唐大為 羅凱文 張夢(mèng)曉 劉浩

摘 要：研究以紅瑪瑙、白玉籽2個(gè)石榴品種為材料，采用高效液相色譜法（HPLC）和福林酚法分別測(cè)定了石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量，并采用ABTS快速法和FRAP法綜合評(píng)價(jià)了2種石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的營養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用潛力，同時(shí)為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供參考。結(jié)果表明：在試驗(yàn)條件下，沒食子酸在3.125～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，紅瑪瑙和白玉籽石榴汁中沒食子酸的含量分別為7.49和24.56 μg/mL；總多酚含量在0～1 000 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，紅瑪瑙和白玉籽石榴汁中總多酚的含量分別為287.6 和737.6 μg/mL；當(dāng)總多酚含量為0～200 μg/mL時(shí)，2種石榴汁的總抗氧化能力均隨著總多酚濃度的增加而增強(qiáng)；白玉籽石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量均高于紅瑪瑙石榴汁，故其總抗氧化能力也強(qiáng)于紅瑪瑙石榴汁。

關(guān)鍵詞：石榴；沒食子酸；高效液相色譜法；總多酚；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2023）10-0074-05

Determination of Gallic Acid Content in Fruit Juice of Different Pomegranate Varieties and Comparison of Their Antioxidant Capacity

TANG Da-wei， LUO Kai-wen， ZHANG Meng-xiao， LIU Hao

（School of Pharmacy， Bengbu Medical College， Anhui Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceutical， Bengbu 233000， PRC）

Abstract：This paper aims to further explore the nutritional value and application potential of pomegranate （Punica granatum）， and provide reference for screening quality varieties. Using two pomegranate varieties 'Red Agate' （Hongmanao） and 'White Nephrite Bead' （Baiyuzi） as materials， gallic acid and total polyphenol contents in fruit juice were determined by the high performance liquid chromatography （HPLC） and Folin-Ciocalteu method. The antioxidant capacity of fruit juice was assayed by the ABTS method and FRAP method. Results showed that the gallic acid content showed a good linear relationship between 3.125-50 μg/mL under experiment conditions， reaching 7.49 μg/mL in 'Red Agate' and 24.56 μg/mL in 'White Nephrite Bead'. The total polyphenols showed a good linear relationship between 0-1 000 μg/mL， reaching 287.6 μg/mL in 'Red Agate' and 737.6 μg/ml in 'White Nephrite Bead'. In the range of 0-200 μg/mL of total polyphenols contents， the total antioxidant capacity of the two pomegranate juices increased with the increase of total polyphenols concentration. 'White Nephrite Bead' pomegranate juice were higher than 'Red Agate' in the contents of gallic acid and total polyphenols， so had a stronger antioxidant capacity.

Key words：pomegranate （Punica granatum）; gallic acid; high performance liquid chromatography; total polyphenols; antioxidation activity

收稿日期：2023–05–05

基金項(xiàng)目：安徽省優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2022AH010084）；安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人選科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2019）；蚌埠市聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（BYLK201801）；安徽省生化工程中心科研平臺(tái)開放課題（2023SYKFD06）

作者簡介：唐大為（2001—），男，安徽蕪湖市人，本科生，藥學(xué)專業(yè)。

通信作者：劉 浩

石榴（Punica granatum L.）為千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）的落葉灌木或小喬木，別名安石榴、山力葉等。在我國，石榴具有悠久的栽培歷史，且具有產(chǎn)量充足、品種豐富等優(yōu)點(diǎn)。懷遠(yuǎn)石榴為安徽省懷遠(yuǎn)縣特產(chǎn)，同時(shí)也是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，其中以紅瑪瑙、白玉籽2種石榴品種為典型代表。

石榴汁富含可溶性多酚，具有顯著的抗高血壓作用[1]。與此同時(shí)，日常飲用石榴汁可以起到對(duì)心血管的保護(hù)作用，降低冠心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[2]。石榴多酚提取物作為一種天然的抗氧化劑和抑菌劑，具有抗氧化作用強(qiáng)、抑菌時(shí)間長、不易引起耐藥性等特征，可充分應(yīng)用于改善氧化應(yīng)激狀態(tài)和細(xì)菌感染類疾病的輔助治療[3]。研究表明，石榴多酚除具備抗氧化、抑菌的功效之外，還在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病以及抗腫瘤、抗病毒等領(lǐng)域有著積極的作用[4]。

目前，常用的多酚類化合物檢測(cè)方法為福林酚法[5]，該方法可有效檢測(cè)石榴汁提取物中總多酚的含量，且該方法兼具操作簡便、準(zhǔn)確性好、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)。沒食子酸是石榴提取物中多酚類化合物的主要成分之一，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抑菌[8]、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]等功效。采用高效液相色譜法（HPLC）可將沒食子酸與其他多酚類成分進(jìn)行有效分離，從而確定石榴汁中沒食子酸的含量。

