黃 勇,楊曉彬,林 穎,韋躍偉,陳錦淳,翁玉萍

(康美藥業(yè)股份有限公司,廣東 普寧 515300)

蛤殼是一種傳統(tǒng)海洋中藥,來(lái)源于簾蛤科動(dòng)物文蛤MeretrixmeretrixLinnaeus或青蛤CyclinasinensisGmelin的貝殼,其藥用歷史已有2 000余年,具有“清熱化痰,軟堅(jiān)散結(jié),制酸止痛;外用收濕斂瘡”之功效,用于痰火咳嗽,胸脅疼痛,痰中帶血,瘰疬癭瘤,胃痛吞酸;亦可用于治療咳喘[1-2]?，F(xiàn)代研究表明,蛤殼中含有多種無(wú)機(jī)元素和氨基酸,具降糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等作用[3-5]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版以含碳酸鈣(CaCO3)的含量作為蛤殼的質(zhì)量控制指標(biāo),并對(duì)5種重金屬及有害元素(Pb、Cd、Hg、Cu、As)的含量進(jìn)行了限量要求[1]。目前,蛤殼研究主要集中于炮制前后[6-7],未見(jiàn)對(duì)兩種不同基原蛤殼的比較研究。為此,本研究以不同基原蛤殼(文蛤、青蛤)為研究對(duì)象,采用滴定法測(cè)定并比較其碳酸鈣含量,建立ICP-MS法測(cè)定并比較兩種基原蛤殼5種重金屬及有害元素(Pb、Cd、As、Hg、Cu)的含量,以期為蛤殼的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器及試劑

XPE205型電子天平(d=0.01mg)(METTLER TOLEDO公司),ariummini超純水儀(Sartoriusstedim公司),WSZ-200A回旋振蕩器、DHG-9245A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),ETHOS UP微波消解儀(MILESTONE公司),ICP-MS 7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent technologies公司),SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

1.2 樣品

22份蛤殼收集自廣東,由康美藥業(yè)質(zhì)量管理部劉茂貴主任藥師鑒定為簾蛤科動(dòng)物文蛤MeretrixmeretrixLinnaeus或青蛤CyclinasinensisGmelin的貝殼,其樣品信息如表1所示。

表1 22份蛤殼樣品碳酸鈣和五種重金屬元素含量的樣品信息

2 方法

2.1 蛤殼CaCO3含量測(cè)定方法

2.1.1 乙二胺四醋酸二鈉滴定液標(biāo)定[8](1)初標(biāo):精密稱定0.12g基準(zhǔn)氧化鋅3份進(jìn)行標(biāo)定,結(jié)果見(jiàn)表2。乙二胺四醋酸二鈉滴定液的濃度平均值為0.050 864mol/L,相對(duì)平均偏差0.03%,<0.1%,說(shuō)明初標(biāo)結(jié)果準(zhǔn)確。初標(biāo)F值為1.017 3。

表2 乙二胺四醋酸二鈉滴定液初標(biāo)結(jié)果

(2)復(fù)標(biāo):將基準(zhǔn)氧化鋅置于約800℃灼燒至恒重,精密稱定0.12g,平行3份進(jìn)行標(biāo)定,結(jié)果見(jiàn)表3。乙二胺四醋酸二鈉滴定液平均值為0.050 896mol/L,相對(duì)平均偏差0.06%,<0.1%,說(shuō)明復(fù)標(biāo)結(jié)果準(zhǔn)確。復(fù)標(biāo)F值為1.017 9。

表3 乙二胺四醋酸二鈉滴定液復(fù)標(biāo)結(jié)果

(3)乙二胺四醋酸二鈉滴定液的濃度:初標(biāo)與復(fù)標(biāo)F值的平均值的相對(duì)偏差為0.031 82%,最終確定F值為1.018,滴定液的最終濃度為0.050 88mol/L。

2.1.2 樣品處理 取本品細(xì)粉約0.12g,精密稱定,置錐形瓶中,加稀鹽酸3mL,加熱至微沸使溶解,加水100mL與甲基紅指示液(0.000 5g/mL)1滴,滴加氫氧化鉀溶液至溶液顯黃色。

