紀(jì) 爽潘 慧李天騏葉夢(mèng)婷馬銘婕張學(xué)佳王曉建*楊曉敏

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，阜外醫(yī)院肺血管醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家心血管病中心，北京 100037；3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014030；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，杭州 310016；5.衢州市柯城區(qū)人民醫(yī)院，浙江 衢州 324000）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH） 是 第 一 大 類 肺 高 血 壓 （ pulmonary hypertension，PH），根據(jù)病因不同可分為先心病相關(guān)肺動(dòng)脈高壓（ congenital heart disease-associated pulmonary arterial hypertension，CHD-PAH）、特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（idiopathic pulmonary hypertension，IPAH）、遺傳性肺動(dòng)脈高壓、藥物和毒素相關(guān)肺動(dòng)脈高壓等多種亞型［1］。 CHD-PAH 和IPAH 是我國(guó)排名前兩位的肺動(dòng)脈高壓類型，分別占第一大類肺動(dòng)脈高壓43.4%～56.1%、30.8%～35.4%［2－3］。 這兩種肺動(dòng)脈高壓預(yù)后差異很大，CHD-PAH 的1 年、5年和10 年生存率分別是99%、91%和85%，而IPAH只有90%、63%和46%［4］。 為何CHD-PAH 患者的預(yù)后優(yōu)于IPAH，具體機(jī)制尚不十分清楚。

本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，單純左向右分流手術(shù)不會(huì)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓，但會(huì)在術(shù)后1 周誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)快速的左心代償性重構(gòu)，并在術(shù)后8 周持續(xù)存在［5］。 有研究表明，嚴(yán)重的CHD-PAH患者盡管會(huì)產(chǎn)生右心結(jié)構(gòu)的改變，但右心收縮功能卻可以在數(shù)十年內(nèi)保持正常。 這種改變可能是由于分流的存在，導(dǎo)致左心部分分擔(dān)了右心的壓力［6］。 在先天性心臟病的早期關(guān)閉心臟內(nèi)左向右的分流，使肺血流動(dòng)力學(xué)和血管回到正常環(huán)境，這些患者仍有部分會(huì)發(fā)展成肺動(dòng)脈高壓且預(yù)后明顯比未進(jìn)行矯治的CHD-PAH 患者差［7－10］。 所以，我們推斷左向右分流引起的左心代償是心臟整體的“預(yù)適應(yīng)”，可能在先心病合并肺動(dòng)脈高壓患者的預(yù)后中起積極的作用。

本項(xiàng)目中，我們利用大鼠頸部分流手術(shù)疊加野百合堿（monocrotaline，MCT）來(lái)模擬左向右分流型CHD-PAH，設(shè)置單純MCT 組來(lái)模擬IPAH，比較兩組肺動(dòng)脈高壓大鼠在表型差異，進(jìn)而探究?jī)煞N不同類型肺動(dòng)脈高壓患者預(yù)后不同的可能原因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（150 ～200 g，8 周齡），購(gòu)買自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司［SCXK（京）2021－0006］。 動(dòng)物飼養(yǎng)條件為12 h／12 h 的明／暗交替、濕度（50±10）%、溫度（22±1）℃，自由獲取飲食，飼養(yǎng)在清潔環(huán)境，飼養(yǎng)于心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室［SYXK（京）2022－0052］。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守3R 原則，本項(xiàng)目研究方案通過(guò)阜外醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（FW-2022-0028）。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷（廣州碩恒生物科技有限公司，批號(hào)：20221001）；野百合堿（MCT）（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：mfcd00084656）；4%多聚甲醛溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0111A23）；EVG 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GR3382140－1）。 小動(dòng)物超聲儀（加拿大VisualSonics 公司，序列號(hào)：041QPR）；小動(dòng)物氣麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx 公司，序列號(hào)：V1643859）；多導(dǎo)生理記錄儀（Powerlab 8／30）及其配套的壓力換能器（北京華睿寶科技有限公司，序列號(hào)：DB763）；全景玻片掃描系統(tǒng)（廈門精藝興業(yè)科技有限公司，序列號(hào)：17490957）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（control，n＝8）；單純野百合堿組（simple MCT，n＝8），皮下注射MCT（50 mg／kg）；手術(shù)＋MCT 組（operation＋MCT，n＝8），頸部動(dòng)靜脈吻合術(shù)的同時(shí)注射MCT（50 mg／kg）。造模后3 周為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，各組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查、右心導(dǎo)管檢測(cè)和肺組織病理學(xué)分析。

