劉世鋒，董文靜，楊 蘭,3，周佳麗，劉東波,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000）

糖尿病是一種以糖脂代謝紊亂為標(biāo)志的慢性內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病受遺傳及環(huán)境等因素綜合影響[1]。2 型糖尿病是糖尿病分類(lèi)中發(fā)病率最高、患病人數(shù)最多的一個(gè)分型，占糖尿病患病人群總數(shù)的90%以上[2]。持續(xù)的高血糖是糖尿病的主要特征，長(zhǎng)期的高血糖會(huì)引起心腦血管、腎、眼、足及神經(jīng)等病變，并引發(fā)酮癥酸中毒、乳酸性酸中毒等急性并發(fā)癥，甚至威脅生命[3-4]。2 型糖尿病患者中，組織細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗是機(jī)體發(fā)生高血糖的主要誘因，85%的2 型糖尿病患者存在明顯的胰島素抵抗，胰島素抵抗貫穿2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[5]。

肝臟作為糖脂代謝的中樞，在2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[6]。正常生理狀態(tài)下，肝臟處胰島素濃度足夠調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的糖代謝途徑，促進(jìn)肝臟細(xì)胞攝取葡萄糖、加速肝糖原的合成，維持血糖穩(wěn)態(tài)[7]；當(dāng)肝臟細(xì)胞對(duì)胰島素信號(hào)敏感性下降，肝臟發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，胞內(nèi)胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)受抑制，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT/PKB）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）磷酸化失活水平降低[8]，使依賴(lài)于FoxO1 的糖異生限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxy kinase，PEPCK）水平上調(diào)[9]，糖異生作用過(guò)度激活，造成高血糖。胰島素對(duì)肝臟細(xì)胞糖代謝調(diào)控能力減弱，肝臟細(xì)胞糖異生過(guò)度激活、糖原合成受阻、糖脂代謝紊亂。現(xiàn)有的肝臟胰島素抵抗靶向治療藥物主要通過(guò)影響肝臟細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖異生及糖酵解等方面來(lái)調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝，包括鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium-glucose cotransporter，SGLT）抑制劑、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）抑制劑、葡萄糖激酶（glucokinase，GK）激活劑、肝臟糖異生抑制劑等[10-12]。

靈芝（Ganoderma lucidumKarst）是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兩用真菌，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[13]。靈芝多糖（Ganoderma lucidumpolysaccharides，GLP）是靈芝的關(guān)鍵藥效成分之一，是其改善糖脂代謝的主要有效成分；靈芝多糖可通過(guò)提高胰島素敏感性[14]、調(diào)控葡萄糖代謝酶活性[15]、抑制胰島β細(xì)胞凋亡[16]等多途徑緩解胰島素抵抗，從而維持血糖的穩(wěn)定。體外模擬消化研究發(fā)現(xiàn)，大分子碳水化合物難以在人體消化酶系統(tǒng)的單獨(dú)加持下代謝為人體易吸收的寡糖或單糖[17]，其大多數(shù)都是在結(jié)腸部經(jīng)微生物菌群代謝酵解。微生物在代謝的過(guò)程中會(huì)生成一系列的代謝產(chǎn)物，如乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs）[18]；而乙酸、丙酸和丁酸則可以通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善機(jī)體生理功能[19-23]。在以往的研究中，多糖的菌群代謝產(chǎn)物已經(jīng)表現(xiàn)出了其絕佳的生物活性；Lin 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，亞麻籽多糖經(jīng)腸道微生物酵解的代謝產(chǎn)物能夠通過(guò)下調(diào)GLUT2、SGLT、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptorγ，PPARγ）和增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT-enhancerbinding proteins，C/EBP）的mRNA 及蛋白表達(dá)水平，改善機(jī)體糖脂代謝水平。而靈芝多糖經(jīng)腸道微生物代謝后的生物活性變化目前尚不可知。本試驗(yàn)使用HepG2 細(xì)胞構(gòu)建肝臟胰島素抵抗模型，并使用該模型來(lái)評(píng)價(jià)微生物酵解前后的靈芝多糖對(duì)肝臟胰島素抵抗的作用，系統(tǒng)深入地闡明其具體機(jī)制；以期為解釋靈芝多糖緩解2 型糖尿病的胰島素抵抗提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2 人肝癌細(xì)胞 由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)實(shí)驗(yàn)室提供；湘赤芝壹號(hào)子實(shí)體購(gòu)自長(zhǎng)沙九峰生物科技有限公司，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院劉東波教授鑒定為湘赤芝壹號(hào)G.lucidumXiangchizhi No.1 干燥子實(shí)體）；苯酚、濃硫酸、酒石鉀鈉、3,5 二硝基水楊酸、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、磷酸、鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；葡萄糖、熊果酸、牛血清白蛋白 綠葉生物科技有限公司；胰島素、地塞米松 Invitrogen；FBS Bioligical Industries，BI；DMEM 培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA、Pen Strep Gibco；DMSO、糖原合成試劑盒 Solarbio；CCK-8 試劑盒、考馬斯亮藍(lán) G-250、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（Beyotime）、葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；GAPDH（CST）、Recombinant mAb to IRS1 antibody（abcam，GR98847-22）、AKT Rabbit Polyclonal antibody（Proteintech,10176-2-AP）、Phospho-Akt（Ser473）Mouse Monoclonal antibody（Proteintech，66444-1-Ig）、GSK3βRabbit Polyclonal antibody（Proteintech，22104-1-AP）、Phospho-GSK3β（Ser389）Rabbit、Polyclonal antibody（Proteintech，14850-1-AP）、PEPCK（Proteintech）、GLUT2 Monoclonal antibody（Proteintech，66889-1-lg）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔 lgG（H+L）（Beyotime，A0208）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠 lgG（H+L）（Beyotime，A0192）、Immobilon Western HRP 底物 默克生物科技有限公司。

SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵、LC-RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海保玲儀器設(shè)備有限公司；ST-16R 高速冷凍離心機(jī)、A2 超凈工作臺(tái)、IBright FL1500 多色熒光成像系統(tǒng) Thermo Fisher Scientific；ME54E/02電子天平、XS205 專(zhuān)業(yè)型分析天平 Mettler-Toledo公司；3503-2 無(wú)菌培養(yǎng)箱 美國(guó)Shel-lab；AE2000光學(xué)顯微鏡 Motic 公司；Spark 多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；S210 pH 計(jì) Mettler Toledo；BV-3 蛋白垂直電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖提取純化 GLP 提取參考文獻(xiàn)[18]，以2 kg 湘赤芝壹號(hào)子實(shí)體為原料，以1:10 的料液比100 ℃蒸餾水浸提1 h，重復(fù)3 次并真空抽濾，濾液合并，55 ℃減壓濃縮為原體積的五分之一；加入乙醇至終濃度為75%，4 ℃過(guò)夜，高速離心機(jī)7500 r/min離心20 min 獲得多糖沉淀物；所得沉淀使用少量蒸餾水溶解，采用Sevage 法脫蛋白；將脫蛋白多糖溶液置于透析袋（3500 Da）中透析過(guò)夜以去除小分子物質(zhì)；將獲得的多糖溶液55 ℃減壓濃縮并冷凍干燥獲得靈芝多糖樣品。前期研究發(fā)現(xiàn)，該靈芝多糖的平均分子量為133.1 kDa，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、焦糖、木糖、葡萄糖胺和葡萄糖醛酸組成，摩爾比為58.97:17.54:8.63:2.79:2.02:1.13:6.77[18]。

1.2.2 靈芝多糖體外模擬結(jié)腸酵解 靈芝多糖腸道菌群代謝物（Ganoderma lucidumpolysaccharide flora metabolite，GLP-F）由所提取靈芝多糖經(jīng)過(guò)體外模擬結(jié)腸厭氧發(fā)酵獲得；具體過(guò)程參考Liu 等[21]的方法進(jìn)行，分別取3 名3 月內(nèi)沒(méi)有服用任何抗生素的健康志愿者新鮮糞便12.5 g 于250 mL PBS 中勻漿、離心取上清。將靈芝多糖溶液和配制好的酵解培養(yǎng)基與菌液以5 g:250 mL:250 mL 的比例混勻，在Forma 厭氧系統(tǒng)中進(jìn)行體外模擬酵解，48 h 停止酵解，迅速采集樣品，以0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾過(guò)液-80 ℃冷凍保存，用于后續(xù)機(jī)制研究。

