結(jié)果不一致。兩種分析方法的生態(tài)指數(shù)測定結(jié)果均表明隨著退化斑塊的恢復(fù),土壤線蟲生物多樣性增加。綜合比較,形態(tài)學(xué)鑒定和高通量測序技術(shù)在線蟲群落特征調(diào)查各有利弊,形態(tài)學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確獲得土壤線蟲群落的絕對多度,而高通量測序技術(shù)只能通過線蟲序列數(shù)量獲得線蟲群落的相對多度,但高通量測序技術(shù)具有更高的分類學(xué)分辨率,可以短時(shí)間內(nèi)提供線蟲在物種水平上的信息。此外,高通量測序技術(shù)可以注釋到更多的線蟲類群數(shù)。相較于形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果以食細(xì)菌線蟲為主,高通量測序技術(shù)則以植食線蟲為主,這有助于探索退化草甸恢復(fù)過程中植食線蟲隨植被恢復(fù)的變化,同時(shí)也會過度放大植食線蟲對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。盡管高通量測序技術(shù)為快速洞察線蟲多樣性提供了有效的技術(shù)手段,但仍存在一些局限性導(dǎo)致其測定結(jié)果準(zhǔn)確性、與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的一致性較差。因此,高通量測序在線蟲多樣性研究中的應(yīng)用在未來需要不斷驗(yàn)證和更新,以期為線蟲群落快速鑒定和評價(jià)斑塊化退化高寒草甸提供有力支持。