康霄文 杜曉華 王東偉 程菊娥 王忠勇 孫書娥 蘇品 劉勇

摘 要：研究基于沼澤紅假單胞菌PSB-06促生和增強(qiáng)寄主抗病性，蘇云金芽孢桿菌KY-1抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得這2種菌株的融合菌株，測定了融合菌株對生姜根結(jié)線蟲的防治效果，以期得到綜合親本優(yōu)良性狀的新型高效生防菌株。結(jié)果表明：融合菌株顯著降低了土壤根結(jié)線蟲的數(shù)量，收獲期相對防效達(dá)73.68%；融合菌株處理顯著提高了生姜的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質(zhì)，單株姜球數(shù)（13.80個(gè)）、姜球?qū)挾龋?3.47 cm）和單株產(chǎn)量（1.29 kg）均優(yōu)于空白對照；同時(shí)提高了生姜收獲期葉片的總?cè)~綠素含量、POD和SOD活性。綜合來看，沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌融合菌株的促生及生防潛力較親本沼澤紅假單胞菌有所提高，為微生物菌種改良提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：沼澤紅假單胞菌；蘇云金芽孢桿菌；原生質(zhì)體融合；生姜；根結(jié)線蟲

中圖分類號：Q813.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2023）10-0043-07

Constructing a Distant Protoplast Fusion Strain of Rhodopseudomonas palustris and Bacillus thuringiensis to Biocontrol? Ginger Root-Knot Nematodes

KANG Xiao-wen1， DU Xiao-hua2， WANG Dong-wei2， CHENG Ju-e2， WANG Zhong-yong2， SUN Shu-e2， SU Pin2， LIU Yong2

（1. Asset Management Center of Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 2. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract：Microbial protoplast fusion breeding is an important direction of microbial strain improvement. Based on the advantages of Rhodopseudomonas palustris PSB-06 for promoting growth and enhancing host resistance， and strong stress resistance of Bacillus thuringiensis KY-1， their fusion strain was obtained by protoplast fusion technology， whose control effect on ginger root-knot nematode disease was tested. The results showed that the fusion strain treatment significantly reduced the number of soil root-knot nematodes， and the disease control effect reached 73.68% in the harvest period. Meanwhile， it significantly improved agronomic traits， yield and quality of ginger; the number of ginger bulb per plant （13.80）， ginger bulb width （33.47 cm） and the yield per plant （1.29 kg） all surpassed the blank control; at the same time， the total chlorophyll content， and POD and SOD activities of ginger in the harvest period were increased. In conclusion， the fusion strain of Rhodopseudomonas palustris and Bacillus thuringiensis has produced much stronger growth promotion and biocontrol effects than the parent strain PSB-06， which may provide theoretical and practical support for the improvement of microbial strains.

Key words：Rhodopseudomonas palustris; Bacillus thuringiensis; protoplast fusion; ginger; root-knot nematode

收稿日期：2023–08–06

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金青年基金（2022JJ40234）；雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究項(xiàng)目（2023MS03）；湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金（2023CX18；2022CX1；2022CX84-18）；長沙市自然科學(xué)基金（kq2202338）

作者簡介：康霄文（1964—），男，湖南漣源市人，副研究員，主要從事植物病害研究、科技產(chǎn)品推廣、科技服務(wù)和資產(chǎn)管理等工作。并列第一作者：杜曉華。

通信作者：蘇 品，劉 勇

近年來，隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展和供給的結(jié)構(gòu)性調(diào)整，微生物農(nóng)藥因其廣譜、高效、安全、環(huán)境相容性好等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，其研究和應(yīng)用已成為植物病蟲害綜合治理的重要手段，同時(shí)也是保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有力保證[1]。