1.2.3 靈芝多糖及酵解產(chǎn)物主要理化表征測(cè)定 主要理化表征包括多糖、還原糖、三萜及蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。總糖含量采用苯酚-硫酸法[25]進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，于490 nm 處測(cè)定吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=5.1417x+0.0036，R2=0.9977。二硝基水楊酸法[26]測(cè)定還原糖含量，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，于540 nm處測(cè)定吸光值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=6.7698x-00143，R2=0.9962。香草醛-熊果酸-高氯酸法[27]測(cè)定三萜含量，以熊果酸質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，于542 nm 處測(cè)定吸光值，繪制熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=3.5463x-0.015，R2=0.9945?？捡R斯亮藍(lán)法[28]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，于595 nm 處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=2.7847x+0.0038，R2=0.9991。

1.2.4 GLP 和GLP-F 對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性與增殖的影響測(cè)定 將HepG2 細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL 濃度接種于96 孔板中，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后移除上清液換用無(wú)血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基饑餓處理12 h，饑餓完成后隨機(jī)分為對(duì)照組（Control，CON）、模型組（Model，M）、GLP 組和GLP-F 組；將CON組培養(yǎng)基換成DMEM 完全培養(yǎng)基，M 組及GLP 和GLP-F 組培養(yǎng)基置換成含Ins+Dex（Insulin+Dexamethasone）（10-3+10）μmol/L 的DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h[29]；誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞成為IR-HepG2細(xì)胞后，吸取上清，100 μL PBS 緩沖溶液清洗2 次。CON 組和M 組分別加入100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，GLP 和GLP-F 組分別加入100 μL含250、500、750、1000 μg/mL GLP 和GLP-F、以及50、100、200、400 μg/mL GLP 和GLP-F 的DMEM完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h。24 h 后，吸取細(xì)胞上清液，各孔加100 μL 10% CCK-8 檢測(cè)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)吸光值，計(jì)算各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況[30]，考察不同濃度靈芝多糖及其菌群代謝物對(duì)細(xì)胞毒性與增殖的影響。

1.2.5 GLP 和GLP-F 對(duì)HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響測(cè)定 依據(jù)1.2.4 得出GLP 和GLP-F 干預(yù)IRHepG2 細(xì)胞作用濃度范圍，設(shè)定適宜濃度梯度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。CON 組和M 組分別加100 μL DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，GLP 和GLP-F 組分別加入100 μL 含0、50、100、200、400 μg/mL GLP 和GLP-F 的DMEM 完全培養(yǎng)基干預(yù)24 h，依據(jù)分組吸取上清至離心管，按照葡萄糖氧化酶法檢測(cè)試劑盒詳細(xì)步驟操作，37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)10 min 后，酶標(biāo)儀505 nm 處檢測(cè)吸光值，計(jì)算葡萄糖消耗量[31]。

1.2.6 GLP 和GLP-F 對(duì)HepG2 細(xì)胞糖原含量的影響測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/mL，接種于6 孔板中，每孔2 mL，進(jìn)行胰島素抵抗模型的建立、給藥干預(yù)方法同1.2.4。干預(yù)24 h 后，移除舊培養(yǎng)基，PBS 重復(fù)清洗2～3 次，每孔加入適量胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞微微變圓，吸去胰酶，加入1 mL PBS 緩沖液重懸，將細(xì)胞懸液移至1.5 mL 離心管，以1000 r/min，離心15 min，棄上清液，加入300 μL PBS 緩沖液，混勻并進(jìn)行勻漿。加入0.75 mL 糖原提取液，冰水浴條件下超聲破碎（300 W，3～5 s/次，間隙10 s，重復(fù)30 次），使細(xì)胞充分破碎，取超聲破碎后的細(xì)胞懸液按照BCA 總蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白含量。其余部分采用糖原測(cè)定試劑盒檢測(cè)糖原合成量。

