曹廷茂 羅貞寶 劉奇源 張民 劉一靈 劉仁祥 李德侖 李振華

摘 ?要：為深入解析光對煙草早期幼苗發(fā)育的調(diào)控機理，以烤煙品種CV87為試材，設(shè)置12?h光周期和持續(xù)黑暗2個處理，采用表型組學(xué)研究了煙草種子培育第1～9天的形態(tài)變化，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了其發(fā)育第4天基因表達網(wǎng)絡(luò)差異。結(jié)果表明，光下種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率提高約30%，子葉開口長增加約2?cm，而下胚軸長度縮短約2?cm。在早期幼苗發(fā)育階段有551個基因差異表達受光誘導(dǎo)，其中364個表達上調(diào)，187個表達下調(diào)。551個基因中有28個在蛋白水平存在互作關(guān)系，其中包括、、等15個上調(diào)表達基因和、和等13個下調(diào)表達基因。GO富集表明，這28個DEGs主要與光合作用、光系統(tǒng)、植物激素響應(yīng)有關(guān)。綜上所述，本研究解析了煙草早期幼苗發(fā)育過程中響應(yīng)光信號的表型變化，并通過轉(zhuǎn)錄組分析挖掘到一些調(diào)控表型差異相關(guān)基因，這些結(jié)果為進一步研究光環(huán)境對煙草萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育的影響提供了參考。

關(guān)鍵詞：種子萌發(fā)；早期幼苗發(fā)育；光信號；表型組；轉(zhuǎn)錄組；煙草

中圖分類號：S572.01???????????????????????文獻標(biāo)識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0045-10

Study of Light-Regulated?Early Seedling Development in Tobacco through Phenomic and Transcriptomic Data?Analysis

CAO?Tingmao，?LUO?Zhenbao，?LIU?Qiyuan，?ZHANG?Min，

LIU?Yiling，?LIU?Renxiang， LI?Delun，?LI Zhenhua

（1. Bijie City Tobacco Company of Guizhou Province， Bijie， Guizhou 551700， China; 2. College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 3. College of Tobacco， Guizhou University， Key Laboratory of Tobacco Quality Research in Guizhou Province， Guiyang 550025， China; 4.Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China）

To delve into the intricate mechanisms governing the regulation of early seedling?development in tobacco in response to light， the tobacco variety CV87 was chosen as the experimental material. Two treatments were implemented： a 12-hour light period and a continuous darkness， allowing for a comprehensive phenotypic study of morphological changes during the first nine days of tobacco seed incubation. Building upon this foundation， a transcriptomic analysis was employed specifically on the fourth day of development to investigate differential gene expression networks. The findings revealed that seed germination vigor and germination rate showed an increase of approximately 30% under light conditions. Furthermore， the elongation of cotyledon opening increased by approximately 2 cm， while the length of the hypocotyl decreased by approximately 2 cm. During the early stages of seedling development， 551 genes exhibited differential expression induced by light， with 364 genes?being?upregulated and 187 genes?being?downregulated. Among these 551 genes， 28 of them were found to interact at the protein level， including upregulated genes such as ， ， and ， as well as downregulated genes such as ， ， and . Gene Ontology （GO） enrichment analysis demonstrated that these 28 differentially expressed genes were primarily associated with photosynthesis， light systems， and plant hormone responses. In conclusion， this study elucidates the phenotypic variations during?early tobacco seedling development in response to light signals. Through transcriptomic analysis， several regulatory genes associated with the observed phenotypic differences were uncovered. These findings serve as a foundation for further research on the impact of light environment on tobacco germination and early seedling development.