石榴汁的抗氧化活性可通過總抗氧化能力來評(píng)價(jià)[10]，常采用ABTS快速法[11]和FRAP法[12]綜合測(cè)定石榴汁的總抗氧化能力，這2種方法分別以Trolox和FeSO4為陽性對(duì)照[13-15]，其結(jié)果具有一定的客觀性?？偠喾訛槭裰衅鹬饕寡趸饔玫某煞郑瑳]食子酸則為總多酚中最能代表抗氧化活性的成分。因此，該研究以紅瑪瑙和白玉籽2個(gè)石榴品種為材料，測(cè)定了石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量，并采用ABTS快速法[11]和FRAP法綜合評(píng)價(jià)了2種石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的營養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用潛力，同時(shí)為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試石榴品種為安徽懷遠(yuǎn)紅瑪瑙、白玉籽石榴，均購自安徽省蚌埠市水果批發(fā)市場。主要試劑有沒食子酸對(duì)照品（純度≥98%）；甲醇、三氟乙酸（TFA）作為流動(dòng)相為色譜純；乙酸乙酯、福林酚、Na2CO3等其余試劑均為分析純；所用水為超純水；另外還有碧云天總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS快速法和FRAP法）。

主要儀器設(shè)備有萬分之一電子天平、LNG-96型真空離心濃縮儀、LC-16型島津高效液相色譜儀、UV-2700型紫外分光光度計(jì)、M22R-MB-8型低溫冷凍離心機(jī)、Synergy-HT型酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸含量的測(cè)定 （1）色譜條件。色譜柱為 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35℃；流動(dòng)相采用二元體系，A為甲醇，B為TFA（0.1%），梯度洗脫條件[16]：0～10 min，B 98%～87%； 10 ～15 min，B 87% ；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；沒食子酸檢測(cè)波長 為254 nm[17]。（2）對(duì)照品溶液制備。精密稱定10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解定容制得1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。采用等比稀釋法，依次制成濃度為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的系列對(duì)照品溶液備用。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。以系列對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）供試品溶液制備及測(cè)定。 新鮮石榴去皮剝籽，將種粒與果肉分離，手動(dòng)榨汁并收集，5 000 r/min離心5 min沉淀懸浮物；取上清液2 mL于離心管中，再次以8 000 r/min離心，取上層石榴汁0.5 mL轉(zhuǎn)移至新的離心管中；用0.5 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮蒸干后，加入0.5 mL的甲醇復(fù)溶，12 500 r/min離心5 min，取上層液在254 nm下測(cè)定沒食子酸含量。每種石榴隨機(jī)選取6個(gè)樣品按上述方法制備供試品溶液，采用外標(biāo)法對(duì)供試品中的沒食子酸進(jìn)行定量，分別計(jì)算2種石榴中沒食子酸含量的平均值。

1.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 （1）精密度試驗(yàn)。 隨機(jī)選取一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量均為10 μL，測(cè)定沒食子酸的峰面積。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。隨機(jī)選取一供試品溶液，分別在制備完成0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量均為10 μL，測(cè)定沒食子酸的峰面積。（3）重復(fù)性試驗(yàn)。采用供試品溶液的制備方法，另外制備6個(gè)樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)，色譜條件相同，每次進(jìn)樣量均為10 μL，測(cè)定沒食子酸的峰面積。（4）加標(biāo)回收率。選取9份已知沒食子酸含量的1 mL供試品，分成3組（3份為一組），分別加入濃度為原樣品中沒食子酸含量50%、100%、150%的對(duì)照品溶液1 mL [18]，按照1.2.1種的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.3 總多酚含量測(cè)定 參考Tarantino等[19]的方法，采用福林酚法測(cè)定石榴汁中總多酚含量。取250 μL果汁，加入19.5 mL雙蒸水和1.25 mL福林酚試劑中；3 min后，加入3.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的Na2CO3溶液，室溫下避光反應(yīng)2 h；使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液在760 nm處的吸光度；以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.2.4 總抗氧化能力評(píng)價(jià) （1）ABTS快速法。 2種石榴分別隨機(jī)選取6個(gè)樣品，按照1.2.3中的方法測(cè)定各石榴汁樣品的總多酚含量，根據(jù)測(cè)得的總多酚含量分別將樣品中的總多酚含量用蒸餾水分別稀釋成20、40、60、80、160、200 μg/mL，按ABTS快速法使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在405 nm下的吸光度，石榴汁的總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需的Trolox溶液的毫摩爾數(shù)表示。以ΔA405（即A405空白對(duì)照－A405標(biāo)準(zhǔn)品）為縱坐標(biāo)，不同濃度的Trolox溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各樣品的ΔA405計(jì)算其總抗氧化能力，結(jié)果取平均值。（2）FRAP法。2種石榴分別隨機(jī)選取6個(gè)樣品，按照1.2.3中的方法測(cè)得各石榴汁樣品的總多酚含量，根據(jù)測(cè)得的總多酚含量分別將樣品中的總多酚含量用蒸餾水分別稀釋成10、20、40、60、80、100 μg/mL，按FRAP法使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在593 nm下的吸光度，石榴汁的總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4溶液的毫摩爾數(shù)表示。以吸光度為縱坐標(biāo)，不同濃度的FeSO4溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入各樣品的A593計(jì)算總抗氧化能力，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=18 075x－25 601，R2=0.999 4，在3.125～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，6次測(cè)定的峰面積RSD為1.32%，表明該方法精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品放置0～15 h后測(cè)得的峰面積RSD為2.48%，表明供試品溶液在配置15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)樣品平行測(cè)定后峰面積RSD為1.05%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，樣品在加標(biāo)量為50%、100%、150%時(shí)的回收率RSD分別為2.87%、1.81%、1.79%，表明在不同濃度水平下，該方法的加標(biāo)回收率是合格的。綜上所述，各項(xiàng)方法學(xué)的考察結(jié)果均符合要求，表明該方法可用于測(cè)定石榴汁中沒食子酸的含量。

