唐曉旭，張志乾，李福琴，王 楠

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，鄭州 450064；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院脊柱外科，鄭州 457000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染管理科，鄭州 450052；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診外科，鄭州 450052）

脛骨骨折是臨床常見(jiàn)的四肢骨折類型，多由高能量暴力引起，容易造成局部軟組織及血供的破壞，進(jìn)而增加內(nèi)固定手術(shù)后骨折不愈合或延遲愈合的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1－2］。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用，骨折斷端趨化和浸潤(rùn)的BMSCs 能夠發(fā)生成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨質(zhì)形成、加速骨折愈合［3］；BMSCs 的浸潤(rùn)及成骨分化受阻時(shí)，對(duì)骨折愈合產(chǎn)生不利影響［4］。 BMSCs 成骨分化的影響因素復(fù)雜，通過(guò)有效的干預(yù)手段促進(jìn)BMSCs 的成骨分化有助于增強(qiáng)BMSCs 在骨折愈合中的作用。

近些年，基因治療在干細(xì)胞成骨分化、骨折愈合中的應(yīng)用備受關(guān)注，解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）基因的編碼產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，在調(diào)控細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、分化中均起到作用［5－7］。 一項(xiàng)口腔科相關(guān)的研究證實(shí)在牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中ADAM10 的表達(dá)逐步降低，通過(guò)慢病毒感染的方式進(jìn)行ADAM10 過(guò)表達(dá)對(duì)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化具有抑制作用且這一作用與抑制Notch1 信號(hào)通路有關(guān)［8］，但該基因在BMSCs 成骨分化中的作用及其在骨折愈合中的潛在效應(yīng)尚不清楚。 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)穩(wěn)定敲低ADAM10 表達(dá)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及脛骨骨折的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析ADAM10 基因?qū)MSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合的影響，同時(shí)也分析Notch1 信號(hào)通路在ADAM10基因調(diào)控BMSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合中的作用，旨在深入認(rèn)識(shí)BMSCs 成骨分化的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)脛骨骨折愈合的新治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2018－0004］，共20 只，8 ～10周齡，體重180～200 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物房飼養(yǎng)［SYXK（豫）2022－0004］，溫度20～22℃，濕度50%～55%，12 h／12 h 光照／黑暗交替，自由飲食攝水。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州市澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021KYLL-Y-019），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循3R 原則。

1.1.2 細(xì)胞

SD 大鼠BMSCs（貨號(hào)：RASMX-01001）購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

陰 性對(duì) 照（negative control，NC） shRNA 及ADAM10 shRNA 的pGFP-V-RS 載體、NC shRNA 及ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體（北京傲銳東源生物公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)：11668027）；地塞米松（批號(hào)：D1756）、β-甘油磷酸鈉（批號(hào)：G6251）、維生素C（批號(hào)：A7506）、茜素紅（批 號(hào)： A5533）、 Notch1 激動(dòng) 劑丙戊 酸（Valproic acid，VPA） （批號(hào)：P4543） （儲(chǔ)存液用DMSO 配置、濃度1.0 mol／L）（美國(guó)Sigma 公司）；堿性磷酸酶（ALP）活力檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司，批號(hào)：BC2145）；HE 染色試劑盒（上海碧云天公司，批號(hào)：C0105）；ADAM10（批號(hào)：ab124695）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）（批號(hào)：ab133612）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2）（批號(hào)：ab76956）、I 型膠原（Type I collagen，Col-I）（批號(hào)：ab34710）、Notch 受體胞內(nèi)部分（Notch intracellular domain，NICD）（批號(hào)：ab52627）、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）（批號(hào)：ab108937）的特異性一抗（美國(guó)Abcam 公司）。 HERAcell 150i 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；Tanon4800 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能儀器公司）；VISION90 型小動(dòng)物科研X 光機(jī)檢測(cè)儀（丹東奧龍射線儀器集團(tuán)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

BMSCs 在完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，消化傳代后接種在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 mg／L NC shRNA 的pGFP-V-RS 載體、5 mg／L ADAM10 shRNA的pGFP-V-RS 載體，48 h 后更換為含有1 g／L 嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BMSCs。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BMSCs 分組：為驗(yàn)證ADAM10 的調(diào)控作用，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的BMSCs 作為對(duì)照組，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NC shRNA 的BMSCs 作為sh-NC 組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADAM10 shRNA 的BMSCs 作為sh-ADAM10 組；為驗(yàn)證Notch1 在ADAM10 發(fā)揮調(diào)控作用中的生物學(xué)意義，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NC shRNA 的BMSCs 加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的DMSO 作為sh-NC ＋DMSO 組，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的DMSO 作 為 sh-ADAM10 ＋DMSO 組， 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入終濃度1.0 mmol／L的VPA 作為sh-ADAM10＋VPA 組。