目前，常用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥有蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、綠色哈茨木霉菌和光合細(xì)菌等，主要用于防治作物病害、蟲害以及促進(jìn)作物生長等[2]。其中，芽孢桿菌是好氧或兼性厭氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌的總稱，其生理特征明顯，分布廣泛，是土壤和植物體表或根際的重要微生物種群。芽孢桿菌由于能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，其在環(huán)境中的存活率、定殖率均較高，便于生產(chǎn)和加工成生防菌劑。田間應(yīng)用研究已經(jīng)證實(shí)，芽孢桿菌生防菌劑在穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性以及在不同植物不同時(shí)間防效的一致性等方面表現(xiàn)優(yōu)異。同時(shí)，芽孢桿菌作為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢微生物種群之一，具有很強(qiáng)的拮抗作用和抗逆能力，是植物病害生防微生物的重要組成部分[3-4]。光合細(xì)菌是能利用細(xì)菌葉綠素進(jìn)行光合自養(yǎng)型生長的一類微生物總稱，也是植物表面與土壤微生物群落的一個(gè)重要組成部分。光合細(xì)菌通過自身的特征代謝活動(dòng)，參與植物的養(yǎng)分?jǐn)z取、生長發(fā)育、逆境抵御等過程，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中與植物以及其他微生物關(guān)系密切的有益微生物。此外，光合細(xì)菌還可通過誘導(dǎo)免疫反應(yīng)等方式維護(hù)植物與土壤的健康。作為一類代謝功能多樣、分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，且與植物生長密切相關(guān)的微生物，光合細(xì)菌將是新型多功能微生物肥料與微生物農(nóng)藥開發(fā)的重要菌種資源[5]。然而目前，我國利用微生物農(nóng)藥對植物病害進(jìn)行生物防治往往是以單一的生防因子為原料，導(dǎo)致了微生物農(nóng)藥的抗菌譜狹窄、綜合防效差、需菌量大、環(huán)境依賴性強(qiáng)，同時(shí)還存在產(chǎn)品保藏期短和菌種易退化等問題[1]。這對生防微生物農(nóng)藥的研發(fā)和改良提出了新的要求。

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為微生物菌種的改良提供了契機(jī)。其中原生質(zhì)體融合是通過人工方法將來源于不同遺傳類型親本的原生質(zhì)體去除細(xì)胞壁，實(shí)現(xiàn)不同基因組的交換、重組，期望得到結(jié)合雙親基因型或產(chǎn)生新基因型的菌種。原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以克服自然不親和因子的障礙，不經(jīng)過有性生殖就可得到優(yōu)良品種[6]。近年來，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、疾病防治等各個(gè)領(lǐng)域，是進(jìn)行遺傳育種研究的一個(gè)重要手段，而且該技術(shù)在基因定位和基因調(diào)控等方面也具有重要的應(yīng)用價(jià)值，因此是生防微生物育種的重要手段[7]。該研究對沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選融合菌株，并進(jìn)行了融合菌株防治生姜根結(jié)線蟲的田間試驗(yàn)，以期探索通過原生質(zhì)體融合技術(shù)克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的可行性，同時(shí)為利用基因重組菌株防治植物病蟲害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）PSB-06和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）KY-1由實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。供試生姜為萊蕪地方品種；生姜線蟲防治試驗(yàn)在山東濟(jì)南市萊蕪區(qū)（117°46'80.47"E，36°36'82.43"N）進(jìn)行，供試土壤為黏性土壤，肥力中等，連續(xù)多年根結(jié)線蟲發(fā)病嚴(yán)重。

供試培養(yǎng)基：（1）LB液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10 g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（2）LB固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同LB液體培養(yǎng)基，另加細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂8 g/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（3）LB高滲培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同LB液體培養(yǎng)基，另加蔗糖0.5 mol/L[8]，高壓蒸汽滅菌15 min；（4）光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 0.5 g/L，CH3COONa 0.5 g/L，K2HPO4約1 g/L（根據(jù)實(shí)際情況將pH值調(diào)到7時(shí)的用量為準(zhǔn)），F(xiàn)eSO4 0.05 g/L，H3BO4 0.05 g/L，NaMoO4 0.05 g/L，酵母提取物1.5 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min；（5）光合細(xì)菌固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基，另加細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂13 g/L，高壓蒸汽滅菌30 min；（6）光合細(xì)菌高滲液體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基，另加蔗糖0.5 mol/L，高壓蒸汽滅菌15 min；（7）光合細(xì)菌軟瓊脂培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基，另加細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂8 g/L和蔗糖0.5mol/L，高壓蒸汽滅菌15 min后加滅活小牛血清200 ml/L。

