滿其榮 趙甜甜 段超 李苓

1濟寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院腫瘤科，滕州 277500；2濟寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院病理科，滕州 277500

2022 年全球癌癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，乳腺癌已超過肺癌成為全球發(fā)病率第一的癌癥，其中人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）陽性型乳腺癌患者占總數(shù)的15%～20%，這種類型的乳腺癌常常分化較差，腫瘤惡性程度高，侵襲性強，患者預(yù)后差［1］。但隨著抗HER2 靶向藥物的出現(xiàn)和使用，此類型患者反倒成為治療療效最好的一類。然而只有50%～80%的患者能夠獲益于靶向藥物的使用，20%～50%的患者會有對靶向藥物不敏感的情況或使用后耐藥導(dǎo)致病情進(jìn)展，此時患者可以使用的治療方案已較少。如果在治療之前能有評價治療效果的指標(biāo)或發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，能給這種類型的患者帶來新的生存希望。在2011 年圣加倫（St.Gallen）國際乳腺癌會議上，有專家提出抗HER2 靶向治療效果與機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）是指腫瘤間質(zhì)中的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞，包括T細(xì)胞及自然殺傷（NK）細(xì)胞等。在多數(shù)實體腫瘤中都有研究，如乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和肺癌等［2］。TILs 的主要功能是在腫瘤局部免疫反應(yīng)中抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。有臨床研究表明，TILs 在HER2 陽性型乳腺癌中含量越高，患者預(yù)后越好，但患者使用曲妥珠單抗治療后TILs含量與預(yù)后的相關(guān)性消失［3］。另有研究報道，當(dāng)乳腺癌TILs含量≥60% 時稱作淋巴細(xì)胞優(yōu)勢的乳腺癌（lymphocyte predominant breast cancer，LPBC），LPBC 患者與非LPBC 患者相比，無論是接受新輔助化療還是靶向治療，在治療后更容易發(fā)生病理完全緩解［4］。盡管眾多研究已經(jīng)明確TILs 在判斷乳腺癌患者預(yù)后方面的作用，但仍存在不同的結(jié)果。因此，本文將對TILs 在HER2 陽性型乳腺癌中表達(dá)的臨床病理意義進(jìn)行進(jìn)一步研究。

材料與方法

1.一般材料

收集2016年10月至2018年10月期間滕州市中心人民醫(yī)院收治的HER2 陽性型乳腺癌患者94 例，本研究使用乳腺癌患者的石蠟標(biāo)本做相關(guān)檢測。其中，49 例患者接受曲妥珠單抗靶向治療和化療，45例患者僅接受化療；所有患者均為女性，中位年齡51 歲（32～73 歲）。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）組織學(xué)蠟塊經(jīng)免疫組織化學(xué)方法檢測HER2 的結(jié)果為+++，或者經(jīng)熒光原位雜交方法檢測HER2 的結(jié)果為陽性；（2）術(shù)后常規(guī)病理結(jié)果為乳腺非特殊型浸潤性癌；（3）女性原發(fā)性單側(cè)乳腺癌；（4）臨床病理資料完整，同時有明確的腫瘤臨床分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前曾接受過放化療；（2）有嚴(yán)重的全身性疾?。唬?）就診時已經(jīng)發(fā)生癌轉(zhuǎn)移。

2.TILs結(jié)果判定

由兩名高年資病理主治醫(yī)師共同判定。根據(jù)TILs國際工作組推薦的乳腺癌TILs 組織學(xué)評判標(biāo)準(zhǔn)，首先在4×目鏡下觀察腫瘤細(xì)胞和TILs 的大致分布；然后在10×目鏡下每個標(biāo)本選擇3 個區(qū)域，標(biāo)準(zhǔn)是有腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)和TILs，并且沒有明顯的非特異性染色和大面積的組織缺失。當(dāng)TILs分布有異質(zhì)性時，要避免選擇過多或過少的區(qū)域；最后在20×目鏡下評分癌巢和腫瘤基質(zhì)中的TILs。癌巢中TILs 的表達(dá)值為計數(shù)選擇區(qū)域中TILs 的數(shù)量和腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，最后計算值為TILs 數(shù)量比腫瘤細(xì)胞的比值；腫瘤基質(zhì)中TILs 的表達(dá)值通過評估淋巴細(xì)胞占腫瘤基質(zhì)區(qū)域的比例；最后結(jié)果為多個區(qū)域計算的平均值為該樣本的表達(dá)值。最后以輕度（TILs：0～10%）、中度（TILs：＞10%～40%）、重度（TILs：＞40%～90%）浸潤表述，由于本研究樣本數(shù)少，且輕度和中度有相似的生存趨勢，因此將輕度和中度歸為一個輕度組。