?seed germination; early seedling development; light signaling; phenome; transcriptome;?tobacco

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32060512、31860420）；貴州省煙草公司項目（201904）；貴州省科技廳項目{黔科合基礎(chǔ)ZK[2022]一般288}

作者簡介：曹廷茂（1979-），男，碩士，主要從事煙草育種及栽培技術(shù)研究。E-mail：caotingmao@sina.com。*通信作者，E-mail：zhli3@gzu.edu.cn

收稿日期：2023-01-08???????????????修回日期：2023-09-05

寡照是我國部分煙區(qū)早春季節(jié)典型的氣候特點，此時值烤煙育苗關(guān)鍵期，受該不良?xì)夂蛴绊懀緹熞壮霈F(xiàn)出苗緩慢，苗齡長，苗羸弱，移栽后還苗期長，幼苗抗逆性弱等問題。近年來，補光設(shè)施的利用一定程度上緩解了該不良?xì)夂虻挠绊懀a光設(shè)施耗能耗資較大，規(guī)?；\用存在一定難度。

因此，解析光照調(diào)控?zé)煵萦酌绨l(fā)育的分子機理，創(chuàng)制煙草抗逆種質(zhì)對于未來烤煙生產(chǎn)具有重要意義。

植物通過光受體感受外界光質(zhì)、光量和光周期調(diào)控幼苗發(fā)育。到目前為止，已在模式植物擬南芥中鑒定出13種光受體，其中，光敏色素（PHY）被認(rèn)為是調(diào)控幼苗發(fā)育的主要光感受器。當(dāng)種子在無光環(huán)境或土壤深處萌發(fā)后，幼苗的胚軸將向光生長，在幼苗頂端形成一個頂部彎鉤來保護幼嫩的莖尖分生組織，最終發(fā)育為胚軸細(xì)長且?guī)в许敳繌濄^的黃化苗。當(dāng)幼苗伸出土壤或在白光條件下培育時黃化苗將轉(zhuǎn)綠，上述過程專業(yè)上分別稱之為暗形態(tài)和光形態(tài)建成。無光條件下光敏色素（PHYs）失活，導(dǎo)致光敏色素互作因子PIF（PIFs）和E3泛素連接酶COP1和SPA蛋白組成的E3泛素連接酶復(fù)合體（COP1/SPAs）積累，從而促進暗形態(tài)發(fā)生。在黑暗環(huán)境下，缺失會導(dǎo)致幼苗表現(xiàn)出光形態(tài)特征，如：下胚軸較短，子葉展開和頂端缺陷。在有光條件下，PHYs被激活，調(diào)節(jié)PIFs的降解和減除COP1/SPA復(fù)合體穩(wěn)定性，導(dǎo)致下胚軸伸長蛋白HY5的積累，促進光形態(tài)建成。我國部分南方煙區(qū)在育苗階段易遭遇多霧、陰雨等天氣，加上塑料大棚薄膜的隔絕，特別是多年使用的育苗大棚，其透光度顯著降低，棚內(nèi)往往出現(xiàn)寡照環(huán)境，致使煙苗出現(xiàn)莖稈細(xì)弱、葉色偏黃等暗形態(tài)建成特征，嚴(yán)重影響煙草移栽后的正常生長發(fā)育。

光是一種重要的環(huán)境因子，它幾乎參與調(diào)控烤煙生長發(fā)育的各個階段，如：種子萌發(fā)，幼苗發(fā)育、營養(yǎng)生長和生殖生長等。在幼苗發(fā)育階段，光亦抑制煙草下胚軸伸長，促進子葉展開，頂部彎鉤消失等。然而，關(guān)于光調(diào)控?zé)煵萦酌绨l(fā)育的分子機理的研究卻較少。因此，本研究以煙草為試材，比較有光和無光條件下種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育表型的差異；在此基礎(chǔ)上，以已經(jīng)萌發(fā)的種子為試材，研究有光和無光條件下其基因表達差異，并通過Go富集和蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的研究方法，構(gòu)建了光調(diào)控?zé)煵菰缙谟酌绨l(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗設(shè)計

