郭中華，史棟梁，曹玉舉，王云飛，楊少祥，秦合偉，張仲博，任博文，周松林，王俊杰，王莉莎，萬小冠

（1.河南省中醫(yī)院骨病一科，鄭州 450053；2.鄭州中醫(yī)骨傷病醫(yī)院骨科，鄭州 450016；3.河南省中醫(yī)院康復(fù)科，鄭州 450053；4.河南省中醫(yī)院疼痛科，鄭州 450053；5.鄭州市第九人民醫(yī)院骨科，鄭州 450053）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性多因素骨骼疾病，其特征是骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨脆性增加［1－2］。 隨著人口老齡化程度的擴大，OP 的患病率不斷上升，已成為許多國家的重要公共衛(wèi)生問題［3－4］。 目前，OP 的治療主要采用藥物療法、物理療法和運動療法。 盡管OP 的治療取得了很大進展，但治療效果仍不能達到臨床預(yù)期，如許多新開發(fā)的抗OP 藥物價格昂貴，限制了其廣泛的臨床應(yīng)用，藥物不良反應(yīng)最終影響患者服藥依從性等［5］。 因此開發(fā)新的治療OP 的藥物變得非常重要。 柴胡桂枝湯出自張仲景《傷寒論》，已有研究顯示其在臨床上治療類風濕關(guān)節(jié)炎方面療效顯著［6］。但關(guān)于柴胡桂枝湯能否改善OP 尚不清楚。 最近的研究顯示，激活Wnt／β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路可延緩OP 的發(fā)生和發(fā)展［7］。 而柴胡桂枝湯能否通過調(diào)節(jié)Wnt／β-catenin 信號通路改善OP 尚不明確。 因此，本研究嚴格參考臨床相關(guān)研究［8］在柴胡桂枝湯原方的基礎(chǔ)上通過加減一些藥物合為柴胡桂枝湯加減（Chaihu Guizhi Decoction，CGD），觀察CGD 對OP 大鼠的影響并探究相應(yīng)的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

84 只SPF 級雌性SD 大鼠（7 周齡，體重200 ～210 g）購于廣東南模生物公司［SCXK（粵）2022－0062］，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院SPF 級實驗室［SYXK（豫）2021－0018］。 本研究遵循3R 原則，且所有動物實驗都已獲得河南省中醫(yī)院動物倫理委員會的審核及批準（HNSZYY2022010012）。

1.2 主要試劑與儀器

CGD 由黃芩10 g、葛根30 g、黨參10 g、桂枝15 g、柴胡24 g、生姜10 g、白芍15 g、清半夏12 g、炙甘草10 g、焦神曲10 g、白術(shù)20 g、大棗10 g 組成，購于河南省中醫(yī)院中藥房。 加入5 倍藥材質(zhì)量的水浸泡藥材2 h，大火燒開后轉(zhuǎn)文火煮1 h，經(jīng)過濾得煎液，重新加水再煎煮第2 次。 將兩次所得的煎煮液混合并加熱濃縮至5 g／mL。

維甲酸（規(guī)格50 mg，批號：20211128）購自深圳振強生物公司；戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）（批號：20220213）購自北京凱詩源生物公司；Wnt／β-catenin 通路抑制劑DKK-1（批號：20211218）購自上海禾午生物公司；大鼠Ⅰ型膠原C 端肽（Ctelopeptide of type Ⅰ collagen，CTX-Ⅰ）、骨 鈣 素（osteocalcin，BGP）ELISA 試劑盒（批號：20211123、20220706）購自上海鈺博生物公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）鈣－鈷染色試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號：20220704、20220619）購自上海歌凡生物公司；兔源一抗Wnt3a、β-catenin、GAPDH 和二抗（批號：ab219412、ab32572、ab8245、ab97051）均購自英國Abcam 公司。 SktScan 1176 micro-CT 儀購自德國Bruker 公司；BX53 光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯；DYY-7C 型蛋白電泳儀購于北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及OP 模型的構(gòu)建

將84 只SD 大鼠隨機分為Model 組、CK 組、高劑量CGD 組（CGD-H 組）、低劑量CGD 組（CGD-L組）、戊酸雌二醇組（EV 組）、Wnt／β-catenin 通路抑制劑（DKK-1）組和CGD-H＋DKK-1 組，每組12 只。除CK 組外，其他組大鼠均通過灌胃70 mg／kg 維甲酸的方式（每天1 次，持續(xù)4 周）構(gòu)建OP 大鼠模型［9］。 CK 組大鼠在相同時間段內(nèi)灌胃等量的生理鹽水。 通過觀察股骨微觀結(jié)構(gòu)以及股骨病理損傷來判斷造模是否成功。 造模成功后，根據(jù)參考文獻及前期預(yù)實驗結(jié)果進行給藥處理，CGD-L 組、CGDH 組、EV 組［10］大鼠分別需灌胃5 g／kg CGD、20 g／kg CGD、9 mg／kg EV，且均需腹腔注射等量的生理鹽水；DKK-1 組［11］大 鼠 需 腹 腔 注 射100 mg／kg DKK-1 且灌胃等量的生理鹽水；CGD-H＋DKK-1 組大鼠在灌胃20 g／kg CGD 的同時還需腹腔注射100 mg／kg DKK-1；Model 組、CK 組大鼠均需灌胃及腹腔注射等量的生理鹽水，每天給藥1 次，給藥共持續(xù)4 周。