各組BMSCs 按照1×105個(gè)／孔加入6 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%后更換為含有0.1 μmol／L 地塞米松、10 mmol／L β-甘油磷酸鈉、50 mg／L 維生素C、10%胎牛血清的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，連續(xù)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 d。

1.3.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

SD 大鼠隨機(jī)分為sh-NC 組和sh-ADAM10 組，每組各10 只，均參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行脛骨骨折造模，方法如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉、30 mg／kg 麻醉，在左下肢前外側(cè)、脛骨中上1／3 處做縱行切口，顯露脛骨骨干，手術(shù)刀來(lái)回橫截造成骨折，術(shù)中能夠明顯聽(tīng)到骨頭斷裂的裂紋聲且術(shù)后進(jìn)行脛骨X 線攝片檢查、出現(xiàn)骨折線判斷為造模成功。 用長(zhǎng)度17 mm 的克氏針固定骨折的脛骨，完成造模后在骨折局部進(jìn)行pCMV5.0 載體的注射。 sh-NC 組注射5 mg／kg NC shRNA 的pCMV5.0 載體、sh-ADAM10 組注射5 mg／kg ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體，4周后評(píng)價(jià)骨折愈合情況。

1.3.3 細(xì)胞的茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)14 d 時(shí)，收集細(xì)胞并在0.1%茜素紅中染色30 min，在顯微鏡下觀察茜素紅陽(yáng)性染色的鈣結(jié)節(jié)，拍照記錄后每孔加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL，充分震蕩使鈣結(jié)節(jié)溶解，將50 μL 液體移入96 孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔內(nèi)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)405 nm 的波長(zhǎng)值。

1.3.4 細(xì)胞ALP 活性的檢測(cè)

成骨誘導(dǎo)14 d 時(shí)，收集細(xì)胞并采用細(xì)胞ALP 活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，裂解細(xì)胞后分別檢測(cè)ALP活性（以U／L 表示）及蛋白濃度（以mg／L 表示），計(jì)算每mg 蛋白對(duì)應(yīng)的ALP 活性。

1.3.5 細(xì)胞及組織中蛋白表達(dá)的檢測(cè)

收集成骨誘導(dǎo)14 d 時(shí)的BMSCs 和脛骨骨折處骨組織，加入裂解液后進(jìn)行細(xì)胞裂解或組織勻漿，提取得到蛋白后檢測(cè)濃度，將含有30 μg 蛋白樣本用于Western blot 檢測(cè)，電泳、電轉(zhuǎn)PVDF 膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后4℃孵育1 ∶1000 稀釋的ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 一抗或1 ∶5000 稀釋的β-actin 一抗過(guò)夜。 次日，室溫孵育二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 的表達(dá)水平。

1.3.6 骨折愈合的評(píng)價(jià)

首先采用VISION90 型小動(dòng)物科研X 光機(jī)檢測(cè)儀進(jìn)行X 線檢查，觀察骨折局部的影像學(xué)變化；而后收集脛骨骨折處的骨組織，4%多聚甲醛固定后制作組織蠟塊及病理切片，采用HE 染色試劑盒完成染色操作，封片后在顯微鏡下觀察骨折局部的骨痂及骨小梁特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 成骨誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)ADAM10 表達(dá)水平的比較

BMSCs 成骨誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)ADAM10 表達(dá)水平的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，BMSCs 中ADAM10 的表達(dá)水平呈逐步降低趨勢(shì)，提示在BMSCs 成骨分化的過(guò)程中ADAM10 的表達(dá)受到抑制。 見(jiàn)圖1。

注：與誘導(dǎo)0 d 時(shí)比較， *P＜0.05；與誘導(dǎo)7 d 時(shí)比較， ＆P＜0.05。圖1 BMSCs 成骨誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)ADAM10表達(dá)水平的比較Note.Compared with 0 d of induction， *P＜0.05.Compared with 7 days after induction， ＆P＜0.05.Figure 1 Comparison of ADAM10 expression levels at different time points after osteogenesis induction of BMSCs

2.2 不同轉(zhuǎn)染組BMSCs 中ADAM10 表達(dá)水平的比較

對(duì)照組與sh-NC 組BMSCs 中ADAM10 表達(dá)水平的比較無(wú)顯著差異（P＜0.05）；sh-ADAM10 組BMSCs 中ADAM10 表達(dá)水平均低于對(duì)照組和sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-ADAM10 使BMSCs 中ADAM10 表達(dá)降低。 見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆ P＜0.05。圖2 不同轉(zhuǎn)染組BMSCs 中ADAM10 表達(dá)水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh0NC group， ＆P＜0.05.Figure 2 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.3 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)BMSCs 成骨分化的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于對(duì)照組和sh-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 的成骨分化。 見(jiàn)圖3。