2.1.3 樣品的測(cè)定及計(jì)算 (1)碳酸鈣含量測(cè)定:用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色。每1mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于5.004mg的碳酸鈣(CaCO3)。

2.2 5種重金屬元素含量測(cè)定方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 將鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用硝酸(10%)分別配制含鉛、砷、鎘、汞、銅為1.0、0.5、1.0、1.0、10μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液,再稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。即含鉛、砷0、1.0、5.0、10.0、20.0ng·mL-1,鎘0、0.5、2.5、5.0、10.0ng·mL-1,銅0、50.0、100.0、200.0、500ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。另精密量取汞標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量,用硝酸(10%)稀釋成分別為0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0ng·mL-1的溶液。取適量的內(nèi)標(biāo)物鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水配制成1μg·mL-1的混合溶液。

進(jìn)行專家訪談的目的是：檢驗(yàn)理論框架建構(gòu)的合理性，并且進(jìn)一步補(bǔ)充和完善，由此編制的量表具備“專家效度”[11]．書面訪談了中美相關(guān)領(lǐng)域的專家和實(shí)務(wù)工作者，參與研究的專家共有20人，其中7名中國(guó)數(shù)學(xué)教育領(lǐng)域?qū)＜遥?名中國(guó)職業(yè)教育領(lǐng)域?qū)＜?，兩名中?guó)高職院校數(shù)學(xué)教師，一名美國(guó)數(shù)學(xué)教育領(lǐng)域?qū)＜?，兩名美?guó)職業(yè)教育領(lǐng)域?qū)＜乙约皟擅绹?guó)社區(qū)學(xué)院數(shù)學(xué)教師．訪談提綱采用開(kāi)放式問(wèn)題的設(shè)計(jì)，旨在探究專家對(duì)高職院校數(shù)學(xué)教師所應(yīng)具備的核心知識(shí)、能力和品性的觀點(diǎn)，補(bǔ)充研究建立的假設(shè)性理論架構(gòu)的完整性．訪談提綱詳見(jiàn)附錄1．

2.2.2 儀器工作參數(shù) 本方法采用7700x型 ICP-MS儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn),條件與參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 ICP-MS主要操作參數(shù)

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備115In作為114Cd的內(nèi)標(biāo),72Ge作為63Cu、75As的內(nèi)標(biāo),209Bi作為202Hg、208Pb的內(nèi)標(biāo),所得各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸系數(shù)見(jiàn)表5。

表5 蛤殼ICP-MS測(cè)定5種重金屬及有害元素的方法學(xué)考察

2.2.4 供試品溶液制備 精密稱定0.5g粗粉樣品,置于耐壓耐高溫微波消解管中,緩緩加入硝酸5～10mL(觀察加入過(guò)程中硝酸與樣品的反應(yīng),如果反應(yīng)劇烈,需停止加入硝酸,放置至反應(yīng)停止后再加)。將消解管密閉并放至微波消解儀的支架上,按照表6的升溫程序進(jìn)行消解。消解程序結(jié)束后冷卻至60℃以下,取出消解管至通風(fēng)櫥放冷,后轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,用少量超純水洗滌3次,洗液合并于量瓶中,加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1μg/mL)200μL,用超純水稀釋至刻度,搖勻,即得。同法同時(shí)制備空白溶液,空白溶液不加金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表6 微波消解儀升溫程序

2.2.5 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗(yàn)。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,按“2.2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定Pb、Cd、Hg、Cu、As這5種元素的量。結(jié)果表明,這5種元素的RSD值<4%,見(jiàn)表5,表明儀器的精密度良好。

(2)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一份蛤殼樣品粉末6份,按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定Pb、Cd、Hg、Cu、As這 5 種元素的量。結(jié)果表明,這5種元素的RSD值<4%,見(jiàn)表5,表明方法的重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份蛤殼樣品供試液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別于制樣后 0、5、10、15、20、25、30、35h進(jìn)樣,測(cè)定Pb、Cd、Hg、Cu、As這5種元素的量。結(jié)果表明,這5種元素的RSD值<3%,見(jiàn)表5,表明在樣品制備后 35 h內(nèi)這5種重金屬元素的量穩(wěn)定。