試驗用CV87煙草種子，由貴州煙草研究所提

供。所有種子在授粉后40?d收獲，在熱風(fēng)干燥機中40?℃機械干燥36?h。脫粒后的種子在室溫下保存，所有試驗在1個月內(nèi)完成。試驗設(shè)2個處理，每個處理3次重復(fù)，分別在持續(xù)黑暗和12 h光/暗間斷的光周期條件下進行種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育試驗，該試驗在0.8%的瓊脂發(fā)芽床上進行。在培育的第1～9天，通過3D-表型組學(xué)平臺比較2種環(huán)境下種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的表型變化。在培育第4天，即種子萌發(fā)完成后即將進入幼苗發(fā)育階段，將2個處理、3次重復(fù)共6個試驗樣品，每個樣品稱取0.5?g進行轉(zhuǎn)錄組測序，取樣部位為幼苗整體，比較2種處理的差異表達基因和信號通路，探析光調(diào)控幼苗發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)。

1.2??試驗方法

1.2.1 ?種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育??種子萌發(fā)試驗以及發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定參照本課題組已公開發(fā)表的方法。將100粒煙草種子按照10×10的規(guī)格均勻點播在0.8%的瓊脂發(fā)芽床表面，分別置于25?℃，12 h光周期和持續(xù)黑暗的人工氣候箱內(nèi)萌發(fā)，每處理3次重復(fù)。從第1天開始記錄種子發(fā)芽數(shù)，每隔1天記錄1次種子萌發(fā)的數(shù)量，連續(xù)記錄至第14天為止。于第7天計算發(fā)芽勢和第14天計算發(fā)芽率。發(fā)芽勢=7 d萌發(fā)種子數(shù)/被測種子數(shù)×100%，發(fā)芽率=14 d內(nèi)萌發(fā)種子數(shù)/被測種子數(shù)×100%。種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育2個階段的界定標(biāo)準(zhǔn)參照本課題組已公開發(fā)表的方法，其中吸脹后第1至4天為種子萌發(fā)階段，吸脹后第6至9天為幼苗發(fā)育階段。

1.2.2 ?表型組數(shù)據(jù)??種子或幼苗表型測定參照文獻[23-24]。將3次重復(fù)，每個重復(fù)100粒種子放置在一個成像室內(nèi)，通過Scanalyzer HTS（德國，LemnaTec公司）以天為單位獲得圖像。使用LemnaTec HTS系統(tǒng)中的Lemna Grid軟件處理圖像，測量種子（幼苗）的總周長、總面積以及胚根、胚軸、子葉的周長和面積。從第1到9天測定種子（幼苗）的總周長和面積。從第6到9天測定胚根、胚軸和子葉的周長和面積；此外，在第6到9天測量子葉彎曲率。

1.2.3 ?轉(zhuǎn)錄組測序??轉(zhuǎn)錄組測序參照本課題組已公開發(fā)表的方法。首先使用TRIzol試劑盒（天根生化科技，北京）提取萌發(fā)4 d后種子中的總RNA。隨后交由上海歐易生物技術(shù)有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Science，美國）檢測提取的RNA純度，通過Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，美國）檢測RNA的完整性。通過TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina，美國）構(gòu)建基因文庫。使用Illumina HiSeq X Ten平臺對文庫進行測序，并產(chǎn)生150?bp的成對末端讀序。通過Triomatic處理原始讀序。最后本課題組完成了數(shù)據(jù)分析，其中基因差異表達分析使用DESeq（2012）R包。<0.05，FC>2或<0.5以及FPKM＞1被用作差異表達的閾值。隨后，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。篩選出了在發(fā)芽4?d的差異表達基因（DEGs），根據(jù)超幾何分布，用hiplot pro（https：//hiplot.com.cn/）的“GO/KEGG富集分析”進行基因本體Gene Ontology（GO）富集分析。