注：A：茜素紅染色；B：405 nm 吸光值的比較； C：LP 活性的比較。 與對(duì)照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖3 不同轉(zhuǎn)染組BMSCs 中ADAM10 表達(dá)水平的比較Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 3 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.4 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)BMSCs 成骨誘導(dǎo)后成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后OCN、Runx2、Col-I 的表達(dá)水平均高于對(duì)照組和sh-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10表達(dá)促進(jìn)BMSCs 中成骨標(biāo)志基因的表達(dá)。 見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖4 不同轉(zhuǎn)染組BMSCs 中OCN、Col-I 和Runx2 表達(dá)水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 4 Comparison of OCN， Col-I and Runx2 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.5 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)BMSCs 成骨誘導(dǎo)后Notch1 通路的影響

sh-ADAM10 組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后NICD、Hes1的表達(dá)水平均低于對(duì)照組和sh-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表達(dá)抑制BMSCs 中Notch1 信號(hào)通路的激活。 見(jiàn)圖5。

注：與對(duì)照組比較， *P＜0.05；與sh-NC 組比較， ＆P＜0.05。圖5 不同轉(zhuǎn)染組BMSCs 中NICD、Hes1 表達(dá)水平的比較Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 5 Comparison of NICD， Hes1 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.6 Notch1 通路激動(dòng)劑VPA 對(duì)抑制ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 成骨分化的影響

sh-ADAM10＋DMSO 組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于sh-NC＋DMSO 組（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 組BMSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均低于sh-ADAM10＋DMSO 組（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 成骨分化的作用減弱。 見(jiàn)圖6。

注：A：茜素紅染色；B：405 nm 吸光值的比較；C：ALP 活性的比較。 與sh-NC＋DMSO 組比較， *P＜0.05；與sh-ADAM10＋DMSO 組比較， ＆P＜0.05。圖6 Notch1 通路激動(dòng)劑VPA 對(duì)抑制ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 成骨分化的影響Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 6 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic differentiation of BMSCs

2.7 Notch1 通路激動(dòng)劑VPA 對(duì)抑制ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響

sh-ADAM10＋DMSO組BMSCs成骨誘導(dǎo)后OCN、Runx2、Col-I 的表達(dá)水平均高于sh-NC＋DMSO 組（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 組BMSCs 成骨誘導(dǎo)后OCN、Runx2、Col-I 的表達(dá)水平均低于sh-ADAM10＋DMSO 組（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的作用減弱。 見(jiàn)圖7。

注：與sh-NC＋DMSO 組比較， *P＜0.05；與sh-ADAM10＋DMSO 組比較， ＆P＜0.05。圖7 Notch1 通路激動(dòng)劑VPA 對(duì)抑制ADAM10 表達(dá)促進(jìn)BMSCs 中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響Note.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 7 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic marker genes expression of BMSCs

2.8 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折愈合的影響

經(jīng)X 射線檢查，sh-NC 組脛骨骨折大鼠的骨折線清晰，sh-ADAM10 組脛骨骨折大鼠的骨折線幾乎消失；經(jīng)HE 染色，sh-NC 組大鼠的骨痂纖維較多、成熟的小梁骨較少，sh-ADAM10 組大鼠的骨痂明顯增多、且形成成熟的小梁骨，表明敲低ADAM10 表達(dá)促進(jìn)脛骨骨折愈合。 見(jiàn)圖8。

注：A：脛骨骨折的X 射線檢查，箭頭所指為骨折線；B：脛骨骨折的HE 染色。圖8 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折愈合的影響Note.A， X-ray examination of tibial fracture.B， HE staining of tibial fracture.Figure 8 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on tibial fracture healing in rats

2.9 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響

sh-ADAM10 組脛骨骨折大鼠骨折部位中OCN、Runx2、Col-I 的表達(dá)水平均高于sh-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明敲低ADAM10 表達(dá)促進(jìn)脛骨骨折愈合過(guò)程中的成骨標(biāo)志基因表達(dá)。見(jiàn)圖9。

注：與sh-NC 組比較， *P＜0.05。圖9 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折中成骨標(biāo)志基因表達(dá)的影響Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 9 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on osteogenic marker genes expression in rat tibia fracture

2.10 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折中Notch1 通路的影響

如圖10所示，sh-ADAM10組脛骨骨折大鼠骨折部位中NICD、Hes1 的表達(dá)水平均低于sh-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明敲低ADAM10表達(dá)促進(jìn)脛骨骨折愈合過(guò)程中Notch1 信號(hào)通路的激活。

注：與sh-NC 組比較， *P＜0.05。圖10 抑制ADAM10 表達(dá)對(duì)大鼠脛骨骨折中Notch1 通路的影響Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 10 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on Notch1 pathway in rat tibia fracture