主要試劑：（1）1 mol/L Tris-Cl（pH值7.8）：10.34 g Tris-HCl和4.17 g Tris-OH溶解在50 mL蒸餾水中；（2）溶液A：0.10 g MgCl2 和11.98 g蔗糖溶于25 mL雙蒸水中，加入500 μL 1 mol/L的Tris-Cl（pH值7.8），并將體積調(diào)節(jié)至50 mL；（3）溶液B：0.05 g MgCl2 和13.69 g蔗糖溶于25 mL雙蒸水中，加入500 μL 1 mol/L的Tris-Cl（pH值7.8），并將體積調(diào)節(jié)至50 mL；（4）0.8 mol/L 蔗糖溶液：將13.69 g蔗糖溶解在50 mL雙蒸水中；（5）EDTA（pH值 8.0）：將0.70 g EDTA-2Na溶解到15 mL ddH2O中，終濃度為372.20 g/mol；（6）SMM緩沖液（pH值6.5）：34.23 g蔗糖、0.46 g C4H4O4和0.38 g MgCl2溶解在100 mL雙蒸水中；（7）PEG緩沖液：SMM中包含40%（V/V）PEG6000，10 mmol/L CaCl2和5%（V/V） DMSO；（8）溶菌酶：將0.015 g溶菌酶溶解在3 mL雙蒸水中，終濃度為5 mg/mL；（1）～（7）號溶液過濾除菌，常溫保存，（8）號溶液過濾除菌，? ? ? ?－20℃保存。DnaseI（ThermoFisher），－20℃保存。

主要設(shè)備有BX51T-32F01光學(xué)顯微鏡（olympus）、Nikon-108電子顯微鏡（nikon）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 親株菌株的準(zhǔn)備 沼澤紅假單胞菌PSB-06的純培養(yǎng)物接種于光合細(xì)菌生長培養(yǎng)基中，厭氧光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500 lx，溫度32℃，培養(yǎng)至OD530為0.9～1.0；蘇云金芽孢桿菌KY-1的純培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)到OD600為0.9～1.0。

1.2.2 沼澤紅假單胞菌PSB-06原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體制備方法參考前人[9-11]的方法進(jìn)行相應(yīng)修改。取對數(shù)生長期的PSB-06純培養(yǎng)物按1∶10的比例稀釋到30 mL含有終濃度60 μg/mL的頭孢噻肟鈉光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.0 h，2 500? ?r/min 4℃離心4 min棄上清，回收菌體。輕輕加入1 mL 0.8 mol/L的蔗糖，孵育1 min，清洗菌體。棄上清液，操作過程中不要干擾到菌體。將150 ?L的1 mol/L Tris-Cl、120 ?L的5 mg/mL溶菌酶和120 ?L的0.125 mol/L EDTA依次加入到單細(xì)胞絲中，室溫孵育10 min。向上述溶液中慢慢加入1 mL溶液A，時(shí)間要超過1 min，同時(shí)用手輕輕旋轉(zhuǎn)溶液，室溫下孵育4 min。再緩慢加入7 mL 4℃的溶液B，2 500? r/min 4℃離心4 min。小心地除去所有上清，沉淀重懸于1 mL光合細(xì)菌高滲培養(yǎng)基中。在10×100倍油鏡下觀察樣品原生質(zhì)體的形成過程。將一定量菌體稀釋在蒸餾水中裂解原生質(zhì)體，然后在光合細(xì)菌固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋，統(tǒng)計(jì)未形成原生質(zhì)體的菌體產(chǎn)生的菌落，以此計(jì)算原生質(zhì)體的形成效率。