1.2.7 Western blot 蛋白免疫印跡檢測(cè)胰島素信號(hào)通路蛋白表達(dá) 生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞消化鋪板至6 孔板，胰島素抵抗模型構(gòu)建與藥物干預(yù)方法同1.2.4。干預(yù)完成后，每孔加入100 μL 2% SDS 裂解液，槍頭順時(shí)針攪動(dòng)提取各組細(xì)胞總蛋白；取部分樣品利用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確定蛋白免疫印跡上樣量；其余部分加入5×上樣緩沖液95 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性，作為蛋白免疫印跡檢測(cè)供試樣品。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)IRS-1、P-AKT/AKT、P-GS3Kβ/GS3Kβ、PEPCK、GLUT2 的蛋白表達(dá)量[32]。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。棄去殘液，清洗后對(duì)應(yīng)加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔/抗小鼠二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL 于化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光顯影。Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。采用單因素方差分析（ANOVA）評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以確定每組之間的顯著差異。P＜0.05 被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖的得率及GLP 和GLP-F 物質(zhì)組分差異

2 kg 靈芝子實(shí)體經(jīng)提取純化等流程后，共獲得17.138 g 靈芝多糖，得率為0.8569%；GLP 和GLP-F物質(zhì)組分差異如表1 所示，靈芝多糖樣品（GLP）中總糖含量為64.84%±1.96%，還原糖含量為6.14%±0.004%，三萜含量為0.53%±0.02%，蛋白含量為5.51%±0.04%。靈芝多糖經(jīng)菌群代謝所生成產(chǎn)物中總糖含量下降至15.48%±0.03%（P＜0.01）；還原糖含量降低為1.43%±0.03%（P＜0.01），三萜含量為0.55%±0.03%，蛋白含量為5.56%±0.26%。

表1 GLP 和GLP-F 基本組成成分分析（n=3）Table 1 Basic component analysis of GLP and GLP-F (n=3)

2.2 GLP 和GLP-F 對(duì)細(xì)胞活力的影響

本實(shí)驗(yàn)使用胰島素+地塞米松（Ins+Dex（10-3+10）μmol/L）誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型（IR-HepG2），并在此模型基礎(chǔ)上研究GLP 和GLP-F 對(duì)胰島素抵抗模型的作用。如圖1 所示，Ins+Dex（10-3+10）μmol/L 不影響細(xì)胞活力；但隨著GLP和GLP-F 的濃度升高（500～1000 μg/mL）HepG2 細(xì)胞活力逐漸降低，當(dāng)GLP 和GLP-F 濃度分別為（GLP 500、750、1000 μg/mL；GLP-F 500、750、1000 μg/mL）時(shí)，細(xì)胞活力與CON 組以及M 組相比顯著下降（P＜0.05）；隨后，測(cè)試了GLP 和GLP-F（50～400）μg/mL對(duì)細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)（50～400）μg/mL 的GLP 與GLP-F 均未顯著影響細(xì)胞活力（P＞0.05）。

圖1 GLP 和GLP-F 對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響（n=3）Fig.1 The effect of GLP and GLP-F on the viability of HepG2 cells (n=3)

2.3 GLP 和GLP-F 對(duì)葡萄糖消耗量的影響

分別使用不同質(zhì)量濃度（50、100、200、400 μg/mL）的GLP 和GLP-F 干預(yù)Ins+Dex（10-3+10）μmol/L 處理后的IR-HepG2 細(xì)胞。如圖2 所示，IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)GLP 和GLP-F處理后，IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著上升（P＜0.05）；GLP 和GLP-F 組細(xì)胞均在400 μg/mL 有最大葡萄糖消耗量（15.80±2.15、17.66±1.28 mmol/L），且GLP-F 組顯著高于GLP 組（P＜0.05）。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感度降低，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受限，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量降低；（100～400 μg/mL）的GLP-F 促進(jìn)葡萄糖消耗顯著優(yōu)于同濃度的GLP，GLP 的微生物發(fā)酵促進(jìn)了其改善胰島素抵抗的功能。

圖2 GLP 和GLP-F 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（n=6）Fig.2 The effect of GLP and GLP-F on glucose consumption of IR-HepG2 cells (n=6)

2.4 GLP 和GLP-F 對(duì)糖原合成的影響

肝糖原是肝臟細(xì)胞儲(chǔ)存葡萄糖的主要形式，其合成水平受胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控，當(dāng)人體細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)，糖原合成受抑制，糖原合成量降低。結(jié)果如圖3 所示，IR-HepG2 細(xì)胞糖原合成量顯著低于CON 組（P＜0.05）；經(jīng)不同質(zhì)量濃度的GLP 和GLP-F處理后，IR-HepG2 細(xì)胞糖原合成水平顯著恢復(fù)（P＜0.05），且GLP 和GLP-F（200、400 μg/mL）處理組糖原合成水平顯著高于CON 組（P＜0.05），GLP 和GLP-F均表現(xiàn)出高濃度（200、400 μg/mL）促進(jìn)肝細(xì)胞糖原合成的作用。