1.2.4 ?蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的建立??通過高通量測序獲得的差異表達基因來預(yù)測對應(yīng)蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心調(diào)控基因?；贕enemania在線數(shù)據(jù)庫（https：//genemania.org/）將所有基因名稱整理到一個列表，預(yù)測差異表達基因的互作關(guān)系。

1.2.5 ?RT-PCR??為驗證RNA測序的結(jié)果，在光合作用和碳代謝通路上隨機選擇10個表達差異較大的基因進行qRT-PCR驗證，選擇作為內(nèi)參，反應(yīng)體系參照文獻[26]，對qRT-PCR的相對表達水平和RNA-seq的FPKM值進行相關(guān)性分析，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)分析RNA-seq測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物序列如表1所示。

1.2.6 ?統(tǒng)計分析??采用SPSS Statistics 25對處理數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較，采用Graphpad prism v9.5.0.730對數(shù)據(jù)進行整理并作圖。

2 ?結(jié) ?果

2.1??光照對煙草早期幼苗發(fā)育的影響

由表2可知，相比于黑暗處理，12?h光周期處理的種子發(fā)芽率提高了約30%，差異顯著（＜0.001）。由圖1可知，12?h光周期處理和黑暗處理下萌發(fā)過程中的種子周長和面積差異不顯著，而萌發(fā)后的幼苗面積差異顯著（＜0.001或＜0.01）。其中，在發(fā)育的第6～7天，黑暗處理的幼苗周長和面積顯著高于12?h光周期處理（＜0.001或＜0.01）；第8天，兩個處理周長仍存在顯著差異（＜0.001），而面積差異不顯著；而第9天，12?h光周期處理的幼苗面積顯著高于黑暗處理（＜0.001）。以上結(jié)果說明光照影響種子的萌發(fā)率，但不影響種子的萌發(fā)表型；對幼苗發(fā)育表型影響較大。

由圖2可知，從發(fā)育第7天始，黑暗處理下幼苗的胚軸長顯著高于12 h光周期處理（＜0.001），在發(fā)育的第9天，下胚軸長度最終增加了約2?cm。在發(fā)育的第7天，黑暗處理的胚根長度顯著大于12?h光周期處理（＜0.05）；而在發(fā)育的第9天，黑暗處理的胚根長度顯著小于12?h光周期處理（＜0.01）。由圖3可知，從發(fā)育第7天始，黑暗處理下子葉面積顯著大于12?h光周期處理（＜0.001）。從發(fā)育第7天始，黑暗處理下幼苗的子葉開口長度顯著小于12?h光周期處理，直至發(fā)育的第9天，子葉開口約縮短了2?cm（＜0.05或＜0.001）。綜上所述，光環(huán)境顯著影響了煙草種子的發(fā)芽指標(biāo)和幼苗發(fā)育表型。相比于黑暗環(huán)境，12?h光周期更加適宜種子萌發(fā)。而在幼苗發(fā)育階段，黑暗環(huán)境會減少幼苗的子葉開口開度，增加下胚軸長度（圖4）。

2.2??光照對煙草幼苗發(fā)育早期基因表達水平的影響

利用Illumina平臺對12?h光周期和黑暗處理第4天的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得551個差異表達基因（Different expression genes， DEGs），其中364個上調(diào)、187個下調(diào)。對551個差異表達基因進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)28個基因在蛋白水平存在互作關(guān)系（表3），其中等15個基表達上調(diào)。是類囊體膜蛋白基因，該蛋白與色素分子結(jié)合形成捕光色素蛋白復(fù)合體，而光捕獲蛋白是綠色植物PSI的核心。、、、和等5個基因為膜內(nèi)周蛋白基因，是正確組裝PSI所必需的。編碼葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPA亞基，而葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶是催化卡爾文循環(huán)促進CO固定的關(guān)鍵酶。以上結(jié)果說明，在幼苗發(fā)育早期光照可能會促進PSI形成和卡爾文循環(huán)。等13個基因表達下調(diào)。、、、等4個基因參與調(diào)控種子脫水、休眠和早期胚發(fā)育。和參與油脂代謝。響應(yīng)逆境反應(yīng)。以上結(jié)果說明在早期幼苗發(fā)育階段光照可能會抑制種子休眠和油脂代謝。