1.2.3 芽孢桿菌KY-1原生質(zhì)體的制備 將OD600≈1.0的芽孢桿菌菌懸浮液30 mL 5 000 r/min 4℃離心10 min，去上清。將菌體重懸在30 mL SMM緩沖液中，并加入終濃度1 mg/mL的溶菌酶，100 r/min，37℃震蕩培養(yǎng)1 h。5 000 r/min 4℃離心10 min，去上清，沉淀重懸于1 mL LB高滲培養(yǎng)基中。在10×100倍油鏡下觀察原生質(zhì)體的形成過程。將一定量菌體稀釋在蒸餾水中裂解原生質(zhì)體，然后在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)稀釋，統(tǒng)計(jì)未形成原生質(zhì)體的菌體產(chǎn)生的菌落，以此計(jì)算原生質(zhì)體的形成效率。

1.2.4 原生質(zhì)體的融合和再生 分別取0.5 mL制備成功的PSB-06和KY-1原生質(zhì)體，混合后加入1 U的DNaseI來消解因菌體裂解而釋放的DNA，從而防止在原生質(zhì)體形成過程中因吸收裂解菌體釋放的DNA而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化。將上述混合液在25℃下孵育10 min，3 500 r/min 4℃離心20 min，重懸在0.5 mL PEG緩沖液中。繼續(xù)在25℃下孵育5～20 min后，加入1 mL SMM緩沖液，3 500 r/min 4℃離心20 min。融合完成后，立即加入5倍體積的SMM緩沖液稀釋、離心、洗滌菌體2次。將菌體重懸在光合細(xì)菌高滲液體培養(yǎng)基中，梯度稀釋后涂布于光合細(xì)菌軟瓊脂培養(yǎng)基上再生。克隆菌體的16S rDNA，測序，以鑒定出融合子，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.5 融合菌株防治生姜根結(jié)線蟲的田間試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為：處理1，分別在2020年4月18日（發(fā)芽期）、7月11日（苗期）、9月8日（旺盛期）進(jìn)行融合菌株（5 kg/667 m2）灌根處理；處理2：分別在2020年4月18日（發(fā)芽期）、7月11日（苗期）、9月8日（旺盛期）進(jìn)行親株P(guān)SB-06（5 kg/667m2）灌根處理；處理3：2019年11月25日至2020年3月3日進(jìn)行土壤棉隆熏蒸處理，熏蒸液用量為20 kg/667m2；處理4：空白對照，未進(jìn)行任何消毒處理。每個(gè)處理5次重復(fù)，小區(qū)面積16 m×0.7 m，隨機(jī)區(qū)組排列。采用旋耕整地，生姜種植間距為18～20 cm。每個(gè)處理設(shè)3條保護(hù)線以維持環(huán)境條件的一致性。土壤樣品收集、各處理的根結(jié)線蟲防效、生姜生長指標(biāo)和葉片生理活性指標(biāo)測定、土壤微生物多樣性及其理化性質(zhì)分析等均參照Wang等[12]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel、SPSS13.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合菌株的獲得

在油鏡下觀察了融合過程，并記錄了原生質(zhì)體制備各階段的形態(tài)變化，如圖1所示，對親本菌株進(jìn)行處理后，在10×100倍油鏡下觀察到沼澤紅假單胞菌PSB-06和蘇云金芽孢桿菌KY-1酶解前的形態(tài)（圖1A和C）和外壁剝離后形成的由細(xì)胞膜包裹的原生質(zhì)體形態(tài)（圖1B和D）。視野中大部分菌體的原生質(zhì)體由于剝離細(xì)胞壁后失去細(xì)胞剛性，形成由內(nèi)膜包裹的油煎蛋狀。與酶解前相比幾乎無帶壁菌體的存在，且制備的原生質(zhì)體數(shù)目充足。圖2顯示了2個(gè)原生質(zhì)體融合后形成融合菌株的形態(tài)。同時(shí)，在掃描電鏡下觀察了沼澤紅假單胞菌PSB-06菌體原生質(zhì)體的形成過程如圖3所示，圖3A所示為沼澤紅假單胞菌PSB-06的菌體形態(tài)，而頭孢噻肟鈉和溶菌酶處理后視野中的菌體外膜已經(jīng)從菌體部分剝離（圖3B）或者不可見，進(jìn)而形成原生質(zhì)體（圖3C）。