圖3 GLP 和GLP-F 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞糖原合成的影響（n=3）Fig.3 The effect of GLP and GLP-F on glycogen synthesis of IR-HepG2 cells (n=3)

2.5 GLP 和GLP-F 對(duì)胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)關(guān)鍵蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖4），與CON 組相比，Ins+Dex 處理后的IR-HepG2 細(xì)胞IRS-1 表達(dá)量極顯著降低了36.715%（P＜0.01）、P-AKT/AKT 極顯著降低了44.62%（P＜0.01）、PEPCK 極顯著升高了23.60%（P＜0.01）、P-GSK-3β/GSK-3β及GLUT2 分別極顯著降低了23.90%、37.07%（P＜0.01）；經(jīng)GLP 和GLP-F 400 μg/mL 干預(yù)后，其蛋白水平與模型組相比，IRS-1、PAKT/AKT、PEPCK、P-GSK-3β/GSK-3β、GLUT2 水平分別改變了（+31.58%、+31.81%）、（+125.09%、+148.88%）、（-31.83%、-51.59%）、（+59.40%、+80.71%）、（+40.04%、+43.54%），經(jīng)過(guò)干預(yù)后這些蛋白的水平與M 組相比均具有顯著性差異（P＜0.01）；其中，GLP-F 對(duì)糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK 的蛋白表達(dá)水平抑制極顯著高于GLP（P＜0.01）；GLP 經(jīng)微生物代謝后的產(chǎn)物GLP-F 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞糖異生途徑的抑制作用強(qiáng)于GLP，GLP-F 對(duì)緩解肝臟細(xì)胞胰島素抵抗具有比GLP 更強(qiáng)的效用。

圖4 GLP 和GLP-F 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)的影響（n=3）Fig.4 Effect of GLP and GLP-F on insulin signaling cascade of IR-HepG2 cells (n=3)

3 討論

肝臟作為胰島素的主要靶器官，是調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的重要中樞[33]；當(dāng)肝臟細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性信號(hào)的刺激，胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)出現(xiàn)異常，胰島素不能正常調(diào)節(jié)其糖原合成、糖異生等糖脂代謝途徑，引發(fā)肝臟胰島素抵抗[34-35]。使用胰島素+地塞米松（Ins+Dex（10-3+10）μmol/L）誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞24 h 后，HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量以及糖原合成量顯著降低（P＜0.05），表現(xiàn)出了明顯的胰島素抵抗表型（IR-HepG2）。而GLP 和GLP-F 以劑量依賴(lài)的形式恢復(fù)了Ins+Dex 對(duì)HepG2 細(xì)胞造成的葡萄糖消耗和糖原合成的抑制（圖2、圖3），GLP 和GLP-F表現(xiàn)出了顯著的緩解胰島素抵抗的效用。在以往的研究中，GLP 也表現(xiàn)出了緩解胰島素抵抗的活性[9,36-37]；Shao 等[36]在高脂飲食（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GLP 能夠降低糖尿病小鼠的血糖水平、促進(jìn)肝糖原合成和儲(chǔ)存、修復(fù)胰島細(xì)胞并增加胰島素分泌，緩解胰島素抵抗。此外，本研究發(fā)現(xiàn)50～400 μg/mL 的GLP-F 促進(jìn)IR-HepG2葡萄糖消耗的能力比同等濃度的GLP 更加顯著（P＜0.05）。這表明，腸道微生物的代謝使得GLP 發(fā)揮出了更強(qiáng)的恢復(fù)細(xì)胞糖代謝穩(wěn)態(tài)的生物活性。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，GLP 經(jīng)體外模擬結(jié)腸發(fā)酵48 h 后，碳水化合物含量顯著下降；其中，GLP 中總糖含量從64.84%±1.96%降低至15.48%±0.03%（P＜0.01），還原糖含量從6.14%±0.004%降低至1.43%±0.03%（P＜0.01）（表1），這表明GLP 可以被腸道菌群作為能量源所代謝利用[38]。本課題組前期研究表明GLP 可以富集腸道中降解和發(fā)酵多糖的優(yōu)勢(shì)菌種，擬桿菌屬（Bacteroides）的水平[18]；發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs 水平顯著升高[18]。鄧邦利[39]的研究表明，乙酸、丙酸、丁酸均能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達(dá)，并促進(jìn)其進(jìn)行膜轉(zhuǎn)位，提高細(xì)胞攝取葡萄糖的能力。在肥胖和T2DM 動(dòng)物模型中口服和靜脈注射乙酸鹽[40-42]、丁酸鹽[43]和丙酸鹽[43]可以通過(guò)增加肝臟AMPK 磷酸化和脂肪酸氧化、糖原儲(chǔ)存、產(chǎn)熱、糖異生通路相關(guān)靶基因，減少肝臟脂質(zhì)積累并改善葡萄糖耐量。此外，用產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌治療大鼠可以預(yù)防飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的進(jìn)展，并改善胰島素抵抗[44]。由此推測(cè)，GLP-F 更強(qiáng)的糖代謝恢復(fù)能力可能是由GLP 經(jīng)腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs 所介導(dǎo)的。