2.3 ?光照對煙草幼苗發(fā)育早期信號通路的影響

由圖5可知，不同光照條件下煙草幼苗發(fā)育早期差異表達基因通過GO富集分成3個部分：生物過程（Biological processes，BP）、分子功能（Molecular functions，MF）和細(xì)胞組分（Cellular components，CC）。BP模塊包括葉綠素代謝過程、代謝物和能量的前體形成、光合作用、色素合成、卟啉類化合物代謝過程。MF模塊包括氧化還原酶活性、水楊酸結(jié)合和核糖體結(jié)構(gòu)組成等。CC模塊包括葉綠體葡萄球體、葉綠體葡萄球體膜、光合作用膜、質(zhì)體葡萄球體、質(zhì)體葡萄球體膜和質(zhì)體膜。以上結(jié)果說明，種子萌發(fā)后光主要促進葉綠素合成和光合作用。

2.4 ?RT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從代謝物和能量的前體形成、光合作用反應(yīng)通路中隨機選取10個差異表達基因，通過RT-PCR對這些基因從種子萌發(fā)到幼苗發(fā)育過程中的表達趨勢進行動態(tài)分析，引物列表見表1。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組測序FPKM值與RT-PCR基因相對表達量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)普遍大于0.8，且所選的10個基因在幼苗發(fā)育的第4天時，兩種方法下表達趨勢一致（圖6）。

3 ?討 ?論

苗全苗壯是煙草高產(chǎn)高效栽培技術(shù)的基礎(chǔ)，但壯苗受到諸多因素制約，除種子質(zhì)量外，漂浮育苗期間的光環(huán)境亦影響煙苗素質(zhì)。楊興有等、劉國順等和鄒焱等研究表明，光照強度降低，煙苗高度增加，莖圍、葉片厚度、干物質(zhì)積累等均降低。李鵬志等和黃建等研究表明調(diào)光膜處理可以改變光質(zhì)，使煙苗生育進程均比普通膜處理提前，最終成苗期提前5 d。在自然環(huán)境下，光照是不斷變化的，常出現(xiàn)光環(huán)境與煙苗生長需求不協(xié)調(diào)的情況，在生產(chǎn)中易出現(xiàn)高腳苗、鐵稈苗和黃化苗等，嚴(yán)重影響烤煙生產(chǎn)。本研究比較了煙草幼苗在12 h光周期和持續(xù)黑暗下的表型動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)相比于12 h光周期環(huán)境，在持續(xù)黑暗環(huán)境下，煙草幼苗發(fā)育成了細(xì)長且黃化的高腳苗，不適宜的光環(huán)境嚴(yán)重阻礙了煙草幼苗的正常發(fā)育。

種子萌發(fā)始于靜止種子吸水膨脹，至胚根突破胚乳和種皮后露白而完成萌發(fā)。王素琴等研究表明光照對不同品種煙草種子發(fā)芽有顯著影響，而招啟柏等認(rèn)為光不是煙草種子萌發(fā)的必要條件。宋碧清等根據(jù)光照對煙草種子發(fā)芽的影響程度，將煙草品種分為光照敏感型、中等光敏型和光照不敏感型3種類型，對于光照不敏感種子，它們在黑暗與光照條件下的發(fā)芽率差異不大，但光照能加快這些種子的發(fā)芽進程。Dong等和王堯等研究發(fā)現(xiàn)新采收的煙草種子萌發(fā)普遍需光，而后熟完成后種子萌發(fā)的光依賴性喪失。本研究試驗材料為新鮮采收的種子，12?h光周期環(huán)境下煙草種子發(fā)芽率約為89.23%，顯著暗環(huán)境下的發(fā)芽率52.61%，黑暗條件顯著抑制了新鮮煙草種子的萌發(fā)，這說明未完成后熟的種子并不會喪失光依賴性。