3 討論

脛骨骨折多由交通事故、高處墜落等高能量暴力引起，脛骨局部存在軟組織薄弱、穿支血管少的解剖特點(diǎn)，高能量暴力容易引起局部軟組織缺損及血供損害，進(jìn)行切開(kāi)復(fù)位內(nèi)固定治療后的不愈合或延遲愈合發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。 國(guó)內(nèi)葛向榮等［10］和趙國(guó)平等［2］的臨床研究分別報(bào)道脛骨骨折后延遲愈合的發(fā)生率為34.31%和27.16%。 骨折延遲愈合或不愈合不僅影響肢體功能、降低生活質(zhì)量，還增加二次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、加大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此需要進(jìn)行積極防治［11－12］。 本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析了ADAM10 基因?qū)MSCs 成骨分化及脛骨骨折愈合的影響。

ADAM10 的主要生物學(xué)功能是對(duì)各種細(xì)胞因子及受體、結(jié)構(gòu)蛋白實(shí)現(xiàn)剪切，進(jìn)而調(diào)控不同的生物學(xué)過(guò)程［5－7］。 本研究對(duì)BMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，在分化過(guò)程中ADAM10 的表達(dá)水平也呈逐步降低趨勢(shì)，與朱永翠等［8］的研究結(jié)果一 致。 為了驗(yàn)證ADAM10 基因在BMSCs 成骨分化中的調(diào)控作用，本研究在成骨誘導(dǎo)前先構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS載體的BMSCs，而后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化并檢測(cè)，結(jié)果顯示，敲低ADAM10 表達(dá)使BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化后的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及ALP 活性均明顯增加。 干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程涉及多種標(biāo)志基因的變化，Col-I 和OCN 分別是骨基質(zhì)中主要的膠原成分和非膠原成分，Runx2 是調(diào)控成骨分化的關(guān)鍵基因［13－14］，本研究在穩(wěn)定敲低ADAM10 的BMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后檢測(cè)到Col-I、OCN、Runx2 的表達(dá)水平增加，與成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及ALP 活性增加的結(jié)果吻合。以上結(jié)果表明敲低ADAM10 基因顯著抑制BMSCs的成骨分化。

根據(jù)朱永翠等［8］的研究，ADAM10 對(duì)牙周膜干細(xì)胞中Notch1 通路具有調(diào)控作用。 Notch1 通路在成骨分化及骨折愈合中起重要作用，有研究報(bào)道抑制Notch1 通路對(duì)干細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用，在骨折愈合過(guò)程中Notch1 表達(dá)下調(diào)是骨形成的必備條件［15－16］。 Notch1 是一類膜受體，與配體結(jié)合后通過(guò)三次酶切反應(yīng)將胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD 釋放進(jìn)入胞漿，作用與Hes1 并調(diào)控細(xì)胞增殖及分化。 ADAM10具有水解細(xì)胞膜受體胞內(nèi)或胞外結(jié)構(gòu)域的功能，多項(xiàng)研究證實(shí)ADAM10 能夠水解Notch1 的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并產(chǎn)生NICD［17－19］。 本研究在穩(wěn)定敲低ADAM10的BMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后檢測(cè)到NICD 及Hes1 的表達(dá)均明顯降低，在成骨誘導(dǎo)的過(guò)程中持續(xù)給予Notch1 激動(dòng)劑VPA 干預(yù)后、穩(wěn)定敲低ADAM10 促進(jìn)成骨分化的作用被削弱，表明敲低ADAM10 促進(jìn)成骨分化的作用與抑制Notch1 通路有關(guān)。

在脛骨骨折的愈合過(guò)程中，BMSCs 在骨折局部遷移、浸潤(rùn)并發(fā)生成骨分化對(duì)新骨形成具有重要意義。 為了更深入認(rèn)識(shí)ADAM10 基因調(diào)控BMSCs 成骨分化在脛骨骨折愈合中的生物學(xué)意義，本研究建立了脛骨骨折大鼠模型，在骨折局部注射ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 載體以敲低ADAM10，通過(guò)觀察骨折愈合情況可知：敲低ADAM10 后加速了脛骨骨折的愈合，骨折部位的骨折線幾乎消失且膠原形成、ALP 活性及OCN、Runx2、Col-I 的表達(dá)水平均明顯增加，同時(shí)還觀察到Notch1 通路中NICD、Hes1 的表達(dá)降低。 以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果吻合，表明敲低ADAM10 顯著促進(jìn)脛骨骨折的愈合。

綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低ADAM10 促進(jìn)BMSCs 的成骨分化及脛骨骨折的愈合，這一促進(jìn)作用與抑制Notch1 通路有關(guān)，這為今后脛骨骨折后不愈合及延遲愈合的防治提供了新思路。