3.病例隨訪

采用電話、門診和住院的方式隨訪患者的無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS），即從確診為惡性腫瘤首次治療到首次復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間（包括病理學(xué)確診及影像學(xué)提示的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。隨訪截止時間為2022 年10 月，隨訪時間4～71個月，中位隨訪時間是48個月。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計比較。采用Excel 2019建立數(shù)據(jù)庫；使用χ2檢驗對分類資料進(jìn)行統(tǒng)計分析；使用Kaplan-Meier 生存曲線和Cox 回歸法對預(yù)后相關(guān)指標(biāo)行單因素和多因素分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.TILs 浸潤程度與HER2 陽性型乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

94例HER2陽性型乳腺癌患者，61例呈輕度浸潤，33例呈重度浸潤。本文統(tǒng)計了包括年齡、組織學(xué)分級、P53、Ki-67、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、TNM 分期在內(nèi)的7 項與預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果得出：TILs 浸潤程度與各臨床病理參數(shù)均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

表1 TILs與HER2陽性型乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.TILs浸潤程度與HER2陽性型乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier 生存曲線和Cox 比例風(fēng)險回歸模型對HER2 陽性型乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行單因素和多因素分析。94 例患者中，49 例接受曲妥珠單抗靶向治療和化療為靶向治療組，45例僅接受化療為普通化療組；對兩組患者分別做預(yù)后相關(guān)分析。靶向治療組：32例呈輕度浸潤，17 例呈重度浸潤。Kaplan-Meier 分析結(jié)果得出，TILs 重度浸潤患者RFS 長于TILs 輕度浸潤者（P=0.036，圖1）；Cox 回歸分析結(jié)果得出，TNM 分期和TILs 浸潤程度均是HER2 陽性型乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素（P=0.003、P=0.029，表2）。普通化療組：29 例呈輕度浸潤，16 例呈重度浸潤。Kaplan-Meier 分析結(jié)果得出，與TILs 輕度浸潤患者相比，TILs 重度浸潤患者的RFS 更長（P=0.049，圖2）；Cox 回歸分析結(jié)果得出，TNM 分期和TILs 浸潤程度均是患者預(yù)后相關(guān)的獨立因素（P=0.001、P=0.028，表3）。

圖1 49 例行靶向治療的HER2 陽性型乳腺癌患者TILs浸潤程度與RFS關(guān)系

圖2 45 例行普通化療的HER2 陽性型乳腺癌患者TILs浸潤程度與RFS關(guān)系

表2 49例行靶向治療的HER2陽性型乳腺癌患者RFS單因素和多因素分析

表3 45例行普通化療的HER2陽性型乳腺癌患者RFS單因素和多因素分析

討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，根據(jù)病理指標(biāo)ER、PR、HER2、Ki-67 的表達(dá)狀態(tài)，乳腺癌分為4 種分子分型：Luminal A、Luminal B、三陰性和HER2 陽性。針對HER2 陽性型乳腺癌患者，與傳統(tǒng)化療相比，靶向藥物的使用不僅毒副反應(yīng)小，而且能夠明顯提高患者的病理完全緩解率，延長患者的無病生存期和總生存期［5］。但其原發(fā)和繼發(fā)耐藥現(xiàn)象一直困擾著醫(yī)生和患者，耐藥機制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)耐藥與機體免疫相關(guān)［6］。在乳腺癌分子亞型中，三陰性乳腺癌免疫原性最強，腫瘤間質(zhì)中TILs比例更高，關(guān)于TILs的研究目前大多數(shù)是這種類型；其次是HER2 陽性型乳腺癌，研究較少并且還沒有得出一致性結(jié)論［7］。在一項回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤中表達(dá)高比例的TILs 時通常腫瘤有更強的侵襲性，且患者對化療也更敏感［8］。免疫系統(tǒng)在抑制腫瘤細(xì)胞生長繁殖的過程中發(fā)揮重要作用，因此TILs 是乳腺癌一個非常重要的預(yù)后指標(biāo)和預(yù)測治療效果的指標(biāo)。