(4)加樣回收率試驗(yàn)。取同一份蛤殼樣品粉末6份,精密稱定,分別精密加入與樣品中所測(cè)定元素含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品,按“2.2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算平均加樣回收率及其RSD值,所有元素的平均回收率和RSD值分別在90.98%～110.75%、1.15%～3.37%之間,基本符合要求。見(jiàn)表5。

2.2.6 樣品的測(cè)定 按照“2.2.4”項(xiàng)制備蛤殼樣品的供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定供試品溶液中 5 種重金屬及有害元素的含量。22份蛤殼樣品中5種重金屬及有害元素的含量見(jiàn)表 1。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種基原蛤殼CaCO3含量比較

15份文蛤CaCO3的含量為89.1%～96.9%,平均值為94.03%(n=15);7份青蛤CaCO3的含量為93.9%～97.2%,平均值為96.17%(n=7)。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版對(duì)蛤殼藥材中CaCO3含量的規(guī)定為不少于95.0%,文蛤有6份樣品不合格,青蛤有2份樣品不合格。以CaCO3的含量為指標(biāo),青蛤(平均值96.17%,n=7)>文蛤(平均值94.03%,n=15)。根據(jù)SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析軟件 ANOVA單因素方差分析的LSD多重比較的結(jié)果表明,兩種蛤殼CaCO3含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040<0.05),說(shuō)明兩種蛤殼CaCO3含量差異明顯。見(jiàn)表7。

表7 22份蛤殼樣品碳酸鈣和五種重金屬元素平均含量 (mg/kg)

3.2 兩種基原蛤殼5種重金屬元素含量比較

參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部重金屬及有害元素一致性限量指導(dǎo)值[8]：鉛元素不得多于5mg/kg、鎘元素不得多于0.3mg/kg、砷元素不得多于2mg/kg、汞元素不得多于0.2mg/kg、銅元素不得多于20mg/kg,22份蛤殼樣品中上述元素含量均符合規(guī)定,說(shuō)明蛤殼在重金屬及有害元素方面的安全性高。

15份文蛤樣品,Cd有3份樣品未檢出,As有2份樣品未檢出,Hg有14份樣品未檢出,Cu有1份樣品未檢出,5種重金屬及有害元素的平均含量見(jiàn)表7。

7份青蛤樣品,Cd有4份樣品未檢出,As有2份樣品未檢出,Hg 7份樣品均未檢出,5種重金屬及有害元素的平均含量見(jiàn)表7。

以Pb含量為指標(biāo),文蛤(平均值0.40mg/kg,n=15)>青蛤(平均值0.18mg/kg,n=7);以Cd含量為指標(biāo),文蛤(平均值0.04mg/kg,n=15)>青蛤(0.01mg/kg,n=7);以As含量為指標(biāo),文蛤(平均值0.06mg/kg,n=15)>青蛤(平均值0.03mg/kg,n=7);以Hg含量為指標(biāo),文蛤有1份樣品檢出,青蛤Hg均未檢出,兩者整體Hg含量均較低;以Cu含量為指標(biāo),青蛤(1.48mg/kg,n=7)>文蛤(平均值1.00mg/kg,n=15)。

根據(jù)SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件ANOVA單因素方差分析,LSD多重比較結(jié)果表明,文蛤與青蛤Pb(P=0.004<0.01)與Cd含量(P=0.005<0.01)比較,差異極顯著,說(shuō)明文蛤與青蛤Pb與Cd含量差異明顯。兩種蛤殼其余重金屬及有害元素含量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明兩種蛤殼Hg、Cu、As含量差異不明顯。見(jiàn)表8。

表8 重金屬元素ANOVA單因素方差分析

4 結(jié)論

本研究基于藥效(CaCO3含量)和重金屬及有害元素(Pb、Cd、As、Hg、Cu含量),比較分析兩種基原蛤殼(青蛤、文蛤)的有效性與安全性,兩種基原蛤殼CaCO3含量差異明顯,青蛤CaCO3含量高于文蛤。文蛤殼與青蛤殼Pb與Cd含量差異明顯,兩種蛤殼其余重金屬及有害元素含量之間差異不明顯。本研究可為蛤殼的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。