1.3.2 標本收集

末次給藥24 h 后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉所有大鼠，尾靜脈取血（離心收集血清）用于CTX-Ⅰ、BGP 的檢測；處死大鼠并收集其左右兩側(cè)的股骨組織，利用micro-CT 儀檢測左側(cè)股骨微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)指標骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量的變化；將大鼠右側(cè)股骨組織，分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE、ALP 鈣－鈷、TRAP 染色，另一部分凍存于－80℃中用于Western blot 實驗。

1.3.3 ELISA 法檢測血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平

按照試劑盒說明檢測血清中CTX-Ⅰ、BGP水平。

1.3.4 股骨微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)指標的檢測

取各組大鼠左側(cè)股骨固定于10%福爾馬林溶液中，利用micro-CT 儀平掃大鼠左側(cè)股骨，掃描參數(shù)設(shè)置為：管電壓50 kV，管電流400 μA，分辨率10 μm，曝光時間300 ms，掃描角度360°。 使用Med Project 4.1 和Micro View 軟件對大鼠左側(cè)股骨二維圖像生成三維渲染，并自動計算骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量的變化。

1.3.5 HE 染色檢測大鼠股骨病理變化

將固定于4%多聚甲醛中的股骨組織脫鈣、包埋、切片（5 μm 厚）、HE 染色后，觀察股骨病理變化。

1.3.6 ALP 鈣－鈷染色檢測大鼠股骨中成骨細胞活性

取1.3.5 中的組織切片，經(jīng)脫蠟后，用ALP 孵育液孵育12 h，自來水沖洗；加入硝酸鈷孵育5 min，自來水沖洗；加入硫化工作液孵育2 min，自來水沖洗；核固紅染色，自來水沖洗；將切片脫水、透明、封片。 利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀形成情況，褐色沉淀形成越多，表明成骨細胞活性越高。

1.3.7 TRAP 染色檢測大鼠股骨組織中破骨細胞活性

取1.3.5 中的組織切片，經(jīng)脫蠟后，用TRAP 固定液固定1 min，自來水沖洗；TRAP 孵育液孵育1 h，自來水沖洗；蘇木素染液染色7 min，自來水沖洗；將切片脫水、透明、封片。 利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞質(zhì)內(nèi)紫紅色沉淀形成情況，紫紅色沉淀形成越多，表明破骨細胞活性越高。

1.3.8 Western blot 檢測各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白

用RIPA 裂解緩沖液提取股骨組織總蛋白，提取的蛋白經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，在4℃下將膜分別與一抗Wnt3a（1 ∶1000）、β-catenin（1 ∶2000）、GAPDH（1 ∶1000）過夜孵育。 次日，將膜與二抗（1∶2000）共同孵育2 h。 ECL 試劑用于蛋白印跡觀察，ImagePro Plus 軟件評估條帶強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)且方差齊。 單因素方差分析多組間的差異，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CGD 對大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平的影響

與CK 組比較，Model 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）；與Model 組相比，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平降低，BGP 水平升高，DKK-1 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠血清中CTX-Ⅰ水平升高，BGP 水平降低（P＜0.05）。 見表1。

表1 CGD 對各組大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP水平的影響（±s，n＝12）Table 1 Effect of CGD on serum CTX-Ⅰand BGP levels of rats in each group

表1 CGD 對各組大鼠血清中CTX-Ⅰ、BGP水平的影響（±s，n＝12）Table 1 Effect of CGD on serum CTX-Ⅰand BGP levels of rats in each group

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。Note.Compared with CK group， *P ＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.