既往有較多關(guān)于TILs浸潤程度與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系的研究，但尚無一致性結(jié)論。在4 種乳腺癌分子分型中，TILs 比例在三陰性乳腺癌中最高，且與組織學(xué)分級有關(guān)，腫瘤分級越高，TILs 比例越高［9］。陳翱翔等［10］的研究發(fā)現(xiàn)TILs 比例與激素受體狀態(tài)明顯相關(guān)，激素受體陰性乳腺癌的TILs 比例明顯高于激素受體陽性，與其余臨床病理特征無明顯相關(guān)性。侯欣喜等［11］的研究結(jié)果顯示，TILs 與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織學(xué)分級密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，TILs 浸潤程度與各臨床病理參數(shù)均無明顯相關(guān)性。推測上述研究結(jié)果不一致的原因可能是TILs 比例界定不同，本研究以2014 年TILs 國際工作組推薦的乳腺癌TILs 組織學(xué)評判標(biāo)準(zhǔn)［12］，以輕度（TILs：0～10%）、中度（TILs：＞10%～40%）、重度（TILs：＞40%～90%）浸潤表述，由于病例樣本數(shù)少，且輕度和中度有相似的生存趨勢，因此將輕度和中度歸為一個輕度組。

在過去十年里，包括臨床試驗在內(nèi)的幾項研究評估了TILs 與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性。楊月等［13］研究結(jié)果得出CD8在腫瘤間質(zhì)和瘤內(nèi)TILs中的表達(dá)與患者的無瘤生存期顯著相關(guān)。Loi等［14］研究發(fā)現(xiàn)，患者治療方式為曲妥珠單抗靶向治療加化療時，其TILs 浸潤量越高，臨床獲益越大；同時TILs 量每增加10%，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險會減少10%。Gelber 等［15］研究中，帕妥珠單抗聯(lián)合輔助化療加曲妥珠單抗治療時，TILs 數(shù)量越多，患者預(yù)后越好。Perez 等［16］研究中，患者僅接受化療而不用靶向治療時，TILs重度浸潤患者無病生存期明顯長于TILs輕度浸潤者。本研究依據(jù)患者是否接受靶向治療，分為曲妥珠單抗加化療的靶向治療組和僅接受化療的普通化療組，兩組的統(tǒng)計結(jié)果都顯示TILs 重度浸潤患者RFS 長于TILs 輕度浸潤者，與上述臨床研究結(jié)果相一致。

與上述結(jié)果不同的是，Kim 等［17］試驗結(jié)果顯示，無論是曲妥珠單抗加化療的靶向治療組，或僅接受化療的普通化療組，患者的無病生存期與TILs 浸潤程度無明顯相關(guān)性。Dieci 等［18］研究中，對比了曲妥珠單抗聯(lián)合化療治療9 周和1 年的TILs 表達(dá)影響差異，發(fā)現(xiàn)靶向治療時間9 周時，TILs數(shù)量每增加10%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險明顯降低；靶向治療時間1年時，TILs數(shù)量每減少20%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險明顯降低。

對于靶向藥物耐藥或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者來說，TILs 可作為免疫治療靶點，藥物通過作用于TILs 來識別和攻擊癌癥細(xì)胞，目前已經(jīng)取得了明顯成效。在Loi等［19］研究中，對曲妥珠單抗耐藥的HER2 陽性乳腺癌患者給予培美布魯珠單抗聯(lián)合曲妥珠單抗治療，當(dāng)腫瘤PD-L1 表達(dá)陽性時患者有很好的臨床治療效果，且PD-L1 陽性的腫瘤TILs水平升高。與上述研究結(jié)果不同的是，在Emens 等［20］研究中，阿替利珠單抗聯(lián)合恩美曲妥珠單抗治療晚期HER2 陽性乳腺癌癥并沒有顯示無進(jìn)展生存期的增加，而且有更多的不良事件。推測原因為TILs 包括CD8+和CD4+效應(yīng)T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，不僅是淋巴細(xì)胞浸潤的數(shù)量，而且淋巴細(xì)胞種類也影響臨床治療效果和預(yù)后。

綜上所述，在HER2 陽性型乳腺癌中，評估TILs 的表達(dá)情況逐漸成為抗HER2 治療的預(yù)測療效和預(yù)后生物標(biāo)志物，并有可能成為腫瘤新的治療靶點，但還需要做進(jìn)一步研究以明確。

作者貢獻(xiàn)聲明滿其榮：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析∕解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計分析；趙甜甜、段超：實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析∕解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析，獲取研究經(jīng)費，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；李苓：醞釀和設(shè)計試驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)