1.3.2 頸部動(dòng)靜脈吻合術(shù)

吸入異氟烷麻醉后，大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，頸部剃毛備皮后，做一斜形切口。 分離頸部動(dòng)、靜脈，腹腔注射肝素200 U，夾住動(dòng)、靜脈近端，綁扎遠(yuǎn)端，剪斷動(dòng)、靜脈，吻合動(dòng)、靜脈殘端。動(dòng)靜脈吻合后，拔除血管夾，立即可見靜脈搏動(dòng)，吻合口無(wú)漏血，手術(shù)成功。 縫合頸部皮膚，消毒傷口表面。

1.3.3 MCT 皮下注射

在大鼠后頸背部皮下注射MCT（50 mg／kg）。

1.3.4 超聲心動(dòng)圖檢查

將大鼠吸入異氟烷麻醉，仰臥于測(cè)量臺(tái)上，暴露胸部皮膚并涂抹耦合劑，使用小動(dòng)物超聲裝置（Vevo 2100 成像系統(tǒng)）檢測(cè)主動(dòng)脈短軸切面上右心室流出道寬度，在多普勒模式下的主動(dòng)脈短軸圖像上測(cè)量肺動(dòng)脈血流量，在四腔切面上觀察三間瓣環(huán)收縮期位移，舒張期右心室游離壁厚度和管腔直徑是在胸骨旁右心短軸切面上測(cè)量的。

1.3.5 左右心導(dǎo)管檢查

當(dāng)大鼠吸入異氟烷麻醉后，在胸骨上方1 cm 處切開皮膚，暴露頸外靜脈。 剝離并切斷頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，近端打松結(jié)，拉緊近端結(jié)扎線以防止出血。 用針刺破頸外靜脈，將導(dǎo)管插入血管，將近心端結(jié)扎線扎緊以固定導(dǎo)管。 導(dǎo)管緩慢推進(jìn)，導(dǎo)管穿過(guò)右心進(jìn)入肺動(dòng)脈。 用波形驗(yàn)證導(dǎo)管位置，并記錄右心室和肺動(dòng)脈壓力。 取3 個(gè)穩(wěn)定波形，每個(gè)波形由10 個(gè)心動(dòng)周期組成，記錄平均肺動(dòng)脈壓和右心室收縮壓。 保存3 組數(shù)據(jù)的平均值作為大鼠的壓力值，并采用相同的方法測(cè)量左心。

1.3.6 病理檢查

取出完整的大鼠左葉肺組織，在室溫下用4%多聚甲醛固定2 周，然后脫水并包埋在石蠟中。 HE和EVG 染色后計(jì)算肺小動(dòng)脈（＜50 μm 和50 ～100 μm）中膜厚度（肌層厚度／血管外徑）的百分比。 每組至少計(jì)數(shù)5 只大鼠，每只大鼠至少有15 只血管。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析，連續(xù)變量表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。 多組間均值比較采用單因素方差分析，兩組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)兩組比較，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)＋MCT 組大鼠的左心室重構(gòu)優(yōu)于單純MCT 組大鼠

與對(duì)照組相比，單純MCT 組和手術(shù)＋MCT 組的舒張期右室前壁厚度（right ventricular wal，RVAW；d） 和 舒 張 期 右 室 腔 徑（right ventricular internal diameter，RVID；d）顯著增加（表1，P＜0.01）；三尖瓣環(huán)收縮期位移（tricuspid annular plane systolic excursion，TAPSE）和肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間／肺動(dòng)脈射血時(shí)間（acceleration time of pulmonary blood flow／pulmonary ejection time，PAT／PET）均降低，提示兩組大鼠均出現(xiàn)右心重構(gòu)和右心功能障礙（表1，P＜0.01）。 單純MCT 組與手術(shù)＋MCT 組兩組之間在右心重構(gòu)指標(biāo)上無(wú)明顯差異。 單純MCT 組大鼠的左心受擴(kuò)張的右心室壓迫，舒張期左室腔徑（left ventricular internal diame， LVID；d）減小，左心射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction， EF）升高，顯著高于對(duì)照組（圖1，P＜0.05）。 與單純MCT 組相反，手術(shù)＋MCT組大鼠雖然右心室也發(fā)生重構(gòu)，但是LVID；d 未降低，EF 值未升高，總體上更接近正常對(duì)照組，提示左向右分流手術(shù)部分緩解了MCT 引起的左心重構(gòu)。