2.2 融合菌株對生姜根結(jié)線蟲的防治效果

如圖4A所示，發(fā)芽期各處理土壤樣品中根結(jié)線蟲數(shù)量均較低，但各處理間無顯著差異（P＞0.05）。從苗期到收獲期根結(jié)線蟲蟲口數(shù)量逐漸增加，旺盛生長期根結(jié)線蟲數(shù)量顯著增加。每100 g土壤中，苗期融合菌株處理的根結(jié)線蟲平均蟲口數(shù)為0.60條，PSB-06處理為0.80條，隆棉消毒處理的為0.40條，3個(gè)處理的根結(jié)線蟲數(shù)量均低于空白對照的2.20條，且差異顯著（P＜0.05）。旺盛生長期和收獲期，融合菌株處理的根結(jié)線蟲平均蟲口數(shù)分別為8.20和8.40條，均顯著低于空白對照（P＜0.05），且旺盛生長期融合菌株處理的根結(jié)線蟲平均蟲口數(shù)顯著低于PSB-06處理和隆棉消毒處理（P＜0.05）。

如圖4B所示，收獲期融合菌株處理的根結(jié)線蟲病情指數(shù)為10，顯著低于空白對照（P＜0.05）。融合菌株處理對根結(jié)線蟲的防效達(dá)73.68 %，顯著優(yōu)于親本菌株P(guān)SB-06處理的47.37 %和隆棉消毒處理的52.36 % （P＜0.05）；且與空白對照相比，生防菌株P(guān)SB-06和隆棉消毒處理都能顯著降低生姜根結(jié)線蟲的病情指數(shù)，減輕根結(jié)線蟲對生姜的危害，且防效持續(xù)性較好。

2.3 融合菌株對生姜生長指標(biāo)的影響

如表1所示，與空白對照相比，收獲期各處理對生姜的株高、分蘗數(shù)、主莖粗、主莖葉數(shù)、單株姜球數(shù)、姜球?qū)挾群蛦沃戤a(chǎn)量均具有一定的促進(jìn)作用，其中以融合菌株處理的效果最好，生姜株高達(dá)110.60 cm、分蘗數(shù)為11.10個(gè)、主莖粗達(dá)5.39 cm，均顯著高于對照的（P＜0.05），但各處理對主莖葉數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。與空白對照相比，融合菌株處理顯著提高了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)，融合菌株處理單株姜球數(shù)達(dá)13.80個(gè)、姜球?qū)挾冗_(dá)33.47 cm，單株產(chǎn)量達(dá)1.29 kg，均顯著優(yōu)于空白對照處理 （P＜0.05）。

2.4 融合菌株對生姜葉片的總?cè)~綠素含量和抗脅迫能力的影響

由圖5可知，融合菌株處理生姜葉片在苗期和收獲期的總?cè)~綠素含量分別為2.04和1.91 mg/g，均顯著高于空白對照的1.45和1.13 mg/g（P＜0.05），旺盛生長期各處理生姜葉片的總?cè)~綠素含量差異不顯著。收獲期融合菌株處理的生姜葉片總?cè)~綠素含量顯著高于親本菌株P(guān)SB-06處理和隆棉消毒處理 （P＜0.05）。