種子萌發(fā)完成后，將進入幼苗發(fā)育階段，也就是農(nóng)民廣泛關(guān)注的“出苗”事件。在模式植物擬南芥中，光參與調(diào)控幼苗發(fā)育的相關(guān)研究已經(jīng)取得顯著進展，與光形態(tài)相比，暗形態(tài)下胚軸更長，且形成了一個特異性組織頂鉤。PIFs和COP1/SPAs促進暗形態(tài)發(fā)生；而PHYs和HY5促進光形態(tài)發(fā)生。煙草與擬南芥的發(fā)育模式類似，光抑制幼苗的下胚軸伸長，促進子葉展開、頂鉤消失。本研究發(fā)現(xiàn)，在黑暗環(huán)境中生長的幼苗，其面積和直徑顯著高于12小時光周期處理的幼苗。此外，這些幼苗的下胚軸長度也顯著更長，子葉面積顯著更大，但子葉曲率顯著小于12小時光周期處理的幼苗。而在轉(zhuǎn)錄水平上，本研究未篩選到擬南芥同源基因和類似的信號通路。Liu等通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析的方法也未篩選到參與煙草幼苗形態(tài)發(fā)育的光敏色素信號通路基因，今后需要通過遺傳學(xué)試驗進一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)光促進家族6個光捕獲蛋白編碼基因表達上調(diào)，而參與調(diào)控種子成熟脫水、休眠和早期胚胎發(fā)育的、、、等4個基因表達下調(diào)。這可能表示暗環(huán)境促進了煙草種子休眠，并且抑制了煙草幼苗的捕光過程。

關(guān)于萌發(fā)后的種子是否也進行微弱的光合作用，目前仍不清晰。大洋洲海藻種子發(fā)芽期間就存在光合作用，以增強后續(xù)葉子和根部的生長。擬南芥種子在萌發(fā)初期便進行強烈的光合作用，而抑制其光合作用對萌發(fā)進程是有害的。在煙草種子完成萌發(fā)后，參與光合作用和葉綠體發(fā)育的信號通路就已經(jīng)被激活，為苗期的光合作用做儲備。在本研究中，通過GO富集發(fā)現(xiàn)葉綠素代謝過程、代謝物和能量的前體形成、光合作用、色素合成、卟啉類化合物代謝等與光合作用相關(guān)生物學(xué)過程參與了煙草早期幼苗發(fā)育的調(diào)控。這說明煙草在幼苗期雖然光合面積很小，但光合作用、光系統(tǒng)、碳代謝基因在幼苗在光環(huán)境中的發(fā)育似乎仍起到重要的作用。

4 ?結(jié) ?論

光照是調(diào)控?zé)煵莘N子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的一個重要環(huán)境因子，本研究通過表型組學(xué)定量分析了光參與調(diào)控的煙草種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育的全過程，同時通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選出受光誘導(dǎo)表達的基因和信號通路，并通過qRT-PCR進驗證。研究發(fā)現(xiàn)，12?h光周期處理種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率較黑暗處理顯著提高。光照不影響種子的萌發(fā)表型，但對幼苗發(fā)育表型影響較大；光抑制胚軸伸長，但促進子葉開展。光促進光捕獲蛋白家族的6個基因和膜內(nèi)周蛋白、和?三個基因的表達，而抑制、、、、和和等11個基因的表達，這些基因的功能包括油脂代謝、調(diào)控種子休眠、光合作用、光系統(tǒng)的組裝和光系統(tǒng)的捕光等生物學(xué)過程。本研究解析了光調(diào)控?zé)煵莘N子萌發(fā)的分子機制，可為今后煙草耐寡照育種提供了理論依據(jù)。

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