組別Groups CTX-Ⅰ（ng／mL） BGP（ng／mL）CK 12.25±1.03 13.75±1.01 Model 28.74±1.75* 6.28±0.17*CGD-L 23.45±1.61＃ 8.25±0.28＃CGD-H 14.46±0.98＃△ 12.31±0.69?！鱁V 14.57±1.05?！?12.51±0.76＃△DKK-1 35.56±1.73＃ 3.69±0.22＃CGD-H＋DKK-1 20.32±1.77▲ 9.32±0.45▲

2.2 CGD 對大鼠股骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

與CK 組比較，Model 組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量降低（P＜0.05）；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量升高，DKK-1 組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量降低（P＜0.05）。 見圖1和表2。

圖1 Micro-CT 儀檢測大鼠股骨微觀結(jié)構(gòu)Figure 1 Micro-CT apparatus for detecting the microstructure of rat femur

表2 CGD 對各組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量的影響（±s，n＝12）Table 2 Effect of CGD on femoral bone volume fraction， trabecular thickness， bone density and trabecular number of rats in each group

表2 CGD 對各組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量的影響（±s，n＝12）Table 2 Effect of CGD on femoral bone volume fraction， trabecular thickness， bone density and trabecular number of rats in each group

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L 組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。Note.Compared with CK group， *P＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.

組別Groups骨體積分數(shù)（%）Bone volume fraction骨小梁厚度（mm）Trabecular thickness骨密度（g／mm3）Bone density骨小梁數(shù)量（n／mm）Number of trabeculae CK 19.67±0.54 0.078±0.002 0.29±0.01 5.89±0.23 Model 9.89±0.34* 0.023±0.001* 0.12±0.01* 1.72±0.14*CGD-L 12.62±0.42＃ 0.039±0.002＃ 0.18±0.01＃ 2.32±0.15＃CGD-H 17.72±0.48?！?0.066±0.004?！?0.27±0.02?！?5.21±0.26?！鱁V 17.81±0.50?！?0.068±0.003?！?0.26±0.01?！?5.24±0.27?！鱀KK-1 6.31±0.27＃ 0.011±0.001＃ 0.06±0.01＃ 1.06±0.09＃CGD-H＋DKK-1 13.66±0.45▲ 0.042±0.002▲ 0.19±0.02▲ 2.94±0.20▲

2.3 CGD 對大鼠股骨病理損傷的影響

CK 組大鼠股骨組織切片呈現(xiàn)出豐富、連續(xù)、致密的骨小梁；Model 組大鼠股骨組織切片表現(xiàn)為有大的骨髓腔形成以及骨小梁數(shù)量減少，符合OP 的典型特征，見圖2。 與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨病理損傷減輕，DKK-1 組大鼠股骨中形成的骨髓腔變大，骨小梁數(shù)量減少；與CGD-H 組相比，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨大的骨髓腔形成以及骨小梁數(shù)量減少的特征更加明顯。

注：箭頭所指處為骨髓腔。圖2 HE 染色檢測大鼠股骨病理變化Note.Arrow pointed to the bone marrow cavity.Figure 2 Pathological changes of rat femur detected by HE staining

2.4 CGD 對大鼠股骨組織中成骨細胞活性的影響

如圖3 所示，與CK 組相比，Model 組股骨組織中成骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀減少；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨組織中成骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀增多，DKK-1 組大鼠股骨組織中成骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀減少；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中成骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀減少。

注：箭頭所指處為成骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀。圖3 ALP 鈣－鈷染色檢測大鼠股骨中成骨細胞活性Note.Arrow pointed to a dark brown deposit in the osteoblastic cytoplasm.Figure 3 Detection of osteoblast activity in rat femur by ALP calcium cobalt staining

2.5 CGD 對大鼠股骨組織中破骨細胞活性的影響

圖4 結(jié)果顯示，與CK 組比較，Model 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質(zhì)內(nèi)紫紅色沉淀（箭頭所指處）明顯增多；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H組、EV 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質(zhì)內(nèi)紫紅色沉淀明顯減少，DKK-1 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀增多；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中的破骨細胞質(zhì)內(nèi)深褐色沉淀增多。

注：箭頭所指處為破骨細胞質(zhì)內(nèi)紫紅色沉淀。圖4 TRAP 染色檢測大鼠股骨組織中破骨細胞活性Note.Arrow pointed to a purplish red deposit in the osteoclast cytoplasm.Figure 4 Detection of osteoclast activity in rat femur by TRAP staining

2.6 CGD 對大鼠股骨組織中Wnt／β-catenin 相關(guān)蛋白表達的影響

如圖5 所示，與CK 組比較，Model 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）；與Model 組比較，CGD-L 組、CGD-H 組、EV 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達升高，DKK-1組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）；與CGD-H 組比較，CGD-H＋DKK-1 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達降低（P＜0.05）。

注：與CK 組比較， *P＜0.05；與Model 組比較， ＃P＜0.05；與CGD-L 組比較， △P＜0.05；與CGD-H 組比較， ▲P＜0.05。圖5 Western blot 檢測各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白Note.Compared with CK group， *P＜0.05.Compared with Model group， ＃P＜0.05.Compared with CGD-L group， △P＜0.05.Compared with CGD-H group， ▲P＜0.05.Figure 5 Western blot detection of Wnt3a and β-catenin proteins in femoral tissue of rats in each group