由圖6可知，苗期和旺盛生長期，各處理生姜葉片的POD活性無顯著差異（P＞0.05），收獲期融合菌株處理的生姜葉片POD活性為16.10 U/g，顯著高于其他處理（圖6A）；SOD活性方面，旺盛生長期各處理葉片中SOD活性差異不顯著，苗期和收獲期融合菌株處理生姜葉片SOD活性分別為100.37、116.59 U/g，均顯著高于空白對照（P＜0.05）（圖6B）。

3 討 論

微生物原生質(zhì)體融合育種技術(shù)為跨界融合理論提供了現(xiàn)實(shí)依據(jù)，在得到雜種細(xì)胞的同時(shí)保持了親本遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定傳遞[13]。但原生質(zhì)體融合技術(shù)作為品系改良策略仍有一個(gè)缺點(diǎn)，就是許多雜交菌株

有絲分裂不穩(wěn)定，染色體丟失（導(dǎo)致非整倍體）或分離到親本品系的情況經(jīng)常發(fā)生[6]。同樣，實(shí)驗(yàn)室中的融合菌株在傳代培養(yǎng)時(shí)也會(huì)發(fā)生一方親本遺傳物質(zhì)丟失的情況，這有待進(jìn)一步的研究和改良。

沼澤紅假單胞菌PSB-06原生質(zhì)體的制備在實(shí)驗(yàn)室原有方法的基礎(chǔ)上做了相應(yīng)改進(jìn)，形成了“混合酶破壁加化學(xué)誘導(dǎo)法”去除菌體細(xì)胞壁。頭孢噻肟鈉通過抑制轉(zhuǎn)肽酶的合成初步抑制菌體細(xì)胞壁的合成以形成單細(xì)胞絲，然后EDTA處理以除去部分外壁，最后用溶菌酶消化暴露的肽聚糖。原生質(zhì)體融合和再生試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)雖然沼澤紅假單胞菌和蘇云金芽孢桿菌的最適生長溫度均不是25～28℃，但融合子在25～28℃下的再生率略高于30℃（沼澤紅假單胞菌PSB-06的最適生長溫度）時(shí)的再生率；同時(shí)，融合子混合于融化的45℃軟瓊脂培養(yǎng)基時(shí)的再生率低于直接將融合子涂布于含0.5 mol/L蔗糖的軟瓊脂培養(yǎng)基時(shí)的再生率，且含有部分外壁的原生質(zhì)體再生率較高，因此原生質(zhì)體融合時(shí)不需要去掉全部細(xì)胞壁來達(dá)到融合的目的。

融合菌株防治生姜根結(jié)線蟲的試驗(yàn)結(jié)果表明，融合菌株對生姜根結(jié)線蟲有較好的防治效果。在生姜發(fā)芽期和苗期，土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量較少，在旺盛生長期和收獲期顯著增加。很有可能是生姜生長早期氣溫過低，根結(jié)線蟲的繁殖速度慢所致。后期隨著環(huán)境溫度的升高，根結(jié)線蟲種群規(guī)模迅速增加。與空白對照相比，融合菌株對根結(jié)線蟲的防治效果可一直持續(xù)到收獲期，且融合菌株對根結(jié)線蟲的防治效果優(yōu)于親本菌株P(guān)SB-06（融合菌株與另一親本蘇云金芽孢桿菌KY-1抗脅迫能力的比較尚在試驗(yàn)中）。從生姜收獲期的生長指標(biāo)來看，融合菌株顯著提高了生姜地上部分的農(nóng)藝性狀及生姜的品質(zhì)和產(chǎn)量，而且融合菌株提高了苗期和收獲期生姜葉片的葉綠素含量，筆者推測，融合菌株很有可能通過提高葉綠素的含量來增強(qiáng)生姜植株的光合作用，從而提高生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)，且前人的研究也顯示親本菌株P(guān)SB-06具有促進(jìn)植物生長的作用[14-15]。從生姜葉片的抗氧化活性來看，在生長發(fā)育早期各處理生姜葉片的POD活性差異不顯著，收獲期融合菌株處理生姜葉片的POD活性顯著高于空白對照；融合菌株處理在苗期和收獲期顯著提高了生姜葉片的SOD活性，且在收獲期SOD活性顯著高于親本菌株P(guān)SB-06處理。已有報(bào)道顯示，在脅迫條件下或植物生長后期，POD和SOD活性均有所升高[16]。這表明融合菌株處理增強(qiáng)了生姜的耐脅迫能力，也預(yù)示著微生物原生質(zhì)體融合菌株在防治植物病蟲害、提高植物抗脅迫能力等方面具有一定的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 康業(yè)斌，丁玥琪，陳奇園，等. 生防微生物及其在煙草病害防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展[A]. 河南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)，河南省昆蟲學(xué)會(huì)，河南省植物病理學(xué)會(huì). 河南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)第十一次、河南省昆蟲學(xué)會(huì)第十次、河南省植物病理學(xué)會(huì)第五次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C]. 許昌：河南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)，河南省昆蟲學(xué)會(huì)，河南省植物病理學(xué)會(huì)，2017.