2.2 2種石榴中沒食子酸含量的測(cè)定結(jié)果

按照1.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品及樣品的色譜圖如圖1所示，沒食子酸與其他共存峰得到較好的分離。經(jīng)測(cè)定，紅瑪瑙石榴汁中沒食子酸的含量為7.49 μg/mL，白玉籽石榴汁中沒食子酸含量為24.56 μg/mL（表2）。

2.3 總多酚含量測(cè)定結(jié)果

按照1.2.3的方法測(cè)定石榴汁中的總多酚含量，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.000 5x－0.010 8，R2=0.997 9，在0～1 000 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)測(cè)定，紅瑪瑙石榴汁中總多酚含量為287.6 μg/mL，白玉籽石榴汁中總多酚含量為737.6 μg/mL（表2）。

2.4 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

2.4.1 ABTS快速法 采用ABTS快速法測(cè)定石榴汁的總抗氧化能力，如圖2所示，在0～200 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著總多酚濃度的增加，2種石榴汁的總抗氧化能力均增強(qiáng)，石榴汁的總抗氧化能力與總多酚的濃度具有明顯的相關(guān)性，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力略強(qiáng)于紅瑪瑙石榴汁。

2.4.2 FRAP法 采用FRAP法測(cè)定石榴汁的總抗氧化能力，結(jié)果如圖3所示，在0～100 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著總多酚濃度的增加，2種石榴汁的總抗氧化能力均增強(qiáng)，石榴汁的總抗氧化能力與總多酚的濃度具有明顯的相關(guān)性，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力略強(qiáng)于紅瑪瑙石榴汁。

3 討論與結(jié)論

研究測(cè)定了紅瑪瑙和白玉籽2個(gè)石榴品種的沒食子酸、總多酚含量，結(jié)果表明，白玉籽石榴汁中沒食子酸的平均含量高于紅瑪瑙，約為紅瑪瑙石榴汁中沒食子酸含量的3.3倍。同時(shí)，白玉籽石榴汁中總多酚含量也高于紅瑪瑙，約是紅瑪瑙石榴汁中總多酚含量的2.6倍。采用ABTS快速法和FRAP測(cè)定石榴汁的總抗氧化能力，結(jié)果表明，在總多酚濃度相同的情況下，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力

略強(qiáng)于紅瑪瑙，且在總多酚含量0～200 μg/mL的范圍內(nèi)，2種石榴汁的總抗氧化能力與其總多酚含量呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。由此推測(cè)，石榴汁的抗氧化活性與其沒食子酸及總多酚的含量密切相關(guān)，白玉籽石榴汁的沒食子酸與總多酚含量均高于紅瑪瑙，其抗氧化活性與紅瑪瑙石榴汁相比也更強(qiáng)。

石榴是一種常見水果，石榴汁提取物兼具食用價(jià)值與藥用價(jià)值[20-22]。研究采取石榴汁中的沒食子酸這一成分作為切入點(diǎn)，重點(diǎn)討論石榴汁的抗氧化活性。通過對(duì)有效成分含量的測(cè)定以及體外抗氧化能力的綜合比較，更加充分、深入地了解了石榴的營養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)應(yīng)用潛力，為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：成 平）