GLP 和GLP-F 可以通過(guò)上調(diào)IRS-1 的表達(dá)水平從而促進(jìn)AKT 的磷酸化，P-AKT 通過(guò)調(diào)節(jié)下游效應(yīng)蛋白GSK3β的磷酸化、降低PEPCK 的表達(dá)以及促進(jìn)GLUT2 的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞糖原合成、抑制糖異生水平以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解肝細(xì)胞胰島素抵抗（圖4）。這與在動(dòng)物水平上的研究結(jié)果相似；Liu等[45]研究發(fā)現(xiàn)，GLP 能通過(guò)上調(diào)肝臟及肌肉組織中AKT 的磷酸化水平，以及糖異生關(guān)鍵限速酶糖原合酶（glycogen synthase，GS）和GLUT4 的表達(dá)水平，改善HFD 和STZ 誘導(dǎo)的T2DM 大鼠機(jī)體胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)；另外，在Xiao 等[46]的研究中，發(fā)現(xiàn)GLP 能夠下調(diào)db/db 小鼠肝臟中糖異生限速酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）和PEPCK 的mRNA 及蛋白水平，并上調(diào)了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2 的蛋白水平及mRNA 水平。而在本文的研究中發(fā)現(xiàn)，GLP 與GLP-F對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞中糖異生限速酶PEPCK 的抑制效果存在顯著的差異，與GLP 組相比，GLP-F 組對(duì)PEPCK 的抑制效用更強(qiáng)（P＜0.01）。這種效應(yīng)似乎是由GLP-F 中存在的SCFAs 所導(dǎo)致的，GLP-F 中含有較多的乙酸[18]，而有研究表明，乙酸可以通過(guò)增加AMP/ATP 的比例直接激活A(yù)MPK，而在肝臟細(xì)胞中，AMPK 的激活降低了糖異生關(guān)鍵限速酶葡萄糖6-磷酸酶（G6Pase）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）的表達(dá)[41]。本文證明了GLP 以及其在經(jīng)過(guò)腸道微生物的代謝后的產(chǎn)物GLP-F 對(duì)IR-HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的緩解作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的GLP 在促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖消耗以及抑制其糖異生通路具有更強(qiáng)的活性，這可能與發(fā)酵后產(chǎn)生的SCFAs有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究探討了腸道菌群在介導(dǎo)靈芝多糖（GLP）發(fā)揮藥理活性中的潛在影響。利用HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型發(fā)現(xiàn)GLP-F 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成以及糖異生通路來(lái)緩解肝臟胰島素抵抗；與GLP 相比，GLP-F 在促進(jìn)其葡萄糖消耗、抑制其糖異生通路上具有更強(qiáng)的生物學(xué)效用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸道菌群促進(jìn)了GLP 緩解胰島素抵抗的活性。本研究旨在為腸道菌群介導(dǎo)的靈芝多糖緩解肝臟胰島素抵抗提供理論依據(jù)，為靈芝大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。