注：A：對(duì)照組（n ＝5）；B：?jiǎn)渭僊CT 組（n ＝8）；C：手術(shù)＋MCT 組（n ＝8）；D：舒張期左室腔徑統(tǒng)計(jì)圖；E：左心射血分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)圖。 與對(duì)照組相比， *P＜0.05， **P＜0.01。圖1 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)大鼠胸骨旁右心短軸切面M 模式檢測(cè)圖及結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Note.A， Control group（n ＝5）.B， Simple MCT group （n ＝8）.C， Operation＋MCT group （n ＝8）.D， Statistical diagram of left ventricular cavity diameter in diastole.E， Statistical diagram of left ventricular ejection fraction.Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01.Figure 1 M-mode detection diagram and result statistics of parasternal right heart short-axis section in rats at the end of the experiment

表1 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)三組大鼠超聲結(jié)果Table 1 Ultrasonic results of rats in three groups at the end of the experiment

2.2 手術(shù)＋MCT 組大鼠的右心室功能處于代償期

與對(duì)照組相比，其余兩組的平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）和右室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）均升高（表2，P＜0.01），提示兩組大鼠均發(fā)生肺動(dòng)脈高壓。與單純MCT 組相比，手術(shù)＋MCT 組的mPAP 和RVSP 稍低，左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP） 顯 著 升 高（71.2 vs 105.1，P＜0.05）（表2，P＜0.01），在右心功能方面，單純MCT 大鼠的右心等容收縮期心室內(nèi)壓上升最大速率（maximal ventricular pressure rising rate，dp／dt Max） 和等容舒張期心室內(nèi)壓下降最大速率（maximal rate of decrease of ventricular pressure，dp／dt Min）均顯著高于對(duì)照組，提示肺動(dòng)脈壓力升高使該組大鼠右心室處于功能代償期。 如圖2所示，MCT＋分流組大鼠右心代償雖然高于對(duì)照組，但顯著低于單純MCT 組，提示該組大鼠右心后負(fù)荷和代償反應(yīng)明顯低于單純MCT 組（P＜0.05）。 這與MCT＋分流組大鼠肺血管壓力稍低于單純MCT 組相一致。

注：A：各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力波形圖（n＝8）；B：各組大鼠右室收縮壓波形圖（n＝8）；C：右心等容收縮期心室內(nèi)壓力上升最大速率（dp／dt Max）統(tǒng)計(jì)圖；D：右心等容舒張期心室內(nèi)壓下降最大速率（dp／dt Min）統(tǒng)計(jì)圖。 與對(duì)照組相比， *P＜0.05， **P＜0.01， ****P＜0.0001。圖2 各組大鼠右心導(dǎo)管測(cè)壓波形圖Note.A， Waveform of mean pulmonary artery pressure of rats in three groups （n＝8）.B， Right ventricular systolic pressure waveform of rats in three groups （n＝8）.C， Statistical diagram of the maximum rate of ventricular pressure rise （dp／dt Max） during isovolumic contraction of the right heart.D，Maximum rate of decrease of ventricular internal pressure （dp／dt Min） of right heart during isovolumic relaxation.Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01， ****P＜0.0001.Figure 2 Waveform of right ventricular catheter pressure measurement of rats in each group

2.3 MCT 注射誘導(dǎo)嚴(yán)重肺血管重構(gòu)

在明確右室重構(gòu)和肺動(dòng)脈壓力變化的前提下，對(duì)三組大鼠肺組織病理學(xué)染色，分析肺血管病變程度（圖3）。將肺小動(dòng)脈分為直徑＜50μm和直徑50 ～100 μm 兩組，分別統(tǒng)計(jì)中膜厚度百分比。 與對(duì)照組相比，單純MCT 組和手術(shù)＋MCT 組肺小動(dòng)脈中膜增厚，肺血管明顯重構(gòu)（表3，P＜0.001）。 單純MCT 組和手術(shù)＋MCT 組兩組之間肺小動(dòng)脈重構(gòu)程度沒有明顯差異（圖3G、3H，P＜0.05），提示左向右分流不影響肺血管重構(gòu)，主要影響心臟重構(gòu)，進(jìn)而影響預(yù)后。