[2] 張 慧，許 寧，曹麗茹，等. 我國微生物農(nóng)藥的研發(fā)與應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2023，25（4）：769-778.

[3] 陳中義，張 杰，黃大昉. 植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（2）：97-103.

[4] ELLIOTT M L，DES JARDIN E A，JR BATSON W E，et al. Viability and stability of biological control agents on cotton and snap bean seeds[J]. Pest Management Science，2001，57（8）：695-706.

[5] 蘇 品，張德詠，張 卓，等. 光合細(xì)菌的農(nóng)用微生物功能解讀[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（1）：30-37.

[6] LI N，LU J，WANG Z R，et al. Improving the regeneration rate of deep lethal mutant protoplasts by fusion to promote efficient L-lysine fermentation[J]. BMC Biotechnology，2023，23（1）：22：1-11.

[7] 王佳蕊，魏 煒. 微生物原生質(zhì)體融合育種技術(shù)及其應(yīng)用與展望[J]. 建筑與預(yù)算，2017（10）：31-34.

[8] 黃勤妮，劉 佳，宋秀珍，等. 大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的原生質(zhì)體融合[J]. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，23（1）：55-59，90.

[9] 劉 勇，張德詠，譚新球，等. 5種光合細(xì)菌種間原生質(zhì)體融合及優(yōu)良農(nóng)用融合子的篩選鑒定[J]. 生命科學(xué)研究，2004，8（4）：344-350.

[10] FIGUEROA D M，WADE H M，MONTALES K P，et al. Production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization[J]. Journal of Visualized Experiments，2018（138）：e57904.

[11] DAI M H，ZIESMAN S，COPLEY S D. Visualization of protoplast fusion and quantitation of recombination in fused protoplasts of auxotrophic strains of Escherichia coli[J]. Metabolic Engineering，2005，7（1）：45-52.

[12] WANG D W，WANG J，SU P，et al. Effects of dazomet combined with Rhodopsesudomonas palustris PSB-06 on root-knot nematode，Meloidogyne incognita infecting ginger and soil microorganisms diversity[J]. Frontiers in Microbiology，2022，13：1021445.

[13] OGAWA K，YOSHIDA N，GESNARA W，et al. Hybridization and breeding of the benomyl resistant mutant，Trichoderma harziantum antagonized to phytopathogenic fungi by protoplast fusion[J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2000，64（4）：833-836.

[14] LUO L Y，WANG P，ZHAI Z Y，et al. The effects of Rhodopseudomonas palustris PSB06 and CGA009 with different agricultural applications on rice growth and rhizosphere bacterial communities[J]. AMB Express，2019，9（1）：173-183.

[15] ZHAI Z Y，CHEN A，ZHOU H M，et al. Structural characterization and functional activity of an exopolysaccharide secreted by Rhodopseudomonas palustris GJ-22[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2021，167：160-168.

[16] MYOUGA F，HOSODA C，UMEZAWA T，et al. A hetero complex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，2008，20（11）：3148-3162.

（責(zé)任編輯：成 平）