3 討論

OP 是一種以礦化骨量減少為特征的疾病，在解剖學(xué)上主要表現(xiàn)為皮質(zhì)厚度和孔隙率減少，松質(zhì)骨小梁的數(shù)量和大小減少，髓質(zhì)空間擴大［12］。 有研究報道，骨的生物力學(xué)能力不僅與存在的骨量有關(guān)，還與它的微觀結(jié)構(gòu)（骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量等）有關(guān)［13］。 本研究通過灌胃維甲酸的方式構(gòu)建OP 大鼠模型，結(jié)果顯示，Model組大鼠的股骨組織切片表現(xiàn)為有大的骨髓腔形成以及骨小梁數(shù)量減少，Model 組大鼠股骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁數(shù)量顯著低于CK組，提示成功構(gòu)建了OP 模型大鼠。 研究報道，破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細胞介導(dǎo)的骨形成之間的不平衡導(dǎo)致了OP，其中，成骨細胞和破骨細胞活性的不平衡起主要作用［14］；CTX-Ⅰ是骨吸收標志物，而BGP 為骨形成的標志物，因此，血清中CTX-Ⅰ、BGP 水平可作為衡量OP 過程中骨形成的重要指標［15－16］。 本研究發(fā)現(xiàn)，與CK 組相比，Model 組破骨細胞活性升高、成骨細胞活性降低，血清中CTX-Ⅰ水平升高、BGP 水平降低，表明成骨細胞介導(dǎo)的骨形成低于破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收，導(dǎo)致了骨量減少，進而形成了OP。

OP 屬“骨痿”范疇，中醫(yī)認為其主要病機為肝失所養(yǎng)、脾失健運，故主張以疏肝理氣、健脾為治療原則［17］。 CGD 在原方的基礎(chǔ)上通過去人參避免補益太過；加入焦神曲健脾和胃；白術(shù)健脾益氣；黨參補中益氣，合為CGD 方，以增強其疏肝和胃、健脾之功效。 目前，不同種類的的CGD 方已應(yīng)用于多種疾病的研究，如CGD 可抑制三陰性乳腺癌裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長［18］；CGD 治療功能性消化不良效果顯著［19］。 而關(guān)于CGD 對OP 的影響尚未見報道。 本研究顯示，CGD 可抑制破骨細胞活性及CTX-Ⅰ水平，上調(diào)成骨細胞活性并促進BGP 表達，且CGD 劑量越高，對應(yīng)的趨勢越明顯，而CGD-H 組與EV 組相比對應(yīng)指標的趨勢變化差異不顯著，說明CGD 可能是通過促進成骨細胞介導(dǎo)的骨形成，并抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收來改善大鼠OP 的。 此外，盡管EV 治療OP 效果顯著，但其極易產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、精神狀態(tài)不佳等副作用［20］。 提示CGD 可能成為治療OP 的潛在優(yōu)良藥物。

大量研究表明，Wnt／β-catenin 通路可以刺激成骨細胞增殖和分化，在OP 進展中發(fā)揮重要作用［21］。 如二甲雙胍激活Wnt／β-catenin 通路可治療糖尿病性O(shè)P［22］；益腎健骨顆粒通過激活Wnt／β-catenin 通路促進去卵巢大鼠成骨細胞增殖而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松［23］。 以上研究表明激活Wnt／β-catenin 通路可以改善OP。 本研究顯示，經(jīng)Wnt／β-catenin 通路抑制劑DKK-1 處理后，Model 組大鼠對成骨細胞介導(dǎo)的骨形成的抑制作用以及對破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收的促進作用增強，表明Wnt／β-catenin 通路確實參與了OP 過程。 本研究還發(fā)現(xiàn)，CGD 可上調(diào)Model 組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達，且CGD 劑量越高，Wnt3a、β-catenin 蛋白表達上調(diào)趨勢越明顯，猜想CGD 改善大鼠OP 可能是通過激活Wnt／β-catenin 通路實現(xiàn)的。 為了驗證該猜想，本研究在高劑量CGD 處理的基礎(chǔ)上再用DKK-1 干預(yù)OP 大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DKK-1減弱了高劑量CGD 對大鼠OP 的改善作用。

綜上所述，CGD 可能通過激活Wnt／β-catenin通路改善大鼠OP。 該研究可能為OP 的治療提供了一個新的視角。 CGD 對大鼠OP 的改善作用可能還涉及其他通路，本研究尚未探究，這將是后續(xù)研究的重點內(nèi)容之一。