注：A～C：對(duì)照組、單純MCT 組、手術(shù)＋MCT 組大鼠肺小動(dòng)脈HE 染色圖；D～F：對(duì)照組、單純MCT 組、手術(shù)＋MCT 組大鼠肺小動(dòng)脈EVG 染色圖；G：直徑50 μm 以下血管中膜厚度百分比統(tǒng)計(jì)圖（n ＝8）；H：直徑50～100 μm 血管中膜厚度百分比統(tǒng)計(jì)圖（n＝8）。 與對(duì)照組相比， **P＜0.01， ***P＜0.001， ****P＜0.0001。圖3 各組大鼠肺組織病理染色及統(tǒng)計(jì)圖Note.A～C， HE staining of pulmonary arterioles of rats in control group， simple MCT group and operation＋MCT group.D～F， EVG staining of pulmonary arterioles in rats of control group， simple MCT group and operation ＋MCT group.G， Statistical chart of percentage of vascular media thickness below 50 μm （n ＝8）.H， Statistical chart of the percentage of vascular media thickness 50～100 μm （n ＝8）.Compared with control group， **P＜0.01， ***P＜0.001， ****P＜0.0001.Figure 3 Pathological staining and statistical diagram of lung tissue of rats in each group

表3 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)三組大鼠肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比結(jié)果Table 3 Percentage results of pulmonary arteriolar media thickness of rats in three groups at the end of the experiment

3 討論

本研究中，單純MCT 組和手術(shù)＋MCT 組大鼠術(shù)后3 周均出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓和右心室重構(gòu)，且兩組大鼠之間無(wú)明顯差異。 但對(duì)更多表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)手術(shù)＋MCT 組大鼠的LVID；d、EF、右心dp／dt Max 和dp／dt Min 均明顯優(yōu)于單純MCT 組，提示CHD-PAH 與IPAH 在心臟重構(gòu)方面有很大的不同。

注射MCT 是制造肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的經(jīng)典方法，單次皮下注射劑量范圍為40 ～80 mg／kg 體重，最常用的的劑量為60 mg／kg 體重［11－12］。 本研究中，我們將MCT 的注射量從常規(guī)的60 mg／kg 體重降低到50 mg／kg 體重，更好地展示了左向右分流在CHD-PAH 中所起的作用。 與腹主動(dòng)脈－腔靜脈分流術(shù)模型相比［13－14］，本研究采用的頸部分流更靠近大鼠心臟，所產(chǎn)生的分流也更加強(qiáng)烈，更加符合患者的臨床特征。 本研究所模擬的CHD-PAH 在肺動(dòng)脈壓力、右室重構(gòu)、肺血管病理重構(gòu)等多方面與IPAH 大鼠沒有明顯差別，但CHD-PAH 大鼠的左室功能更好，右室因肺動(dòng)脈壓力升高引起的代償性反應(yīng)性更低。 這些發(fā)現(xiàn)與臨床研究相一致。 2013 年一項(xiàng)針對(duì)不同類型肺動(dòng)脈高壓患者臨床特征的研究表明，CHD-PAH 患者肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力最高，但患者肺動(dòng)脈高壓功能分級(jí)（WHO-FC）和運(yùn)動(dòng)耐量較好，提示CHD-PAH 患者心功能與肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力并不一致［15］。 關(guān)于中國(guó)肺動(dòng)脈高壓特征的多中心人群隊(duì)列研究結(jié)果顯示，與IPAH患者相比CHD-PAH 組患者更容易延誤診斷導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力更高，但心臟的性能更好，生存率明顯優(yōu)于其他病因組［16－17］。

真實(shí)世界中，CHD-PAH 與IPAH 患者病程很長(zhǎng)。 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，僅觀察了造模后3 周的表型變化，并且未設(shè)計(jì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖、左右心導(dǎo)管和肺組織病理學(xué)檢測(cè)，觀察左心代償作用產(chǎn)生的時(shí)間點(diǎn)。 后續(xù)我們將做更多研究，明確這兩個(gè)模型在長(zhǎng)期預(yù)后和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心肺功能的改變。

肺動(dòng)脈高壓患者的病灶部位在肺血管，但預(yù)后主要取決于心臟整體功能和代償能力。 本研究比較了IPAH 和CHD-PAH 兩種不同病理情況大鼠模型心臟結(jié)構(gòu)、肺動(dòng)脈壓力和肺小動(dòng)脈病理變化，發(fā)現(xiàn)先心病合并肺動(dòng)脈高壓與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的心臟重構(gòu)有著很大不同，在肺血管重構(gòu)相似的情況下，左向右分流的先心病顯著改變了心臟整體對(duì)肺動(dòng)脈壓力升高的代償反應(yīng)。 我們的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究這兩種不同肺動(dòng)脈高壓亞型的病理機(jī)制打下基礎(chǔ)。